周園園，戴志娟，張淑君，李岳春，戴元榮，王 賀，吳海林，馮夢(mèng)晴，李校堃，黃曉暉，朱光輝

新型冠狀病毒疾病2019(coronavirus disease 2019, COVID-19)，由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)引起，已成為全球突發(fā)公共衛(wèi)生事件[1]?；颊咭园l(fā)熱為主要表現(xiàn)。嚴(yán)重者發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克等。確診患者死亡率達(dá)4.3 %[2]。目前尚無(wú)特效藥物，國(guó)家衛(wèi)健委先后發(fā)布了多版診療方案，推薦使用安宮牛黃丸和醒腦靜注射液，其組方中均含莪術(shù)[3]。莪術(shù)根莖提取的莪術(shù)油為莪術(shù)油注射液的主要成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗病原體等多種藥理作用。研究顯示SARS-CoV-2與SARS中的酶具有高水平的序列相似性[4]，SARS患者進(jìn)行中西醫(yī)結(jié)合治療(憋喘期，聯(lián)用莪術(shù)油注射液)，臨床癥狀嚴(yán)重程度顯著改善，重癥患者病死率低[5-7]。故推測(cè)莪術(shù)油注射液對(duì)SARS-CoV-2也可能有效?，F(xiàn)對(duì)莪術(shù)油注射液體內(nèi)外抗新型冠狀病毒作用進(jìn)行研究，評(píng)價(jià)該藥治療COVID-19的有效性和安全性，以期為COVID-19治療提供更多的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥物與細(xì)胞株 莪術(shù)油(浙江天瑞藥業(yè)有限公司，批號(hào)：5190527，濃度：1 000 μg /ml)；莪術(shù)油注射液(浙江天瑞藥業(yè)有限公司，莪術(shù)油含量10 ml ∶0.1 g，國(guó)藥準(zhǔn)字H20064312)。人腎上皮細(xì)胞株293 T(由中科院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院健康所惠贈(zèng))。

1.1.2試劑與儀器 轉(zhuǎn)染試劑Lipofiter 3.0[漢恒生物科技(上海)有限公司，貨號(hào)：HB-LF3-1000]；Opti-MEM(1X)(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，貨號(hào)：31985-070)；Renilla-Glo熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)(普洛麥格生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：E2720)；pHB、pAX 2、SARS-CoV-2 S、ACE 2-pcDNA 3.1由合肥中科普瑞昇生物醫(yī)藥科技有限公司構(gòu)建。細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(上海睿鈺生物科技有限公司，型號(hào)：IC1000)，酶標(biāo)儀(珀金埃爾默股份有限公司，型號(hào)：EnVision)。

1.2 莪術(shù)油體外抗新冠類(lèi)病毒作用實(shí)驗(yàn)采用Renilla-Glo熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)莪術(shù)油抗SARS-CoV-2類(lèi)病毒活性作用。

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮中取出凍存的293T細(xì)胞，37 ℃融化復(fù)蘇細(xì)胞，在超凈工作臺(tái)內(nèi)，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到含有2 ml培養(yǎng)基的無(wú)菌離心管中，800 r/min離心5 min，棄去上清液，加入適量DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，置于恒溫培養(yǎng)箱(培養(yǎng)條件為37 ℃、5 %CO2、相對(duì)濕度75%)中培養(yǎng)兩代，待測(cè)試。

1.2.2類(lèi)病毒及293T-ACE2細(xì)胞準(zhǔn)備 提前20～24 h將293 T細(xì)胞接種至6孔板中，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到60%～70%時(shí)，分別使用轉(zhuǎn)染試劑Lipofiter 3.0將3 μg質(zhì)粒[pHB：pAX 2：SARS-CoV-2 S(2 ∶2 ∶1)]和3 ug質(zhì)粒(ACE2-pcDNA 3.1)進(jìn)行包裝轉(zhuǎn)染，將6孔板在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h后收取病毒上清溶液，病毒立即使用或-80 ℃凍存保管。

1.2.3細(xì)胞消化 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后，用胰酶將293T-ACE2消化，用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行計(jì)數(shù)后，接種至96孔板，每孔體積為50 μl(25 000個(gè)細(xì)胞/孔)，在37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁。

1.2.4溶液制備 取莪術(shù)油50 μl，加入50 μl DMEM，先橫向梯度設(shè)置2×稀釋?zhuān)倏v向稀釋10倍，取10 μl加96孔板，重復(fù)3次。

1.2.5鋪板讀數(shù) 取出培養(yǎng)箱中貼壁12 h的96孔白色細(xì)胞培養(yǎng)板，取10 μl制備好的樣品溶液加入上述含有50 μl細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中,每個(gè)濃度梯度3個(gè)復(fù)孔，將培養(yǎng)板置于37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h后，每孔加入40 μl制備完成的類(lèi)病毒溶液，并加入終濃度6 μg/ml的增強(qiáng)劑，再將培養(yǎng)板置于37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后更換100 μl新鮮的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后檢測(cè)。將Renilla-Glo熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)試劑融化并放置至室溫，取出細(xì)胞培養(yǎng)板放置10 min使其平衡至室溫，在每孔中加入100 μl的檢測(cè)試劑，將培養(yǎng)板在軌道搖床上振搖2 min以誘導(dǎo)細(xì)胞裂解，培養(yǎng)板在室溫放置5 min以穩(wěn)定發(fā)光信號(hào)，在酶標(biāo)儀讀板器上檢測(cè)發(fā)光信號(hào)。酶標(biāo)儀檢測(cè)得出對(duì)應(yīng)的每孔熒光值(relative light unit，RLU)。計(jì)算不同濃度化合物對(duì)應(yīng)的相對(duì)熒光值RLU比率(%)采用下列公式：相對(duì)熒光值RLU比率(%)=RLUDRUG/RLUDMSO×100%。

1.3 莪術(shù)油注射液體內(nèi)抗新型冠狀病毒作用研究采用隨機(jī)、開(kāi)放、平行對(duì)照臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)。該項(xiàng)臨床研究申辦方為合肥市未來(lái)藥物開(kāi)發(fā)有限公司，并已獲得溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)編號(hào)：LCKY2020-11)。

1.3.1研究對(duì)象 選取2020年2月至3月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院甌江口院區(qū)住院且同意(簽署知情同意書(shū))參加本試驗(yàn)的新冠肺炎患者，隨機(jī)分配至試驗(yàn)組或?qū)φ战M，兩組等比例分配。

1.3.2納入和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：① 年齡≥ 18周歲，性別不限；② 咽拭子標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)新型冠狀病毒核酸陽(yáng)性，或咽拭子陰性伴肺部影像學(xué)未完全吸收；③ 臨床分型為普通型或重型；④ 已簽署知情同意書(shū)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：① 已知或懷疑對(duì)莪術(shù)油注射液組成成分過(guò)敏，或過(guò)敏體質(zhì)。② 輕型與危重型患者。③ 合并嚴(yán)重的肝臟疾病(如Child-Pugh評(píng)分≥C級(jí)，總膽紅素(total bilirubin，TBIL)≥2倍正常值上限，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase ，ALT)/ 谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)≥5倍正常值上限)。④ 合并有重度腎功能不全[估算的腎小球?yàn)V過(guò)率(estimated glomerular filtration rate，eGFR)≤30 ml/(min·1.73 m2)]或正在接受連續(xù)性腎臟替代治療、血液透析、腹膜透析。⑤ 妊娠期、哺乳期婦女或在試驗(yàn)期間及結(jié)束6個(gè)月內(nèi)有生育計(jì)劃。⑥ 入組前3個(gè)月內(nèi)參加過(guò)其他臨床試驗(yàn)。⑦ 根據(jù)研究者的判斷，具有不適合參加本試驗(yàn)的其他情況者。

1.3.3治療方法 所有受試者統(tǒng)一按照《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》[3]給予常規(guī)治療: 選用α-干擾素(每次500萬(wàn)U或相當(dāng)劑量，加入滅菌注射用水2 ml，每日2次霧化吸入)和利巴韋林(500 mg/次，每日2至3次靜脈輸注，療程不超過(guò)10 d)，同時(shí)給予有效氧療措施；試驗(yàn)組將在常規(guī)治療基礎(chǔ)上給予莪術(shù)油注射液20 ml于250 ml 0.9%氯化鈉注射液稀釋后緩慢滴注，每日1次，連續(xù)用藥7 d，不滿7 d出院則用至出院時(shí)(停藥后觀察期不滿14 d提前出院者需在滿14 d后回院訪視)。

1.3.4觀察指標(biāo) 主要療效指標(biāo)：① 咽拭子標(biāo)本實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)新型冠狀病毒核酸轉(zhuǎn)陰率(用藥結(jié)束后)和轉(zhuǎn)陰時(shí)間；② 臨床改善的時(shí)間(time to clinical improvement, TTCI)；③ 通過(guò)胸部CT檢查病變區(qū)域的大小變化情況；④ 退熱時(shí)間。

次要療效指標(biāo)：① 臨床恢復(fù)時(shí)間(time to clinical recovery，TTCR)定義：從開(kāi)始治療到發(fā)熱、呼吸頻率、血氧飽和度轉(zhuǎn)為正常和咳嗽癥狀消失，持續(xù)至少48 h。正常的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)：發(fā)熱：腋溫≤ 37 ℃；呼吸頻率：≤24次/min(室內(nèi)空氣下，如果患者吸氧，需注明氧療方式及濃度)；血氧飽和度：>93%(室內(nèi)空氣下，如果患者吸氧，需注明氧療方式及濃度)。② 病情進(jìn)展的病例比例參照《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第六版)》，病情分型由普通型轉(zhuǎn)為重型/危重型以及重型進(jìn)展為危重型的病例比例。③ 咳嗽消失率和消失時(shí)間：入組時(shí)存在咳嗽的受試者咳嗽癥狀消失的時(shí)間和病例比例。④ 全因死亡率。

安全性指標(biāo)：收集與監(jiān)測(cè)發(fā)生的不良反應(yīng)，靜脈滴注過(guò)快可有胸悶、面部潮紅、呼吸困難等癥狀。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理莪術(shù)油體外抗新型冠狀病毒作用實(shí)驗(yàn)運(yùn)用GraphPad 7.0 Prism軟件進(jìn)行ANOVA單因素方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。莪術(shù)油注射液體內(nèi)抗新型冠狀病毒作用研究采用描述性統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 莪術(shù)油體外抗新型冠狀病毒作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析用酶標(biāo)儀檢測(cè)0.39、0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μg/ml 莪術(shù)油處理后的SARS-CoV-2類(lèi)病毒細(xì)胞株(圖1)，結(jié)果顯示，隨著莪術(shù)油濃度增加，相對(duì)熒光值逐漸減弱，與0 μg/ml莪術(shù)油組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，IC50值為0.26 μg/ml(圖2)。

圖1 不同濃度莪術(shù)油誘導(dǎo)SARS-CoV-2類(lèi)病毒細(xì)胞后的活性與0 μg/ml莪術(shù)油組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖2 莪術(shù)油對(duì)SARS-CoV-2類(lèi)病毒的濃度抑制曲線

2.2 莪術(shù)油注射液體內(nèi)抗新型冠狀病毒作用研究結(jié)果分析

2.2.1患者入組及用藥情況 試驗(yàn)擬招募患者60例，因浙江省溫州市新冠疫情得到有效控制，研究實(shí)際入組COVID-19普通型患者4例，試驗(yàn)組和對(duì)照組各2例，兩組均為男性，入組時(shí)肝腎功能、生命體征均正常，其中試驗(yàn)組年齡大于對(duì)照組，試驗(yàn)組病例2表現(xiàn)為頻繁咳嗽，且無(wú)相關(guān)既往病史。根據(jù)患者診療進(jìn)程，試驗(yàn)組病例1、2分別使用莪術(shù)油注射液4天和7天。

2.2.2療效指標(biāo) 研究納入的所有患者體溫、呼吸均正常，試驗(yàn)組病例1糞便新型冠狀病毒核酸用藥后3 d轉(zhuǎn)陰，試驗(yàn)組病例2咳嗽癥狀明顯緩解，無(wú)1例發(fā)展為重癥。對(duì)照組咽拭子轉(zhuǎn)陰時(shí)間分別為5、7 d。所有患者肺部影像學(xué)均有不同程度吸收，以試驗(yàn)組病例2吸收較明顯(圖3)，3月1日左右下肺出現(xiàn)陰影，呈磨玻璃密度影，病灶里的肺間質(zhì)有些增厚，3月2日患者開(kāi)始接受莪術(shù)油注射液治療，3月8日復(fù)查，肺泡內(nèi)滲出液逐漸被吸收，陰影減小。出院后2、4周隨訪所有患者新型冠狀病毒核酸呈陰性，血常規(guī)、肝腎功能無(wú)異常，試驗(yàn)組病例2肺部影像學(xué)陰影逐漸消失，且肺間質(zhì)增厚改善。

圖3 試驗(yàn)組病例2肺部影像學(xué)(CT)變化A:3月1日；B:3月8日；C:3月24日

2.2.3安全性分析 在應(yīng)用莪術(shù)油注射液聯(lián)合常規(guī)治療過(guò)程中，血常規(guī)、肝腎功能等實(shí)驗(yàn)室檢查均未出現(xiàn)加重情況。與治療前比較，所有患者除原有的呼吸道癥狀之外，均未出現(xiàn)新的不適癥狀或加重體征情況。

3 討論

莪術(shù)油注射液具有顯著抗病毒功效(如流感病毒、呼吸道合胞病毒等)[8-10]，《浙江省抗新冠肺炎臨床診療用藥推薦目錄》推薦其為抗新冠肺炎藥物。秦宇雯 等[6]總結(jié)中藥莪術(shù)抗病毒的作用機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)其可能通過(guò)抑制病毒 NP 蛋白，調(diào)控 PI 3 K/Akt/mTOR 信號(hào)通路，直接滅活病毒，抑制相關(guān)炎癥因子，抗肺纖維化等途徑實(shí)現(xiàn)抗 COVID-19。推測(cè)莪術(shù)可降低新冠肺炎患者炎癥水平，改善患者咳嗽、發(fā)熱、肺部啰音等體征，同時(shí)在抑制病毒復(fù)制和感染，提升機(jī)體免疫力和改善患者肺功能損傷程度等方面發(fā)揮作用，且無(wú)激素類(lèi)藥物的不良反應(yīng)[6-7,11-13]。

本研究從細(xì)胞水平和臨床研究?jī)煞矫嫣接懥溯g(shù)油注射液抗新型冠狀病毒作用。通過(guò)體外制備SARS-CoV-2類(lèi)病毒細(xì)胞株，用9組不同濃度莪術(shù)油進(jìn)行處理，觀察和記錄細(xì)胞數(shù)及相對(duì)熒光值，計(jì)算IC50值為0.26 μg/ml(黃芪醇提取物的體外抗柯薩奇病毒效果與利巴韋林接近，其IC50值為(6.4±0.5)μg/ml，表明莪術(shù)油對(duì)SARS-CoV-2類(lèi)病毒活性有較強(qiáng)抑制作用，且具有濃度依賴(lài)性。莪術(shù)油注射液治療COVID-19的隨機(jī)開(kāi)放平行對(duì)照研究顯示，試驗(yàn)組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上聯(lián)用莪術(shù)油注射液，患者核酸轉(zhuǎn)陰時(shí)間縮短，可能改善SARS-CoV-2感染引起的咳嗽等癥狀，促進(jìn)SARS-CoV-2轉(zhuǎn)陰及肺部病灶吸收，降低肺損傷，并且相對(duì)安全。

綜上所述，體內(nèi)外研究顯示，莪術(shù)油注射液具有較強(qiáng)的抗新型冠狀病毒活性作用，對(duì)于COVID-19患者的救治可能具有重要的臨床價(jià)值。需要指出的是，由于項(xiàng)目啟動(dòng)時(shí)間晚，研究立項(xiàng)審批通過(guò)時(shí)國(guó)內(nèi)疫情已得到很好控制，實(shí)際可入組患者少，造成整體研究樣本量偏少。另外，因本研究納入患者所在病房為隔離病房，管控嚴(yán)格，入組患者詳細(xì)治療數(shù)據(jù)無(wú)法進(jìn)行充分記錄，致使部分原始研究數(shù)據(jù)缺失。且入組時(shí)樣本病程已較長(zhǎng)，故結(jié)果存在不確定性，確切的臨床療效尚需大樣本、前瞻性臨床研究進(jìn)行評(píng)價(jià)，如追蹤病毒的復(fù)陽(yáng)率、肺部影像學(xué)轉(zhuǎn)歸等。但基于現(xiàn)有莪術(shù)油的體內(nèi)外及藥理學(xué)研究，后期可擴(kuò)大莪術(shù)油注射液治療COVID-19臨床研究范圍，為莪術(shù)油等相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)應(yīng)用和COVID-19的治療提供有力的科學(xué)依據(jù)。