王志霞，羅 湘，王利江，劉 燕，郭 春，楊 洋，張志強

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是不可逆性氣流受限，具有多種表型的異質(zhì)性疾病[1]。氣道重塑與慢性氣道炎癥是支氣管哮喘的病理特征，哮喘是受環(huán)境影響的多基因遺傳疾病，基因與環(huán)境的相互作用研究有助于了解哮喘的發(fā)病機制。表觀遺傳是在不改變DNA序列基礎(chǔ)上的基因表達的遺傳變化，是聯(lián)系環(huán)境與基因的紐帶，它可以彌補遺傳背景和環(huán)境危險因素之間的差距，是研究哮喘發(fā)病機制的重要領(lǐng)域[2]。組蛋白去甲基化酶KDM2A是調(diào)節(jié)組蛋白甲基化重要的一個蛋白，在細胞增殖、凋亡、腫瘤及人工誘導多能干細胞技術(shù)等方面有重要作用[3]。目前KDM2A在支氣管哮喘中的研究較少，其是否參與哮喘氣道炎癥及氣道重塑過程尚不清楚。為更好地了解KDM2A在支氣管哮喘中的作用機制，通過觀察哮喘大鼠肺組織KDM2A蛋白表達的變化，探討KDM2A對氣道炎癥及氣道重塑的影響，以期為哮喘發(fā)病機制提供新的診療思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級雌性SD大鼠18只，6～8周齡，200～250 g，所有動物均在新鄉(xiāng)醫(yī)學院動物實驗中心SPF級動物設(shè)施中飼養(yǎng)，大鼠飼養(yǎng)于12 h白天12 h黑夜定時周期循環(huán)的屏障系統(tǒng)中，屏障系統(tǒng)維持19～23 ℃的溫度和(55±10)%濕度，食物和水供應充足。所有的實驗過程都獲得新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬動物倫理委員會的批準。

1.2 主要試劑和儀器氫氧化鋁凝膠、卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)購自于北京索萊寶公司；蘇木精、伊紅染色劑、多聚甲醛由新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院病理科饋贈；Masson染色試劑盒、PAS染色試劑盒購自北京索萊寶公司；α平滑肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、賴氨酸特異性的去甲基化酶 2A(lysine-specific demethylase 2A，KDM2A)一抗購自美國Abcam公司；β-actin、HRP標記的山羊抗鼠二抗購自于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；NE-C900型超聲霧化器購自歐姆龍醫(yī)療設(shè)備有限公司；電泳儀及半干轉(zhuǎn)膜儀購自美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1應用OVA致敏的方法建立支氣管哮喘大鼠模型 經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院動物倫理委員會審查同意后，選擇18只6～8周齡SPF級雌性大鼠，隨機分為三組：正常對照組、哮喘4周組、哮喘8周組，采用OVA制作哮喘模型[4]，SD大鼠在第1天和第7天腹腔注射0.2 ml含有OVA 0.2 mg和氫氧化鋁凝膠0.4 mg的磷酸鹽緩沖液(PBS)；于第15天開始每天霧化吸入5%OVA 30 min激發(fā)哮喘，正常對照組霧化吸入PBS代替致敏原致敏。

1.3.2大鼠肺組織病理學檢測

1.3.2.1 HE染色 取大鼠左肺組織，固定于4%多聚甲醛中，石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟(乙醇脫二甲苯分別為無水乙醇Ⅰ 10 min，無水乙醇Ⅱ 10 min，95%酒精 Ⅰ 10 min，95%酒精 Ⅱ 10 min，80%酒精5 min, 雙蒸水 1 min)，蘇木精染核2 min，1%鹽酸酒精分化1 s，流水返藍15 min，伊紅溶液浸泡30 s，流水沖洗后放入無水乙醇2 min，二甲苯5 min，中性樹脂封片。

1.3.2.2 PAS染色 將切片放入0.5%的高碘酸水溶液中氧化5 min，迅速用蒸餾水洗5 min后加入Schiff試劑染色30 min，接著用偏中亞硫酸鈉浸洗2次，用蒸餾水沖洗5 min，蘇木精染細胞核5 min，鹽酸酒精分化，充分水洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3.2.3 Masson染色 脫蠟同HE染色，蘇木精染核2 min, 1%鹽酸酒精分化1 s，流水返藍15 min，麗春紅-酸性品紅溶液浸泡15 min，1%冰醋酸15 s，流水15s ，1%磷鉬酸磷鎢酸溶液浸泡15 min后立即置入苯胺藍中15 min，超純水和1%冰醋酸1 s，充分水洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3.3肺組織病理圖片分析

1.3.3.1 炎癥細胞浸潤 采用半定量評分(0～4)評價支氣管周圍炎癥細胞浸潤情況，在顯微鏡下選擇長徑與短徑之比≥0.6的完整氣道，氣道炎癥評分：0分，無炎癥細胞浸潤；1分，少量炎癥細胞浸潤；2分，1層炎癥細胞圍繞氣道；3分，2～4層炎癥細胞圍繞氣道；4分，4層以上炎癥細胞圍繞氣道。

1.3.3.2 氣道黏液評分 PAS染色觀察氣道黏膜杯狀細胞增生及氣道黏液分泌情況，以PAS陽性的杯狀細胞數(shù)占整個氣道上皮細胞的百分比表示，評分標準：0分，<5%；1分，5%～25%；2分，25%～50%；3分，50%～75%；4分，>75%。

1.3.3.3 肺組織膠原纖維的沉積 顯微鏡觀察肺組織Masson染色，通過Image-Pro Plus 6.0軟件計算藍色纖維化面積及氣道面積，將它們的百分比作為評定肺組織中膠原纖維的沉積程度。

1.3.4熒光免疫組織化學法 大鼠肺組織蠟塊切片常規(guī)脫蠟，在加入檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)高壓鍋中修復抗原5 min；0.3%Triton-X 100室溫下孵育15 min，PBS洗3次，每次5 min；配制封閉液(二抗來源的血清50 μl+10%BSA 100 μl +PBS 850 μl)，室溫下封閉1 h；滴加一抗， 4 ℃冰箱過夜；次日恢復至室溫30 min后，PBS洗3次，每次5 min；生物素處理的二抗避光孵育1 h；PBS洗3次，每次5 min；DAPI染核5 min，PBS洗3次，每次5 min；防熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3.5Western blot法檢測蛋白表達 收集三組相同部位的肺組織，加入蛋白酶抑制的細胞裂解液提取總蛋白；BCA試劑盒檢測總蛋白濃度；12% SDS-PAGE分離蛋白后用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜上；5%封閉液室溫封閉蛋白1 h；一抗稀釋液稀釋抗體配制一抗工作液，4 ℃搖床孵育過夜，TBST溶液清洗3次；用一抗宿主來源相同的二抗工作液孵育PVDF膜，室溫孵育1 h；二抗孵育結(jié)束后，TBST洗膜3次，滴加ECL曝光顯影；顯色并統(tǒng)計灰度值計算相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織炎癥評分及炎癥細胞浸潤情況對照組大鼠支氣管管壁結(jié)構(gòu)完整，無炎癥細胞浸潤且病理改變不明顯；哮喘組大鼠可見上皮下、支氣管周圍、肺泡間隔以及血管周圍大量的炎細胞浸潤，同時出現(xiàn)了支氣管管壁結(jié)構(gòu)錯亂，管壁增厚，氣道管腔狹窄，上皮下纖維化等改變，哮喘4周組和哮喘8周組大鼠肺組織炎癥評分及氣道壁炎癥細胞浸潤較對照組增多，且哮喘8周組亦較4周組增多(F=32.80，P<0.001；F=21.13，P=0.001 9)，見圖1。

圖1 大鼠肺組織炎癥評分及炎癥細胞浸潤情況 HE×200A：HE染色結(jié)果；B：肺組織炎癥反應評分；C：炎癥細胞總數(shù)；a:對照組；b:哮喘4周組；c：哮喘8周組；與對照組比較：*P<0.01，**P<0.001；與哮喘4周組比較：#P<0.01，##P<0.001

2.2 氣道上皮中杯狀細胞增生及黏液分泌情況PAS染色后，與對照組相比，哮喘組支氣管上皮細胞中PAS陽性杯狀細胞面積較對照組增多；與哮喘4周組相比，哮喘8周組PAS陽性細胞面積增加顯著(F=34.60，P<0.001)，見圖2。

圖2 氣道上皮中杯狀細胞增生及黏液分泌情況 PAS×200A：PAS染色結(jié)果；B：肺組織黏液產(chǎn)生評分；a:對照組；b:哮喘4周組；c：哮喘8周組；與對照組比較：**P<0.001；與哮喘4周組比較：##P<0.001

2.3 大鼠肺組織膠原纖維沉積情況Masson染色后，哮喘組與對照組比較，大鼠肺組織中膠原纖維沉積增加且隨著OVA致敏時間延長，哮喘8周組膠原纖維沉積較哮喘4周組增加更明顯(F=12.76，P=0.026)，見圖3。

圖3 大鼠肺組織膠原纖維的沉積情況 Masson×200A：Masson染色；B：纖維化比值；a:對照組；b:哮喘4周組；c：哮喘8周組；與對照組比較：*P<0.01；與哮喘4周組比較： #P<0.01

2.4 大鼠氣道平滑肌增生情況與對照組相比，哮喘組中氣道壁的α-SMA染色陽性區(qū)域明顯增加，且隨著造模時間延長，氣道重塑嚴重，與哮喘4周組比較，哮喘8周組中氣道壁α-SMA染色陽性區(qū)域亦增加顯著(F=23.95，P<0.001)，見圖4和表1。

圖4 大鼠氣道平滑肌增生情況 ×100a:對照組；b:哮喘4周組；c：哮喘8周組

表1 各組大鼠氣道平滑肌α-SMA染色陽性區(qū)域面積

2.5 大鼠肺組織中組蛋白去甲基化酶KDM2A蛋白表達情況與對照組比較，哮喘組肺組織中KDM2A蛋白表達升高(P<0.01)，與哮喘4周組相比，哮喘8周組KDM2A蛋白表達量亦增加(F=69.75，P<0.001)，見圖5。

圖5 大鼠肺組織中組蛋白去甲基化酶KDM2A蛋白表達情況A:對照組；b:哮喘4周組；c：哮喘8周組；與對照組比較：**P<0.001；與哮喘4周組比較： ##P<0.001

2.6 KDM2A與氣道炎癥和氣道重塑相關(guān)性Pearson線性相關(guān)分析顯示：各組大鼠肺組織KDM2A蛋白表達與氣道炎癥評分、炎癥細胞總數(shù)、杯狀細胞黏液分泌評分、肺組織纖維化比值及氣道平滑肌增生面積呈正相關(guān)(P<0.001)。見表2。

表2 各組大鼠肺組織KDM2A蛋白表達與哮喘氣道炎癥和氣道重塑的相關(guān)性

3 討論

表觀遺傳學作為生命科學領(lǐng)域的研究熱點之一，在支氣管哮喘中所發(fā)揮的作用越來越受到重視。它主要表現(xiàn)在DNA修飾、非編碼RNA調(diào)控以及組蛋白修飾三個方面。其中組蛋白修飾可以通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)基因表達，其主要包括組蛋白乙?；?、組蛋白甲基化、磷酸化、泛素化、蘇木化以及瓜氨酸化等[5]。組蛋白甲基化對基因表達影響取決于甲基化殘基以及甲基化的程度和方向，而這個過程受蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶或者賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶和賴氨酸去甲基化酶(lysine demethylases，KDMs)兩組酶的動態(tài)調(diào)控[6]。KDM2A和其相似物KDM2B都是含有Jumonji C結(jié)構(gòu)域的組蛋白KDMs，它們是哺乳動物中僅有的兩種賴氨酸去甲基化酶KDMs，可催化組蛋白H3K36me2去甲基化，從而激活轉(zhuǎn)錄基因[3]。眾多實驗已經(jīng)證實KDM2A在細胞增殖、凋亡、腫瘤發(fā)生及人工誘導多能干細胞技術(shù)等方面具有重要作用[3,7]，但是其在哮喘氣道炎癥及氣道重塑的發(fā)病機制尚不清楚。本研究通過OVA致敏誘導大鼠哮喘模型，觀察哮喘大鼠肺組織與對照組KDM2A表達變化，探討KDM2A與哮喘氣道炎癥及氣道重塑之間的關(guān)系。結(jié)果顯示：哮喘組大鼠肺組織KDM2A蛋白表達水平明顯高于正常組，且隨著致敏時間延長，哮喘8周組KDM2A蛋白表達較哮喘4周組明顯升高，結(jié)果提示KDM2A可能參與哮喘發(fā)生發(fā)展過程。

氣道炎癥及氣道重塑是支氣管哮喘的主要病理特征，多種炎癥細胞浸潤是哮喘慢性氣道炎癥主要病理生理表現(xiàn)[4]。KDM2A是調(diào)控組蛋白H3K36、H3K14去甲基化的重要基因，在小鼠哮喘模型及哮喘患者肺組織中，表達增高的組蛋白H3K36、H3K14參與氣道炎癥及氣道重塑的發(fā)生[8]。KDM2A在不同組織表達量不同，特別在肺、大腦、睪丸及卵巢等組織表達量明顯增高。高表達KDM2A后，滑膜細胞增殖增加，促進炎癥介質(zhì)分泌增加[9]。同時，作為KDM2家庭成員之一的KDM2B介導白介素6產(chǎn)生和炎癥反應過程，在KDM2B基因敲除小鼠中，炎癥表型較輕、血清炎癥介質(zhì)IL-6產(chǎn)生減少[10]。這些研究結(jié)果均提示KDM2A作為組蛋白去甲基化調(diào)節(jié)的主要基因，在炎癥調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示：哮喘組大鼠肺組織上皮下、支氣管周圍、肺泡間隔以及血管周圍大量的炎細胞浸潤，黏膜充血腫脹，上皮細胞脫落壞死，炎癥細胞總數(shù)增多。此外，本研究提示大鼠肺組織KDM2A表達與氣道炎癥評分、炎癥細胞總數(shù)、黏液分泌評分呈正相關(guān)，提示KDM2A與支氣管哮喘氣道炎癥關(guān)系密切，推測其可能通過調(diào)控炎癥細胞的分化和浸潤，從而促進炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，加劇氣道炎癥過程。

氣道重塑主要是氣道壁結(jié)構(gòu)的改變，主要表現(xiàn)為上皮細胞脫落壞死、基底膜增厚、杯狀細胞增生及黏液分泌增多、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、氣道平滑肌細胞增殖和遷移以及氣道血管生成及血管重塑[4]。KDM2A調(diào)控組蛋白H3K36的甲基化，組蛋白H3K36參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、基因劑量補償、pre-mRNA剪接、DNA復制、重組和DNA損傷修復等過程[11-12]。在心肌梗死小鼠模型中，KDM2A上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子表達，從而促進心肌細胞血管生成及抑制心肌細胞的凋亡，促進心室重構(gòu)[13]。在卵巢癌細胞中，KDM2A參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程[14]。已有研究證實蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶PRMT1抑制劑(AMI-1)可以降低ASMCs增殖、細胞外基質(zhì)沉積和細胞遷移；減少大鼠肺組織氣道和肺泡病變、黏液分泌和膠原沉積，即蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶PRMT1參與哮喘氣道重塑[15]。那么作為組蛋白甲基化另一種關(guān)鍵酶賴氨酸去甲基化酶KDMs是否也參與哮喘氣道重塑的調(diào)控呢？本研究結(jié)果顯示，哮喘組大鼠肺組織KDM2A表達量明顯高于對照組，且隨著致敏時間延長，該因子表達量亦逐漸增加。本研究通過分析哮喘大鼠與KDM2A表達與氣道重塑的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)哮喘大鼠模型KDM2A的表達與氣道壁纖維化比值、氣道平滑肌的面積呈正相關(guān)，由此推測KDM2A可能通過促進氣道血管生成，參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，誘導氣道平滑肌細胞的增殖和遷移等方式參與氣道重塑的過程，但具體的機制目前尚不清楚，有待進一步研究。

綜上所述，本研究初步顯示組蛋白去甲基化酶KDM2A與支氣管哮喘的發(fā)病有著密切關(guān)系，為表觀遺傳學在支氣管哮喘的發(fā)病機制方面開辟了新的思路，而KDM2A參與哮喘氣道炎癥和氣道重塑的具體機制，仍需深入研究。