趙天琦，趙曉彤，許慕蓉，唐 穎，莢澤國(guó)，羅 莉，唐松濤，章 秋，陳明衛(wèi)

糖尿病足是糖尿病常見的嚴(yán)重慢性并發(fā)癥之一。糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcer，DFU)為糖尿病足最常見的表現(xiàn)形式，是導(dǎo)致非創(chuàng)傷性截肢最常見的原因[1]。微小RNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，長(zhǎng)度約為18～25個(gè)核苷酸，通過與下游靶mRNA的3’端非翻譯區(qū)域特異性結(jié)合，調(diào)控靶基因表達(dá)[2]。近年來越來越多的研究[3]表明，miRNAs異常表達(dá)與DFU的發(fā)生與預(yù)后密切相關(guān)。miR-155是miRNAs家族中的重要成員，廣泛參與機(jī)體免疫細(xì)胞的發(fā)育分化、炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等許多生物過程，并可對(duì)參與皮膚創(chuàng)面愈合過程的角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、真皮間充質(zhì)干細(xì)胞等細(xì)胞功能產(chǎn)生顯著影響[4-5]。抑制局部創(chuàng)面組織中miR-155的表達(dá)可促進(jìn)糖尿病大鼠皮膚傷口的愈合[6-7]。目前有關(guān)miR-155與DFU發(fā)病的相關(guān)關(guān)系的臨床研究尚未見報(bào)道。因此，該研究旨在了解DFU患者外周血中miR-155表達(dá)水平的改變及其與DFU發(fā)病之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 病例資料選取的研究對(duì)象來自課題組先前研究[8]報(bào)道的受試者，為2018年1月至2019年12月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科住院治療的2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)合并DFU患者112例(DFU組)，足潰瘍病程≥4周，潰瘍面積在2～20 cm2，Wagner分級(jí) 2～4級(jí)，踝肱比(ankle-brachial index，ABI)0.7～1.3，糖尿病病程3～18年。選擇同期在本院內(nèi)分泌科就診的60例新診斷T2DM患者為糖尿病組 (T2DM組)，無DFU。選擇同期在本院健康管理中心體檢的健康人群60例作為正常對(duì)照組(NC組)，均行75g口服葡萄糖耐量試驗(yàn)，證實(shí)為糖耐量正常。所有受試者無嚴(yán)重心、肝、腎功能不全，非癌性潰瘍創(chuàng)面，無自身免疫疾病，無嚴(yán)重膿毒血癥。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得受試者知情同意。

1.2 主要儀器與試劑全自動(dòng)生化分析儀(MODULE P800，瑞士羅氏公司)，數(shù)碼照相結(jié)合Image J醫(yī)學(xué)圖像分析軟件(Image J-ij133-jdk15，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院)，多普勒血流探測(cè)儀(DPL-03，杭州遠(yuǎn)想醫(yī)療)，經(jīng)皮氧分壓檢測(cè)儀(TCM 400，丹麥雷度公司)，miRcute miRNA提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(北京天根生化科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1DFU的治療過程 所有DFU均給予常規(guī)的全身治療，包括抗感染、降壓、降糖、糾正低蛋白血癥、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)、改善下肢創(chuàng)面血液供應(yīng)等。并行創(chuàng)面清除術(shù)，去除變黑壞死軟組織以及骨組織?？筛鶕?jù)DFU具體情況，給予減壓、持續(xù)負(fù)壓吸引治療等。隨訪DFU病情變化，由糖尿病足多學(xué)科團(tuán)隊(duì)會(huì)商決定是否行截肢治療，記錄患者治療8周后創(chuàng)面完全愈合情況。

1.3.2臨床指標(biāo)的檢測(cè) 所有受試者禁食10 h后于次日早晨8 ∶00～8 ∶30空腹?fàn)顟B(tài)從肘部抽取靜脈血至抗凝管(抗凝劑為氟化鈉/EDTA/肝素，可根據(jù)檢查項(xiàng)目不同選擇不同抗凝劑)或非抗凝采集試管中，供測(cè)定血清白蛋白(albumin，ALB)、血糖、血脂、糖化血紅蛋白A1c(glycosylated hemoglobin A1c, HbA1c)、白細(xì)胞(white blood cell, WBC)計(jì)數(shù)、血紅蛋白(hemoglobin, Hb)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)、紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate, ESR)等指標(biāo)。采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血糖、血脂、ALB。其中空腹血糖(fasting plasma glucose, FPG)檢測(cè)采用葡萄糖氧化酶法，總膽固醇(total cholesterol, TCH)、三酰甘油(triglyceride, TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)檢測(cè)采用氧化酶聯(lián)比色法。此外，采用高壓液相色譜法檢測(cè)HbA1c，采用乳膠增強(qiáng)散射免疫比濁法測(cè)定CRP，采用魏氏法測(cè)定ESR。采用數(shù)碼照相結(jié)合Image J醫(yī)學(xué)圖像分析軟件測(cè)量皮膚潰瘍面積，使用多普勒血流探測(cè)儀測(cè)定ABI，應(yīng)用經(jīng)皮氧分壓檢測(cè)儀測(cè)定潰瘍周圍的經(jīng)皮氧分壓(percutaneous oxygen partial pressure, TcPO2)。

1.3.3外周血miR-155表達(dá)的檢測(cè) 應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)測(cè)定外周靜脈血中miR-155的表達(dá)。將2 ml靜脈血置于EDTA抗凝管中，離心后將獲得的血漿移入無RNA酶的1.5 ml EP管中，置于-80 ℃凍存。按miRcute miRNA提取分離試劑盒說明書操作，進(jìn)行RNA的提取。并使用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度。隨后按照miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒說明書操作，進(jìn)行cDNA的合成。最后按miRcute miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒說明書操作，進(jìn)行qRT-PCR。

miR-155引物序列：上游5′-CGGCGGTTAATGCTAATTGTGAT-3′；下游5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6引物序列：上游5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAA-3′，下游5′-CGCTTCACGAATTTGCCTGTCAT-3′。設(shè)置的反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性20 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共42個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分別計(jì)算miR-155相對(duì)表達(dá)量。每例樣本均重復(fù)3次，取平均值為最終結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 三組間臨床參數(shù)指標(biāo)比較三組間性別構(gòu)成、年齡、TCH、LDL-C水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。T2DM組和DFU組的FPG、HbA1c、TG水平均高于NC組，HDL-C水平則低于NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。T2DM組外周血miR-155表達(dá)水平低于NC組，DFU組外周血miR-155表達(dá)水平高于NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。另外，NC組與T2DM組間TcPO2、ABI、CRP、ESR、ALB、WBC計(jì)數(shù)、Hb差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。DFU組糖尿病病程、FPG、HbA1c、CRP、ESR、WBC計(jì)數(shù)以及外周血miR-155表達(dá)水平均高于T2DM組，而TcPO2、ABI、ALB、Hb均低于T2DM組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩組間TG、HDL-C水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.2 外周血miR-155表達(dá)水平與DFU臨床特征之間的關(guān)系以112例DFU患者外周血miR-155表達(dá)水平的中位數(shù)作為切割點(diǎn)，將DFU組再分為兩個(gè)亞組，其中外周血miR-155表達(dá)水平低于中位數(shù)者列為低表達(dá)組，將高于或等于中位數(shù)者列為高表達(dá)組。對(duì)高表達(dá)組與低表達(dá)組間足潰瘍的臨床特征進(jìn)行比較，結(jié)果顯示DFU患者外周血miR-155表達(dá)水平與8周后足潰瘍愈合率呈負(fù)相關(guān)(P=0.04)，與足潰瘍病程、足潰瘍Wagner分級(jí)呈正相關(guān)(P=0.02,P=0.01)，未見到miR-155表達(dá)水平與足潰瘍其他臨床特征之間存在相關(guān)性，見表2。

表2 DFU患者外周血miR-155表達(dá)水平與足潰瘍臨床特征之間的關(guān)系[n (%)]

2.3 三組中外周血miR-155表達(dá)與其他臨床參數(shù)指標(biāo)之間的相關(guān)性在NC組中，未觀察到外周血miR-155表達(dá)與其他臨床參數(shù)指標(biāo)之間存在明顯相關(guān)性(P>0.05)；在T2DM組中，外周血miR-155表達(dá)與FPG、HbA1c水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與其他指標(biāo)無顯著相關(guān)性(P>0.05)；在DFU組中，外周血miR-155表達(dá)與足潰瘍病程、足潰瘍Wagner分級(jí)、CRP、白細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)(P<0.05)，與其他指標(biāo)無顯著相關(guān)性(P>0.05)。見表3。

表3 三組中外周血miR-155表達(dá)與其他臨床參數(shù)指標(biāo)之間的相關(guān)性(r)

2.4 DFU的危險(xiǎn)因素分析在糖尿病患者中，以DFU作為因變量，分別以性別、年齡以及單因素Logistic回歸分析中獲得的所有P值<0.1的變量(包括糖尿病病程、FPG、HbA1c、TG、 LDL-C、HDL-C、ALB、TcPO2、ABI、CRP、WBC、 Hb、ESR、miR-155)為自變量進(jìn)行多元逐步Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)糖尿病病程、HbA1c、CRP、低TcPO2 、高表達(dá)miR-155均為DFU的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，見表4。

表4 DFU危險(xiǎn)因素的多元逐步Logistic回歸分析

3 討論

本研究顯示，與無DFU的T2DM患者比較，DFU患者外周血中miR-155表達(dá)水平明顯升高，高表達(dá)的miR-155不僅為DFU發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，也與DFU的Wagner分級(jí)、愈合率密切相關(guān)，miR-155高表達(dá)者DFU病情程度較重，愈合率較低。提示miR-155的高表達(dá)，不僅是DFU發(fā)病的強(qiáng)危險(xiǎn)因素，還可作為DFU病情評(píng)估、治療預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。

本組資料顯示，與糖耐量正常的對(duì)照人群比較，T2DM患者外周血miR-155表達(dá)水平明顯降低。相關(guān)分析顯示，在T2DM患者中，miR-155與FPG、HbA1c成負(fù)相關(guān)。動(dòng)物研究[9]顯示，miR-155的整體轉(zhuǎn)基因過度表達(dá)可改善小鼠的糖耐量和胰島素敏感性，導(dǎo)致低血糖。相反，小鼠miR-155缺乏會(huì)導(dǎo)致高血糖、糖耐量受損和肝臟、肌肉、脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗。臨床研究[10-11]顯示在T2DM患者的外周血漿以及單核細(xì)胞中，miR-155表達(dá)水平均較性別年齡匹配的糖耐量正常人群顯著降低。本研究結(jié)果與之一致。然而，在DFU組中，外周血miR-155表達(dá)水平與FPG、HbA1c無明顯相關(guān)性，推測(cè)原因可能是DFU患者中其他因素對(duì)miR-155表達(dá)的影響超過FPG、HbA1c所致。本研究還表明，在DFU組中，miR-155表達(dá)水平與反應(yīng)炎癥狀態(tài)指標(biāo)的CRP、ESR、WBC計(jì)數(shù)顯著正相關(guān)，提示DFU患者外周血miR-155的高表達(dá)與感染性炎癥狀態(tài)可能有關(guān)。此外，本研究未觀察到miR155表達(dá)水平與糖尿病病程之間存在相關(guān)性。

本研究中，DFU組足潰瘍的病程至少4周，為慢性難愈合創(chuàng)面。臨床特征表現(xiàn)為糖尿病病程長(zhǎng)，長(zhǎng)期血糖控制不佳，合并不同程度的脂代謝異常、周圍血管病變與感染性炎癥狀態(tài)。多因素回歸分析顯示，糖尿病病程、HbA1c、TcPO2、CRP為足潰瘍發(fā)生的獨(dú)立影響因素，與既往的研究[12]結(jié)果一致。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，與T2DM組患者相比，DFU組患者外周血miR-155水平明顯增高；miR-155表達(dá)水平與足潰瘍病程、Wagner分級(jí)呈正相關(guān)，與8周后足潰瘍愈合率呈負(fù)相關(guān)。多因素回歸分析顯示，高表達(dá)的miR-155為足潰瘍發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。提示miR-155可能參與DFU的發(fā)病過程，并可作為DFU病情嚴(yán)重程度以及預(yù)后判斷的標(biāo)志物。目前普遍認(rèn)為創(chuàng)面中存在持續(xù)和過度的炎癥狀態(tài)以及表皮中參與創(chuàng)面愈合的多種細(xì)胞功能受損是造成DFU難以愈合的重要影響因素[13]。研究[6]表明，在糖尿病鼠皮膚傷口中miR-155表達(dá)增加，miR-155既扮演著促炎癥效應(yīng)角色，又可通過下調(diào)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子7表達(dá)，影響角質(zhì)形成細(xì)胞的遷移和增殖，損害創(chuàng)面的再上皮化。而在敲除miR-155后，小鼠傷口組織中M1樣巨噬細(xì)胞減少，M2樣巨噬細(xì)胞和I型膠原沉積明顯增加，創(chuàng)面炎癥反應(yīng)減輕，修復(fù)能力增強(qiáng)[14]。另外，在糖尿病大鼠皮膚傷口模型中[6-7]，局部注射miR-155抑制劑干擾miR-155表達(dá)后，創(chuàng)面組織中T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞數(shù)量減少，白介素-1β、腫瘤壞死因子-α水平降低，炎癥反應(yīng)減輕，新生血管明顯增加，肉芽組織中膠原含量增加，排列更加規(guī)則，創(chuàng)面愈合加速。

總之，本研究顯示，2型糖尿病足潰瘍患者外周血miR-155表達(dá)水平增高，為DFU的獨(dú)立危險(xiǎn)因素并與DFU預(yù)后密切相關(guān)。本研究的不足之處主要包括：為單中心研究，樣本量相對(duì)較少，可能存在選擇偏倚，因此需要更多的研究來證實(shí)。此外，本研究也無法明確miR-155與DFU發(fā)病的因果關(guān)系。未來需要進(jìn)一步探討miR-155的作用機(jī)制以及評(píng)估m(xù)iR-155能否成為DFU的新治療靶點(diǎn)。