艾奇淵，王 勇，徐瑞春，彭 臻，李勁松

顱內(nèi)動脈瘤(intracranial aneurysm，IA)破裂是蛛網(wǎng)膜下腔出血的主要原因，通常會導(dǎo)致神經(jīng)功能衰竭或死亡。顯微外科手術(shù)和血管內(nèi)干預(yù)在治療IA方面取得了重大進(jìn)展，但發(fā)病率和死亡率仍然很高[1]。IA發(fā)病機制包括IA相關(guān)的氧化應(yīng)激、炎癥和血管肌細(xì)胞功能障礙[2]。因此，緩解炎癥和氧化應(yīng)激的策略對于IA的治療是迫切需要的。燈盞花素(breviscapine，Bre)是從燈盞花中提取的一種黃酮類化合物，其基本活性成分是黃酮。它可以擴(kuò)張血管，降低血液粘度和改善微循環(huán)，并作為氧自由基的清道夫[3]。此外，Bre在治療心血管和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面顯示出積極的效果[4-5]。Li et al[6]研究發(fā)現(xiàn)Bre通過其抗炎和抗氧化作用減輕短暫性腦缺血/再灌注引起的認(rèn)知障礙。Li et al[7]研究表明Bre在創(chuàng)傷性腦損傷后通過調(diào)節(jié)核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)信號通路提供神經(jīng)保護(hù)作用。但Bre在顱內(nèi)動脈瘤中的藥理作用知之甚少。該研究通過建立IA大鼠模型和過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)氧化損傷模型，探究Bre對IA形成及對Nrf2途徑的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器燈盞花素(breviscapine，Bre，純度>98%)(美國Sigma-Aldrich公司)；蘇木精伊紅(HE)染色試劑盒(貨號C0105)、比辛酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(貨號P0012)、ECL發(fā)光液(貨號P0018S)、RIPA裂解緩沖液(貨號P0013B)和活性氧檢測試劑盒(貨號S0033S)(碧云天生物公司)；TRIzol試劑、NE-PER核和細(xì)胞質(zhì)提取試劑(美國Thermo Scientific公司)；One Step PrimeScriptTMⅢ RT-qPCR Mix(大連寶生物工程有限公司)；兔來源一抗Nrf-2 (ab137550)、平滑肌22α(smooth muscle 22α，SM22α)(ab14106)、Lamin B1(ab16048)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2(ab92536)、MMP-9(ab76003)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(ab205718)和山羊抗兔 IgG H&L (Alexa Fluor? 488)(ab150077)、源一抗β-肌動蛋白(β-actin)(ab8226)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)(ab7817)、山羊抗小鼠 IgG H&L(Alexa Fluor? 647)(ab150115)、兔抗小鼠 IgG H&L (HRP)(ab6728)(英國Abcam公司)；白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)；ML385(Nrf2抑制劑)(美國MCE公司)；Annexin V/碘化丙啶(PI)(美國Invitrogen公司)。Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂公司)，RX51光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，多功能紫外酶標(biāo)儀(美國 Bio-Rad 公司)，高速離心機(德國 Eppendorf 公司)，熒光顯微鏡(德國徠卡)，CytoFLEX流式細(xì)胞儀(美國Beckman Coulter公司)。

1.2 動物建模和給藥SPF級雄性 SD 大鼠 50只，6～8周齡，體質(zhì)量200～250 g，購自貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。動物飼養(yǎng)在溫度25 ℃左右、濕度50%左右，12/12 h光-暗環(huán)境中，實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。將大鼠隨機分為3組(n=15)：假手術(shù)組、模型組、Bre組，Bre劑量(50 mg/kg)根據(jù)Li et al[7]研究確定。

造模方法[8]及給藥：用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠后，結(jié)扎大鼠的右頸總動脈，并將10 μl的10 U/ml彈性蛋白酶立體定向注入基底池，立即施用血管緊張素Ⅱ以誘導(dǎo)全身高血壓，假手術(shù)組大鼠立體定向注射相等體積的生理鹽水。Bre組以50 mg/kg的劑量腹腔注射給藥，假手術(shù)組和模型組腹腔注射等體積生理鹽水，持續(xù)3周，采用袖帶法測量大鼠尾部收縮壓。監(jiān)測大鼠的存活3周，取大鼠頸總動脈分叉部取動脈瘤組織標(biāo)本和正常動脈組織標(biāo)本，檢查IA的發(fā)病率和破裂。

1.3 免疫組化和HE染色將動脈瘤組織和正常動脈組織固定在10%中性甲醛溶液中24 h后，常規(guī)脫水、透明和石蠟包埋，并切成5 μm截面，置于聚賴氨酸涂覆的載玻片上，行HE染色。對于免疫組織化學(xué)分析，用一抗Nrf2(1 ∶200)4°C孵育過夜，PBS洗滌，DAB 顯色5 min，PBS 洗3 次，顯微鏡下觀察。

1.4 免疫熒光染色用SM22α(1 ∶400)和α-SMA(1 ∶200)一抗在4 ℃下孵育5 μm切片過夜，PBS洗滌3次，加入熒光標(biāo)記的二抗(1 ∶1 000)，室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.5 分離培養(yǎng)大鼠VMSC和細(xì)胞分組向雄性SD大鼠(n=5)注射肌肉松弛劑和麻醉劑，處死后分離大鼠胸主動脈。去除組織的結(jié)締外層，并使用微型鑷子剝離外膜。用鑷子輕輕刮擦血管的內(nèi)表面，以除去內(nèi)膜。然后，將中膜切成1 mm3的碎片，并均勻地鋪在25 cm2的培養(yǎng)瓶中。將所得VMSC在含有10%胎牛血清(FBS)、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2的條件下。實驗僅使用第4～6代的VSMC。用單克隆α-SMA抗體進(jìn)行的免疫熒光染色用于VSMC的鑒定和表征。

1.6 細(xì)胞分組和處理本研究中用H2O20.5 mmol/L 處理VSMC 12 h，以誘導(dǎo)氧化損傷。VSMC分組情況如下：對照組、H2O2(0.5 mmol/L)組、H2O2+Bre(100 μmol/L)組、H2O2+Bre(100 μmol/L)+ ML385(Nrf2抑制劑)組。上述分組Bre(根據(jù)He et al[5]研究確定濃度)和ML385(5 mmol/L)分別預(yù)處理VSMC 24 h，然后用H2O20.5 mmol/L處理12 h，收獲VSMC用于后續(xù)實驗。

1.7 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測谷氨酸-半胱氨酸催化亞基(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit，GCLC)、NAD(P)H醌脫氫酶1[NAD(P)H quinone dehydrogenase 1，NQO-1]、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)、α-SMA、SM22α mRNA水平使用TRIzol試劑從VSMC或腦動脈中提取總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行實時PCR，引物序列見表1。使用β-actin作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法計算相對mRNA水平。

表1 引物序列

1.8 核質(zhì)分離按照1.6項分組處理細(xì)胞后，用胰蛋白酶消化收獲VSMC，用PBS洗滌，并通過離心沉淀。根據(jù)制造商的說明，使用NE-PER核和細(xì)胞質(zhì)提取試劑從細(xì)胞中制備核和細(xì)胞質(zhì)提取物。蛋白質(zhì)水平以相對于Lamin B1(核組分內(nèi)參)或β-actin(質(zhì)組分內(nèi)參)的相對比值進(jìn)行測量。

1.9 Western blot檢測蛋白表達(dá)RIPA 裂解液提取VSMC中總蛋白，BCA測定總蛋白濃度。每孔上樣量40 μg，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，室溫下用5%脫脂奶粉液封閉膜2 h，加入一抗Nrf2(1 ∶500)、Lamin B1(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶1 000)、α-SMA (1 ∶200)、SM22α (1 ∶250)、MMP-2(1 ∶1 000)、MMP-9(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜，加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶3 000)和兔抗小鼠 IgG(HRP)(1 ∶2 000)，室溫孵育2 h，洗膜，ECL發(fā)光顯色，拍照。采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.10 ELISA檢測VSMC中細(xì)胞因子水平按照1.6項分組處理細(xì)胞后，1 062 r/min離心5 min，收集細(xì)胞上清液，按照試劑盒說明書操作，檢測IL-1β、IL-6、MCP-1和TNF-α含量。

1.11 流式檢測細(xì)胞凋亡按照1.6項分組處理細(xì)胞后，收集細(xì)胞，用PBS洗滌，再懸浮在100 ml結(jié)合緩沖液中。然后用Annexin V和PI在黑暗中孵育10 min，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.12 DCFH-DA熒光染色檢測活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生將細(xì)胞以1×105個/孔密度接種在6孔板中，按照1.6項分組處理細(xì)胞后，加入DCFH-DA熒光探針(1 ∶1 000)，將細(xì)胞在37 ℃下孵育1 h。然后，用無血清DMEM洗滌VSMC 3次并懸浮在PBS中。在流式細(xì)胞儀488 nm(激發(fā))和525 nm(發(fā)射)的波長下測量DCFH的熒光強度。

2 結(jié)果

2.1 燈盞花素可以防止大鼠模型中IA的形成和破裂在假手術(shù)組中，Nrf2表達(dá)主要在細(xì)胞質(zhì)中，IA大鼠Nrf2表達(dá)下調(diào)且轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，Bre治療后Nrf2在核內(nèi)表達(dá)增多。HE結(jié)果顯示，假手術(shù)組未發(fā)現(xiàn)動脈內(nèi)膜、VSMC和外膜損傷，并且細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整。模型組大鼠內(nèi)膜受損，VSMC數(shù)量和層數(shù)減少，動脈壁變薄，彈性纖維斷裂和炎性細(xì)胞浸潤。Bre治療減輕IA大鼠的病理損傷和炎性細(xì)胞浸潤程度，見圖1A。與假手術(shù)組比較，模型組IA發(fā)生率(14vs0)升高(P<0.01)，生存率降低，收縮壓升高(P<0.01)；與模型組相比，Bre組的IA發(fā)生率(12vs14)降低(P<0.01)，見圖1B，生存率改善(P<0.01)，見圖1C，收縮壓降低(P<0.01)，見圖1D。

圖1 燈盞花素可以防止大鼠模型中IA的形成和破裂A：Nrf2免疫組化和HE染色 ×400；B：顱內(nèi)動脈瘤發(fā)生率；C；各組大鼠生存率；D；各組大鼠收縮壓；與假手術(shù)組比較：**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01

2.2 燈盞花素恢復(fù)IA大鼠中收縮相關(guān)基因的表達(dá)如圖2所示，與假手術(shù)組比較，模型組腦動脈瘤中α-SMA和SM22α熒光密度降低(t=36.63，P<0.01；t=23.73，P<0.01)，α-SMA和SM22α mRNA水平(t=23.90，P<0.01；t=23.70，P<0.01)和蛋白表達(dá)水平(t=34.08，P<0.01；t=31.52，P<0.05)均下調(diào)；與模型組比較，Bre預(yù)處理增加α-SMA和SM22α的熒光密度(t=25.36，P<0.01；t=23.63，P<0.01)，上調(diào)α-SMA和SM22α mRNA水平(t=15.45，P<0.01；t=13.51，P<0.01)和蛋白表達(dá)水平(t=7.40，P<0.01；t=8.52，P<0.05)。

圖2 燈盞花素對IA大鼠中收縮相關(guān)基因表達(dá)的影響A：免疫熒光染色檢測α-SMA和SM22α表達(dá) ×400；B：熒光強度統(tǒng)計；C：α-SMA和SM22α mRNA水平；D：Western blot檢測α-SMA和SM22α蛋白表達(dá)；E：蛋白相對表達(dá)量；與假手術(shù)組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.3 在H2O2誘導(dǎo)的VSMC中燈盞花素可激活Nrf2途徑如圖3所示，在H2O2處理后，VSMC中的核Nrf2表達(dá)上調(diào)(t=5.04，P<0.05)，胞質(zhì)Nrf2表達(dá)下調(diào)(t=5.71，P<0.01)，Bre預(yù)處理VSMC上調(diào)核Nrf2表達(dá)(t=13.51，P<0.01)，下調(diào)胞質(zhì)Nrf2表達(dá)(t=6.28，P<0.01)。與假手術(shù)組比較，雖然模型組表現(xiàn)出SOD-1、GCLC和NQO1 mRNA水平的升高，但Bre組表現(xiàn)出更高的上調(diào) (F=231.50，P<0.01；F=101.60，P<0.01；F=61.34，P<0.01)。

圖3 燈盞花素對Nrf2途徑的影響A：Western blot檢測各組核Nrf2和胞質(zhì)Nrf2的表達(dá)；B：核Nrf2蛋白相對表達(dá)量；C：胞質(zhì)Nrf2蛋白相對表達(dá)量；D：SOD1轉(zhuǎn)錄水平；E：GCLC轉(zhuǎn)錄水平；F：NQO-1轉(zhuǎn)錄水平；與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與 H2O2組比較：##P<0.01

2.4 燈盞花素通過Nrf2途徑抑制H2O2誘導(dǎo)的VSMC表型切換和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生如圖4所示，H2O2處理下調(diào)VSMC中α-SMA和SM22α的表達(dá)(t=25.25，P<0.01；t=34.08，P<0.01)，上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)(t=24.58，P<0.01；t=20.75，P<0.01)；Bre預(yù)處理組上調(diào)VSMC中α-SMA和SM22α的表達(dá)(t=11.28，P<0.01；t=13.80，P<0.01)，下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)(t=18.73，P<0.01；t=17.23，P<0.01)；抑制Nrf2可逆轉(zhuǎn)Bre的治療作用。如表2所示，H2O2處理的VSMC中炎性因子含量增加，Bre預(yù)處理降低了H2O2誘導(dǎo)的高炎性因子水平；抑制Nrf2減弱了Bre的抗炎效果。

表2 ELISA法檢測VMSC細(xì)胞中促炎因子水平

圖4 燈盞花素通過Nrf2途徑對H2O2誘導(dǎo)的VSMC損傷的影響A：Western blot檢測各組α-SMA、SM22α、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)；B：α-SMA和SM22α 蛋白相對表達(dá)量；C：MMP-2和MMP-9蛋白相對表達(dá)量；a:對照組；b: H2O2組；c: H2O2+Bre組；d: H2O2+Bre+ML385組；與對照組比較：**P<0.01；與H2O2組比較：##P<0.01；與H2O2+Bre組比較：&&P<0.01

2.5 燈盞花素通過Nrf2途徑抑制H2O2誘導(dǎo)的

ROS產(chǎn)生和VSMC凋亡如圖5所示，在H2O2處理的VSMC中ROS的產(chǎn)生較高(t=9.03，P<0.01)，Bre預(yù)處理降低了ROS的產(chǎn)生(t=6.78，P<0.01)。H2O2處理導(dǎo)致VSMC凋亡率增加(t=8.42，P<0.01)，Bre預(yù)處理降低了H2O2誘導(dǎo)的凋亡(t=4.31，P<0.05)。此外，Nrf2被抑制時減弱了Bre對H2O2處理的VSMC細(xì)胞ROS產(chǎn)生和凋亡的抑制作用(P<0.01)。

圖5 燈盞花素通過Nrf2途徑對H2O2誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生和VSMC凋亡的影響A：DCFH-DA染色檢測ROS的產(chǎn)生 ×400；B：流式檢測細(xì)胞凋亡；a:對照組；b: H2O2組；c: H2O2+Bre組；d: H2O2+Bre+ML385組；與對照組比較：**P<0.01；與H2O2組比較：#P<0.05,##P<0.01；與H2O2+Bre組比較：&P<0.05,&&P<0.01

3 討論

IA是一種腦血管疾病，具有很高的病死率和發(fā)病率。IA病理過程包括內(nèi)部彈性層板的破壞、VSMC表型的轉(zhuǎn)換和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的重塑[9]。既往研究[10]表明Nrf-2信號途徑通過調(diào)節(jié)VSMC表型和功能來抑制顱內(nèi)動脈瘤形成和進(jìn)展。在本研究中，通過注射彈性蛋白酶到基底池建立的IA大鼠動脈瘤壁中Nrf2的表達(dá)減少，且VSMC發(fā)生病變和炎性細(xì)胞浸潤。Bre上調(diào)Nrf2的表達(dá)，減輕VSMC的病理損傷，降低大鼠IA的發(fā)生和破裂，增加大鼠生存率。此外，Bre上調(diào)IA大鼠腦動脈瘤中收縮表型標(biāo)志物SM22α和α-SMA的表達(dá)[11]，提示VSMC表型恢復(fù)正常。因此上述結(jié)果表明，Bre在顱內(nèi)動脈瘤的形成和發(fā)展中起到保護(hù)作用，其機制可能與Nrf2的高表達(dá)有關(guān)。

既往研究[12]表明Nrf2是主要的內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)之一，在正常生理條件下，kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(Kelch-like ECH associating protein1，Keap1)與Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中結(jié)合。在應(yīng)激條件下，Nrf-2從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)到細(xì)胞核，調(diào)節(jié)抗氧化和抗炎基因的表達(dá)[13]。Nrf-2途徑的激活在IA中具有抗氧化應(yīng)激和防止VSMC表型切換的保護(hù)作用[14]。Liu et al[15]研究發(fā)現(xiàn)Bre在CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷中可通過激活Nrf2途徑及下游抗氧化酶、減少ROS產(chǎn)生和抑制炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果表明Bre可上調(diào)H2O2處理的VSMC中核Nrf2的表達(dá)并增加下游抗氧化酶轉(zhuǎn)錄水平，減少ROS的產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡，并抑制VMSC中炎性細(xì)胞因子的分泌。而加入Nrf2抑制劑減弱了Bre的抗炎、抗氧化和恢復(fù)VSMC收縮表型作用。因此，Bre通過激活Nrf2途徑減輕H2O2誘導(dǎo)的VSMC氧化損傷和表型轉(zhuǎn)換。

綜上所述，本研究表明Bre通過改善大鼠動脈壁病理損傷、IA發(fā)生率和存活率起到有效保護(hù)作用。體外研究表明Bre能夠激活Nrf2信號，促進(jìn)抗氧化酶的表達(dá)，抑制促炎性細(xì)胞因子、ROS的產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡。