屈 直，王 芬，李志明，張燕娜，王玥慧

(1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院，北京 100078)

肺癌目前是世界上病死率占第一位的癌種[1]。其病因尚不明確,吸煙和空氣污染是兩個重要的危險因素。其他風險因素，如職業(yè)暴露(石棉、氡氣)，也在肺癌的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2-3]。 二陳湯是中西醫(yī)臨床治療肺癌痰瘀互結(jié)證的基本方，前期已有大量實驗研究表明了它具有一定的抑制肺癌生長的作用[4-7]。Hedgehog通路在肺癌中具有促進腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的作用[8]。本研究以二陳湯作為主要干預手段，以Lewis肺癌小鼠作為主要研究對象，采用免疫組織化學法、Western blot等方法對二陳湯如何通過及Hedgehog通路來干預小鼠腫瘤進行了進一步的研究，為二陳湯抗癌機制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及瘤株 造模采用雄性C57BL/6小鼠，平均體重16～18 g,6～8周齡，購自北京華阜康生物科技股份有限公司[實驗動物許可證號：SCXK(京)2014-0004]。于中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)研究所SPF級動物房進行飼養(yǎng)以及造模取樣。Lewis肺癌腫瘤株由中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)研究所提供。

1.2 實驗藥物 二陳湯由法半夏、陳皮各15 g，茯苓9 g，炙甘草6 g，生姜7 g，烏梅8 g組成(北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院提供)。根據(jù)人鼠劑量關(guān)系換算公式換算灌胃劑量，壓縮濃度至生藥含量為1.35 g/ml，冷凍保存?zhèn)溆谩Ｗ⑸溆庙樸K10 mg/瓶，批號AA1A7030B。

1.3 實驗試劑 GLI-1、SMO單克隆抗體，SHH多克隆抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號分別為66905-1-Ig、66851-1-Ig、20697-1-AP)；PTCH-1單克隆抗體(英國 Abcam 公司，貨號：ab53715)；β-肌動蛋白抗體(Proteintech group，貨號：Ag27042)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司，貨號：PC0020)。

1.4 實驗儀器 超凈工作臺(VD-650)；倒置顯微鏡(Olympus公司)；5810R 離心機(德國 Eppendorf 公司)；多功能酶標儀(美國Pro-mega公司)；DYCZ-24DH型電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；92-14860-00型凝膠成像系統(tǒng)(美國Alpha Innotech公司)；石蠟切片機(德國 Leica 公司)。

1.5 實驗方法

1.5.1 肺癌模型小鼠的建立及分組給藥：取3只荷瘤小鼠，脫頸椎法處死，于超凈工作臺中剝離瘤組織，取無壞死、生長良好的部分剪碎，制成Lewis細胞懸液，細胞濃度為1×107/ml，接種于小鼠右側(cè)腋窩皮下，0.2 ml/只。接種約5 d后，在小鼠右腋窩皮下可觸及綠豆粒大小的腫塊，標志造模成功。接種造模成功1 d后按隨機數(shù)字表法將小鼠分為模型組、中藥組、中藥聯(lián)合順鉑組、順鉑組，每組各10只。全部造模完畢后第2天開始給藥，模型組予以0.4 ml/20 g的0.9%氯化鈉溶液灌胃，1次/d，連續(xù)14 d；中藥組予0.4 ml/20 g二陳湯灌胃，1次/d，連續(xù)14 d；聯(lián)合組予以3 mg/kg順鉑溶液20 μl/20 g腹腔內(nèi)注射，1次/d，連用3 d，同時予以二陳湯灌胃；順鉑組予以3 mg/kg順鉑溶液20 μl/20 g腹腔內(nèi)注射，1次/d，連用3 d，同時予同等0.9%氯化鈉溶液灌胃，1次/d，連續(xù)14 d。

1.5.2 一般生存狀態(tài)觀察：每日灌胃時觀察小鼠一般狀態(tài)及習性行為情況，對小鼠的生存質(zhì)量進行評估。

1.5.3 血常規(guī)檢測：在最后一次灌胃給藥24 h后，對小鼠予以摘眼取血，保存至血常規(guī)EP管中，采用全自動血細胞分析儀進行血常規(guī)的測定。

1.5.4 免疫組化法檢測各組Lewis小鼠瘤組織中Hedgehog通路各蛋白的含量：將腫瘤組織進行切片、烘片后再進行脫蠟、水化。將制作好的切片先放入二甲苯Ⅰ浸泡10 min后放入二甲苯Ⅱ10 min脫蠟。然后依次放入不同濃度的乙醇溶液各10 min進行水化，水化完成后再用PBS洗3次，滴加3%H2O2，靜置10 min,PBS洗3次。將切片用枸櫞酸鈉溶液浸泡,再用微波爐修復后予以 PBS洗3次。滴加一抗后，4 ℃過夜。第2天室溫復溫后滴加二抗,再PBS洗3次。DAB顯色，PBS洗3次后復染、脫水用中性樹膠封片再進行免疫組化圖像分析。

1.5.5 Western blot法檢測各組Lewis小鼠瘤組織中SHH、SMO、PTCH-1和Gli-1蛋白的含量：使用蛋白提取試劑盒提取腫瘤組織蛋白，BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性后，冷卻上樣，凝膠電泳半干法轉(zhuǎn)入 PVDF膜后置于封閉緩沖液(搖床振蕩1 h)，分別加入目的蛋白一抗，4 ℃過夜，第2天TBST洗滌后進行二抗孵育，后用ECL顯影，進行灰度分析(Bio-Rad，USA)。

1.6 統(tǒng)計學方法 本實驗采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)資料進行處理，計量資料以均數(shù)±標準差表示。采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法；當數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布時則使用非參數(shù)檢驗進行分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠一般生存狀態(tài) 造模前各組小鼠一般狀態(tài)良好。然而造模后隨著各組小鼠腋下種植處出現(xiàn)不同大小的皮下腫塊，可觀察到各組小鼠出現(xiàn)了不同程度的狀態(tài)減退現(xiàn)象，如反應(yīng)遲鈍、活動力下降、進食量少等。順鉑組和聯(lián)合組的小鼠一般情況相較于模型組、中藥組要好。肉眼觀察可見順鉑組和聯(lián)合組腋下腫塊明顯較其他各組小。

2.2 各組小鼠血常規(guī)比較 治療后順鉑組、聯(lián)合組小鼠WBC、RBC較模型組和中藥組降低(P<0.05)，而聯(lián)合組RBC相較于順鉑組則有所增加，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。順鉑組、聯(lián)合組的血紅蛋白含量較順鉑組增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。順鉑組、聯(lián)合組的PLT較其他兩組都有明顯的升高(P<0.05)，但兩組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠血常規(guī)比較

2.3 二陳湯對Lewis 小鼠瘤組織中SHH、SMO、PTCH-1和Gli-1蛋白表達的影響 與模型組和中藥組相比，聯(lián)合組、順鉑組的Gli-1、SHH蛋白表達均明顯降低(P<0.05)。而中藥組和聯(lián)合組的PTCH-1蛋白相較其他兩組表達均降低(P<0.05)，提示二陳湯對Hedgehog通路的抑制作用可能與靶點PTCH-1有關(guān)。聯(lián)合組的SMO蛋白表達量為組間最低(P<0.05)，表明二陳湯與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用能起到更好的阻滯作用。但單純二陳湯中藥治療或者單純應(yīng)用順鉑治療可能對Hedgehog通路蛋白并不能達到全面覆蓋，因此聯(lián)合順鉑，可以使二陳湯達到增效減毒的效果。對比模型組，聯(lián)合組、順鉑組Gli-1、PTCH-1、SHH蛋白表達均明顯減少(P<0.05)，且與中藥組相比，聯(lián)合組Gli-1、PTCH-1、SMO、SHH蛋白表達水平均明顯減少(P<0.05)。見表2 (圖1、2)。

表2 各組小鼠腫瘤組織中蛋白表達量比較

圖1 二陳湯對小鼠腫瘤組織中SHH通路相關(guān)蛋白表達的影響

3 討 論

目前世界上由于腫瘤而導致患者死亡的惡性疾病中，肺癌患者的病死率排在第一位，每年約有180萬人死于肺癌，占因癌癥死亡病例總數(shù)的13%[3]，非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)為肺癌的主要病理分型(占85%)，其中又分為以肺腺癌和肺鱗狀細胞癌為主的多個病理亞型，肺腺癌始于產(chǎn)生黏液的肺腺細胞，約占非小細胞肺癌比例的40%[9]。雖然外科手術(shù)和內(nèi)科藥物治療領(lǐng)域的最新進展改善了NSCLC患者的發(fā)病率[10-11],然而NSCLC患者的存活率仍舊很低。造成NSCLC患者生存率低的一部分原因是肺癌的早期往往難以檢測，在確診時多數(shù)已經(jīng)存在轉(zhuǎn)移[12]，專家建議需根據(jù)患者的年齡和吸煙的包-年數(shù)來確定一部分滿足條件的煙民進行CT掃描定期篩查，有助于盡早發(fā)現(xiàn)病情并進行干預[13]。另一方面，由于晚期NSCLC由多個驅(qū)動基因的復雜調(diào)控，臨床上仍缺乏有效的治療靶點[12],新的治療靶點有待進一步探索。

中醫(yī)古籍中并無肺癌之名，它多以癥狀出現(xiàn)，它可以是咳嗽、喘證，可以是胸痹，也可以是懸飲，或以病機命名如肺積、息賁。本病病理因素以 “虛、痰、瘀”為主。初期多責之于痰、瘀等實證，而病情發(fā)展至中晚期則以氣虛、陰虛為主[14]。二陳湯原本出自宋代《太平惠民和劑局方》，方中半夏、橘紅皆以陳久者優(yōu)，而無過燥傷陰之弊得名。在臨床上肺癌患者凡是肺脾氣虛，兼見痰濕，癥見乏力納少、便溏、氣短言疏、痰多色白、惡心嘔吐等尤為適宜。明代李中梓云：“脾為生痰之源，肺為儲痰之器”，人身之脾胃主水濕的運化，肺臟主通調(diào)水道，肺脾協(xié)同作用以代謝運輸體內(nèi)的津液，今脾胃運化無力，且肺氣不利，則津液內(nèi)停不行，聚而成痰。故痰飲的治法除溫化、淡滲、攻逐、消導外總離不開調(diào)理肺脾。方中君藥半夏燥濕化痰，和胃降逆；臣以橘紅、茯苓之屬理氣燥濕化痰，健脾淡滲利濕，生姜以降逆止嘔；佐以烏梅收斂肺氣；使以甘草健脾和中化痰，兼調(diào)和諸藥。

Hedgehog信號通路是哺乳動物胚胎發(fā)育以及胚后細胞生長和分化的主要調(diào)節(jié)通路之一[15-16]。該通路在成年人類正常個體中基本上是沉默的，有時僅僅參與干細胞的維持以及人體組織的再生和修復[17-18]。然而，Hedgehog信號通路可在包括NSCLC在內(nèi)的多種腫瘤中均被異常激活，并且與肺癌的臨床進展密切相關(guān)。經(jīng)典的Hedgehog信號通路組成包括了配體蛋白SHH，膜受體蛋白PTCH和SMO，核轉(zhuǎn)錄因子Gli等。在正常人體環(huán)境中，其主要作用為誘導胚胎及干細胞發(fā)育，然而在肺癌病理過程中，它的異常激活則是肺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程以及后續(xù)侵襲和轉(zhuǎn)移到臨床上出現(xiàn)耐藥的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)Hedgehog信號通路不僅可以促進組織中的血管生成，導致VEGF、FGF、CD34等促血管生成因子表達增高[19]，還能抑制NSCLC的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及侵襲,增加了放化療的敏感性。蔣潔等[20]研究發(fā)現(xiàn)中藥單體苦參素可通過Hedgehog信號通路來抑制胰腺癌細胞的增殖和侵襲。

本研究結(jié)果顯示，各組Lewis荷瘤小鼠在腋下移植腫瘤細胞后均能很好的成瘤，相較于對照組，聯(lián)合組與順鉑組的小鼠瘤體大小、一般精神狀態(tài)要好。血常規(guī)示聯(lián)合組及順鉑組的小鼠WBC較其他組均有明顯的下降，而聯(lián)合組的血常規(guī)與順鉑組比較有所上升，提示二陳湯與順鉑聯(lián)用對改善鉑類藥物的不良反應(yīng)有一定作用。二陳湯的配伍靈活，可以根據(jù)病情的需要酌加益氣養(yǎng)陰、活血化瘀，以及行氣止痛，止嘔止吐等對癥治療中藥進行加減化裁，可對患者的不良反應(yīng)、一般生活狀況起到改善的作用。 實驗中發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組和中藥組均可以對Hedgehog通路中的Gli-1、SMO、SHH、PTCH-1蛋白的表達有一定的抑制作用。提示其通過抑制Hedgehog通路的信號轉(zhuǎn)導來影響腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥等方面是其可能的分子機制之一。