付 林，陳遠(yuǎn)華，徐德祥

胎兒宮內(nèi)生長受限(fetal intrauterine growth restriction, IUGR) 是指受病理因素影響，胎兒出生未能達(dá)到其遺傳決定的全部生長潛能[1]。在美國和歐洲，IUGR的發(fā)生率為5%～15%，而在中國IUGR的發(fā)生率為6%～10%[2-3]。IUGR不僅增加了死胎發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也是誘發(fā)圍產(chǎn)期胎兒高發(fā)病率和死亡率的主要原因[4]。此外，IUGR還會(huì)增加成年期慢性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，研究[5-6]表明，IUGR胎兒在成年期以后易患Ⅱ型糖尿病、中心性肥胖、心血管疾病、代謝性疾病以及神經(jīng)發(fā)育受損等。

維生素D缺乏(vitamin D deficiency, VDD)，指血清中25-(OH)-D的水平低于20 ng/ml，近年來母體孕期維生素D缺乏與不良妊娠結(jié)局的關(guān)系受到越來越多的關(guān)注，流行病學(xué)研究[7-9]表明母體孕期維生素D缺乏增加了死胎、流產(chǎn)以及早產(chǎn)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，但是維生素D缺乏誘發(fā)IUGR具體機(jī)制不清楚。因此，該研究旨在通過低維生素D飼料喂養(yǎng)構(gòu)建VDD誘發(fā)IUGR孕鼠模型，并從甾體激素合成方面探討VDD誘發(fā)IUGR的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)CD-1系成年雌鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2017-0007。4周齡雌鼠體質(zhì)量18～20 g，飼養(yǎng)在恒溫恒濕鼠房中，自由進(jìn)食和飲水，保持恒定的晝夜節(jié)律。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵從安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)協(xié)會(huì)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)中心的管理章程，符合動(dòng)物倫理學(xué)的規(guī)定。

1.1.2藥物與試劑 雌激素和孕激素檢測(cè)試劑盒購于北京美正生物科技有限公司。核因子E2相關(guān)因子(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf-2；貨號(hào)：ab62352)、NADPH氧化酶2 (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 2，NOX-2；貨號(hào)：ab80508)、細(xì)胞色素P450家族成員11A1 (cytochrome P450 family 11 subfamily A member 1，CYP11A1；貨號(hào)：ab67355)和β-actin (貨號(hào): ab179467)一抗購于美國Abcam公司；NADPH氧化酶2 (NOX-4；貨號(hào)：D21F6)、血紅素氧合酶1 (heme oxygenase-1，HO-1；貨號(hào)：E9H3A)和血紅素氧合酶2 (HO-2；貨號(hào)：D9J9U)一抗均購于美國Cell Signaling Technology公司；芳香化酶p450 (aromatase cytochrome P450，CYP19；貨號(hào)：SC14245)、3β-羥基類固醇脫氫酶 (3β-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD2；貨號(hào)：SC28206)和3-硝基酪氨酸 (3-nitrotyrosine，3-NT；貨號(hào)：SC32757)一抗購于美國Santa Cruz公司。RNA提取試劑盒由美國Promega公司提供，逆轉(zhuǎn)錄試劑由瑞士Roche公司提供，PVDF膜由美國Millipore公司提供，ECL顯色液由美國Advansta公司提供，免疫組化試劑盒由北京中山金橋生物技術(shù)有限公司提供。其他常規(guī)試劑均購自美國Abcam公司。

1.1.3儀器 Fine Do X6全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)，LightCycler?480定量PCR儀 (美國Roche公司)，Senergy2多功能酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)，Universal32R低溫高速離心機(jī)(德國Hettich科學(xué)儀器公司)，UV-1200型紫外可見分光光度計(jì)(中國上海翱藝有限公司)，光學(xué)顯微鏡和DP71成像系統(tǒng)(日本Olympus公司)。

1.2 動(dòng)物模型的制備小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周以后，隨機(jī)均分成對(duì)照組(CTRL組)和維生素D缺乏組(VDD組)。CTRL組小鼠喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼料(維生素D含量大于800 IU/kg)，VDD組小鼠飼養(yǎng)在無紫外光的環(huán)境中，并喂以低維生素D飼料(維生素D含量小于25 IU/kg)。正常飼料和低維生素D飼料購于北京科奧協(xié)力有限公司。飼養(yǎng)5周以后，于晚上9:30按照4只雌鼠與2只正常雄鼠合籠交配，次日早上7:30檢查陰栓，以陰道口查到黃色栓狀固體分泌物視為交配成功。查到陰栓的天數(shù)記為妊娠第1天，在妊娠第16天剖殺部分孕鼠，取母鼠血液檢測(cè)血清甾體激素水平，留取胎盤進(jìn)行蛋白免疫印跡(Western blot)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和免疫組織化學(xué)檢測(cè)；在妊娠第19天剖殺剩余孕鼠，取胎血檢測(cè)血清25-(OH)-D水平，統(tǒng)計(jì)活胎、死胎以及吸收胎數(shù)，稱取胎鼠和胎盤重量，量取胎鼠身長和胎盤直徑。

1.3 胎盤總蛋白的提取及Western blot實(shí)驗(yàn)剪取3/4個(gè)胎盤組織到含有500 μl蛋白裂解液的電動(dòng)勻漿器中，冰上快速勻漿30 s，結(jié)束后轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管中，插入冰盒中靜置12 min，然后在4 ℃離心機(jī)中15 000 r/min離心10 min，然后吸取上清液300 μl至新的EP管中，冰盒上繼續(xù)靜置5 min，然后4 ℃離心機(jī)中10 000 r/min繼續(xù)離心5 min，吸取上清液250 μl，煮沸變性10 min，所得即為小鼠胎盤組織總蛋白，分裝于-80 ℃超低溫冰箱中保存。接下來進(jìn)行SDS-PAGE電泳，取下PVDF膜，清洗干凈，牛奶封閉，孵育一抗(1 ∶2 000稀釋)和二抗(1 ∶10 000稀釋)[10]，PBS漂洗干凈，加入ECL發(fā)光液，然后自動(dòng)發(fā)光顯影，拍照并分析目的條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白表達(dá)量。

1.4 放射免疫分析法用放射免疫法檢測(cè)血清中孕激素、雌激素以及25-(OH)-D的水平。試劑盒于室溫中復(fù)溫30 min，稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后在玻璃管中加入500 μl乙腈、標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控和待測(cè)樣品。劇烈震蕩20 s，室溫下3 000 r/min離心10 min，吸取上清液50 μl至新的玻璃管中，加入125I 放射試劑，然后加入抗體，震蕩混勻，孵育30 min后，加入二抗復(fù)合物，繼續(xù)孵育30 min，然后于放射免疫分析儀中檢測(cè)其放射強(qiáng)度，根據(jù)已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算血清中雌激素、孕激素和25-(OH)-D的水平。

1.5 免疫組織化學(xué)法取部分小鼠胎盤組織，將其固定于4%多聚甲醛溶液中，期間不?；蝿?dòng)樣品管，固定24 h后液體石蠟包埋胎盤組織，切片。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇溶液(從高到低)水化，PBS洗片。TritonX-100通透液(含有雙氧水)通透50 min，然后在微波爐中加熱檸檬酸鈉溶液進(jìn)行抗原修復(fù)?？乖迯?fù)完成后，進(jìn)行冷卻。然后加入血清，濕盒中封閉2 h，吸干血清，無需清洗，直接加入一抗，4 ℃冰箱中孵育過夜，回收一抗，加入二抗工作液，37 ℃恒溫箱中繼續(xù)孵育1.5 h，然后將切片在PBS中漂洗干凈，繼續(xù)SP反應(yīng)1 h，最后DAB顯色，在封閉避光的房間中操作，在顯微鏡下實(shí)時(shí)觀察顯色情況，出現(xiàn)棕黃色或棕褐色及時(shí)終止反應(yīng)。然后洗凈切片，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察Nrf-2陽性細(xì)胞核數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 低維生素D飼料喂養(yǎng)構(gòu)建維生素D缺乏動(dòng)物模型為驗(yàn)證VDD模型是否成功建立，檢測(cè)母鼠血清25-(OH)-D水平。結(jié)果顯示，VDD組母鼠血清25-(OH)-D(5.7±0.44 ng/ml)顯著低于CTRL組(17.5±0.56 ng/ml)。以上結(jié)果表明，5周連續(xù)的低維生素D飼料喂養(yǎng)，成功構(gòu)建維生素D缺乏小鼠模型。

2.2 母體孕期維生素D缺乏誘發(fā)IUGR在孕第19天剖殺孕鼠，觀察妊娠結(jié)局。結(jié)果如表1所示，與CTRL組相比，VDD組活胎數(shù)減少(t=1.123，P<0.05)，晚死胎數(shù)增加(t=1.123，P<0.05)，早死胎數(shù)和吸收胎數(shù)在兩組之間無差異。稱量胎鼠和胎盤重量，結(jié)果顯示VDD組胎鼠重量 (t=2.517，P<0.01)和胎盤重量(t=5.073，P<0.01)均是低于CTRL組。測(cè)量胎鼠身長和胎盤直徑，發(fā)現(xiàn)VDD組胎鼠身長 (t=1.830，P<0.01)和胎盤直徑(t=1.831，P<0.01)均低于CTRL組。

表1 兩組孕鼠出生結(jié)局

2.3 母體孕期維生素D缺乏上調(diào)胎盤雌激素合成通過Western blot法檢測(cè)小鼠胎盤雌激素合成關(guān)鍵酶CYP19的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖1所示，VDD組小鼠胎盤CYP19蛋白表達(dá)水平高于CTRL組(圖1A、1B)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.532，P<0.01)。此外，檢測(cè)小鼠胎盤孕激素合成關(guān)鍵酶蛋白表達(dá)水平，結(jié)果提示孕激素合成關(guān)鍵酶CYP11A1和3β-HSD2蛋白表達(dá)在CTRL和VDD兩組之間無差異 (圖1A、1C、1D)。通過免疫放射分析法檢測(cè)兩組孕鼠血清中雌激素和孕激素水平，結(jié)果提示，盡管孕激素水平在兩組孕鼠之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是雌激素水平在VDD組孕鼠中顯著升高(t=2.637，P<0.01)，見圖1E、1F。

圖1 母體孕期維生素D缺乏對(duì)小鼠甾體激素的影響A：胎盤CYP19、CYP11A1和3β-HSD2蛋白條帶；B：CYP19蛋白條帶定量分析；C：CYP11A1蛋白條帶定量分析; D：3β-HSD2蛋白條帶定量分析; E：孕鼠雌激素水平；F：孕鼠孕激素水平；與CTRL組比較：**P<0.01

2.4 母體孕期維生素D缺乏誘發(fā)胎盤氧化應(yīng)激通過Western blot法檢測(cè)小鼠胎盤氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖2所示，盡管HO-2蛋白在兩組之間表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (圖2A、2B)，但是HO-1表達(dá)水平在VDD組小鼠胎盤中升高(t=6.102，P<0.01)，見圖2A、2B；同時(shí)，小鼠胎盤中NADPH氧化酶水平檢測(cè)結(jié)果提示，維生素D缺乏對(duì)小鼠胎盤NOX-2表達(dá)無影響(圖2)，但是維生素D缺乏明顯上調(diào)了小鼠胎盤NOX-4表達(dá)(t=2.655，P<0.01) ，見圖2A、2B；小鼠胎盤3-NT蛋白水平檢測(cè)結(jié)果表明，3-NT蛋白在VDD組表達(dá)升高(t=3.654，P<0.01) ，見圖2。此外，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠胎盤Nrf-2的核轉(zhuǎn)位水平結(jié)果顯示，VDD組小鼠胎盤中Nrf-2核轉(zhuǎn)位水平明顯升高(t=5.318，P<0.01) ，見圖3A、3B。

圖2 母體孕期維生素D缺乏對(duì)小鼠胎盤氧化應(yīng)激的影響A:胎盤HO-1、HO-2、NOX-2、NOX-4和3-NT蛋白條帶；B：蛋白條帶定量分析；與CTRL組比較：**P<0.01

圖3 母體孕期維生素D缺乏對(duì)小鼠胎盤Nrf-2核轉(zhuǎn)位的影響A：免疫組化檢測(cè)小鼠胎盤Nrf-2的核轉(zhuǎn)位；B：Nrf-2陽性細(xì)胞核數(shù)；與CTRL組比較：**P<0.01

3 討論

本研究通過在無紫外光照環(huán)境中，連續(xù)5周低維生素D飼料喂養(yǎng)小鼠構(gòu)建VDD小鼠模型，結(jié)果顯示VDD組小鼠血清25-(OH)-D水平顯著低于對(duì)照組，表明VDD小鼠模型被成功構(gòu)建。進(jìn)一步將VDD雌鼠與正常雄鼠交配，結(jié)果顯示VDD組活胎數(shù)減少，晚死胎數(shù)增多，VDD組胎鼠和胎盤重量顯著減輕，胎鼠身長和胎盤直徑明顯降低。以上結(jié)果表明，母體孕期維生素D缺乏可誘發(fā)IUGR，但是具體機(jī)制不明。

越來越多的研究表明，雌激素和孕激素是人體中重要的甾體類固醇激素，在妊娠過程中發(fā)揮著重要作用。妊娠早期孕激素和雌激素主要由黃體產(chǎn)生，而在妊娠中、晚期可由胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞合成和分泌，正常水平的雌激素和孕激素對(duì)胎盤功能維持和胎兒生長發(fā)育發(fā)揮重要作用[11]。在正常妊娠過程中，母血中雌激素會(huì)出現(xiàn)短暫的、生理性的升高，但是在妊娠早起，過高的雌激素會(huì)抑制絨毛外血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)和子宮螺旋動(dòng)脈的浸潤，抑制胎盤的發(fā)育，進(jìn)而導(dǎo)致IUGR[12]。CYP19是一種重要的雌激素合成限速酶，調(diào)節(jié)雌激素的合成。本研究顯示，CYP19蛋白在VDD胎盤中表達(dá)顯著升高；此外，VDD組孕鼠血清雌激素水平升高，而孕激素合成限速酶以及孕激素水平在無明顯改變。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，母體孕期維生素D缺乏可通過促進(jìn)胎盤雌激素合成，升高母體內(nèi)雌激素水平抑制胎盤的發(fā)育和功能進(jìn)而導(dǎo)致IUGR。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體內(nèi)活性氧的過量產(chǎn)生和機(jī)體內(nèi)抗氧化能力的不平衡，活性氧是機(jī)體內(nèi)游離的自由基，會(huì)導(dǎo)致氧化還原狀態(tài)失衡，引起脂質(zhì)過氧化、蛋白質(zhì)羰基化以及DNA損傷等[13]。已有研究[13]表明，胎盤的氧化應(yīng)激在IUGR的病理過程中發(fā)揮著重要作用。機(jī)體內(nèi)活性氧的過量產(chǎn)生，可抑制胎盤的血管重構(gòu)和營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和運(yùn)輸，改變激素的合成，損傷胎盤功能和胎兒發(fā)育，誘發(fā)IUGR。而本研究發(fā)現(xiàn)母體孕期維生素D缺乏上調(diào)胎盤HO-1、NOX-4和3-NT蛋白達(dá)水平，促進(jìn)胎盤Nrf-2核轉(zhuǎn)位水平，以上結(jié)果表明孕期母體維生素D缺乏誘發(fā)胎盤氧化應(yīng)激，損傷胎盤的發(fā)育。提示孕期母體維生素D缺乏可能通過誘發(fā)氧化應(yīng)激促進(jìn)胎盤雌激素合成而導(dǎo)致IUGR，然而，維生素D缺乏誘發(fā)胎盤氧化應(yīng)激的作用機(jī)制目前并不清楚。

Nrf-2是細(xì)胞對(duì)抗氧化損傷的重要作用機(jī)制之一，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞保護(hù)基因的表達(dá)，維持細(xì)胞正常功能。Nrf-2的表達(dá)主要受細(xì)胞內(nèi)泛素化過程和蛋白酶體降解系統(tǒng)調(diào)節(jié)，在靜息狀態(tài)下，Nrf-2與滯蛋白-3型泛素連接酶接頭蛋白(Kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1)相結(jié)合而錨定在細(xì)胞質(zhì)中，而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)部受到活性氧或親電體刺激后，可引發(fā)Keap1構(gòu)象改變并導(dǎo)致Nrf-2游離出來，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核與抗氧化反應(yīng)元件 (antioxidant response element, ARE)結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用，調(diào)節(jié)下游的Ⅱ相解毒酶、抗氧化及抗炎蛋白表達(dá)[14]。維生素D可通過維生素D受體(vitamin D receptor, VDR)激活細(xì)胞內(nèi)的Nrf-2抗氧化系統(tǒng)，抵抗胞內(nèi)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[15]。而維生素D缺乏常導(dǎo)致VDR核轉(zhuǎn)位減少，細(xì)胞核內(nèi)VDR表達(dá)降低，進(jìn)而誘發(fā)機(jī)體氧化應(yīng)激[16]。因此，有理由推測(cè)母體孕期維生素D 缺乏通過誘發(fā)胎盤氧化應(yīng)激，導(dǎo)致過多的活性氧產(chǎn)生，損傷胎盤功能和促進(jìn)胎盤雌激素合成，進(jìn)而誘發(fā)IUGR。

綜上所述，母體孕期維生素D缺乏導(dǎo)致IUGR，其作用機(jī)制可能是維生素D缺乏誘發(fā)胎盤氧化應(yīng)激，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)活性氧過量產(chǎn)生，上調(diào)胎盤CYP19表達(dá)、促進(jìn)雌激素合成，進(jìn)而誘發(fā)IUGR。本研究為母體孕期維生素D缺乏誘發(fā)IUGR的機(jī)制提供了新的證據(jù)。