楊 濤，李佳思凡，靳圓圓，王水泉，牛淑亮

(新疆醫(yī)科大學，新疆 烏魯木齊830011)

急性骨骼肌損傷是由于患者“經(jīng)脈不通，血氣不行”，導致的 “氣滯血瘀”。消腫噴劑是以蘇木、梔子等為基礎方，采用現(xiàn)代工藝制成的中藥噴劑[1]，具有較好的活血化瘀止痛和抑制急性骨骼肌損傷組織炎性因子表達等作用[2]。為進一步明確消腫噴劑促進急性骨骼肌損傷炎癥修復的作用機制，研究炎癥在急性骨骼肌損傷修復過程中的作用機制，我們用脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導C2C12小鼠成肌細胞，造成體外細胞炎性模型，研究NO抑制劑(L-NAME)、NO供體(SNP)和消腫噴劑主藥對該體外炎癥模型炎癥因子IL-1β、IL-18及NLRP3相關蛋白表達的影響，報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞 C2C12小鼠成肌細胞來源于豐暉生物，細胞培養(yǎng)條件為DMEM(高糖)培養(yǎng)基+10%胎牛血清(FBS)+1%雙抗(PS)，37 ℃，5% CO2，飽和濕度。實驗細胞經(jīng)復蘇、傳代后，凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 消腫噴劑主藥含藥血清制備 參照文獻方法[3]，將蘇木、梔子、姜黃、乳香、沒藥按照5∶5∶3∶2∶2比例混合，制備消腫噴劑主藥含藥血清，備用。

1.3 主要實驗儀器 酶標儀(美國Bio-Rad公司，型號iMark)，PCR儀(美國Bio-Rad公司，型號MyCycler Thermal Cycler)，蛋白轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司，型號Mini-PROTEAN Tetra system)，電泳儀(北京六一公司，型號DYCZ-24DN)。

1.4 主要試劑 CCK-8細胞增殖/毒性檢測試劑盒購自全式金生物公司；LPS購自SIGMA公司；L-NAME購自美侖生物公司；SNP購自Sigma公司；Mouse IL-18 ELISA Kit試劑盒購自聯(lián)科生物公司；Mouse IL-1β ELISA Kit試劑盒購自聯(lián)科生物公司；Anti-ASC antibody購自博奧森公司；Anti-NALP3/CIAS1 antibody購自博奧森公司；Anti-Caspase-1 P10 antibody購自博奧森公司。

1.5 炎癥模型評估 參照文獻方法[4-5]，LPS干預C2C12細胞，進行體外炎癥模型造模。取生長狀態(tài)良好匯合率達90%的C2C12細胞，用完全培養(yǎng)基制備成5×104個/ml單細胞懸液，接種至96孔板中(100 μl/孔，即5×103個/孔)。細胞培養(yǎng)24 h貼壁后，分為空白組和LPS干預組兩組，每組5個重復；干預完成后，棄去孔中培養(yǎng)基，每孔加入100 μl配置好的10% CCK-8溶液，置于培養(yǎng)箱中37 ℃孵育，1 h后酶標儀450 nm波長檢測OD值，并收集細胞上清，進行IL-1β、IL-18檢測。

1.6 炎癥模型實驗分組及干預方法 分為空白對照組、LPS干預組、NO抑制組、NO激動組和消腫噴劑主藥含藥血清組(含藥血清組)五組。

空白對照組正常培養(yǎng)6 h；LPS干預組：LPS(100 ng/ml)干預6 h；NO抑制組：LPS(100 ng/ml)+L-NAME(2.7 μg/ml)干預6 h；NO激動組：LPS(100 ng/ml)+SNP(8.94 μg/ml)干預6 h；含藥血清組：LPS(100 ng/ml)+含藥血清干預6 h。

1.7 ELISA試劑盒檢測IL-1β、IL-18蛋白表達 按炎癥模型實驗分組及干預后模式，收集細胞培養(yǎng)上清，進行IL-1β、IL-18檢測。

1.8 qRT-PCR檢測ASC、NLRP3、Caspase-1基因表達情況 按照實驗分組及干預模式，棄去每組細胞瓶中的培養(yǎng)基，加入1 ml Trizol消化細胞，使Trizol平鋪在細胞層面上，反復搖晃細胞培養(yǎng)瓶，直至細胞消化下來，裝入1.5 ml EP管中。后續(xù)實驗按照qRT-PCR試劑盒說明操作。

1.9 Western blot檢測ASC、NLRP3、Caspase-1蛋白的表達情況 按照實驗分組及干預模式，棄去每組細胞瓶中的培養(yǎng)基，加入3 ml無菌的PBS緩沖液反復沖洗2遍，棄去PBS緩沖液，用胰酶消化細胞。離心后棄去上清留細胞沉淀，用5 ml無菌PBS洗1遍后收集細胞。后續(xù)按照Western blot試劑盒說明操作。

1.10 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，用t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 炎癥模型評估 LPS干預后，C2C12細胞增殖及細胞上清IL-1β、IL-18表達情況，見表1。LPS干預組與空白對照組OD值比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；細胞上清IL-1β比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；IL-18表達比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表1 LPS對各組C2C12細胞增殖及IL-1β、IL-18的影響

2.2 LPS、L-NAME、SNP和消腫噴劑主藥含藥血清對C2C12細胞上清中IL-1β、IL-18含量的影響 見表2。按照實驗分組，分別應用LPS、LPS+L-NAME、LPS+SNP和消腫噴劑主藥含藥血清干預后，ELISA檢測各組C2C12細胞上清中IL-1β、IL-18含量結(jié)果。

表2 各組C2C12細胞上清中IL-1β、IL-18含量比較(pg/ml)

IL-1β含量比較，空白對照組與各干預組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；LPS干預組與各組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；NO激動組與含藥血清組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

IL-18含量比較，空白對照組與各干預組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；LPS干預組與NO激動組、含藥血清組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與NO抑制組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；NO激動組與含藥血清組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 LPS、L-NAME、SNP和消腫噴劑主藥含藥血清對C2C12細胞中ASC、Caspase-1、NLRP3 基因表達和蛋白表達水平的影響 按照實驗分組，分別應用LPS、LPS+L-NAME、LPS+SNP和消腫噴劑主藥含藥血清干預后，qRT-PCR檢測小鼠骨骼肌成肌細胞ASC、Caspase-1和NLRP3 mRNA表達水平，見表3。Western blot檢測結(jié)果各組小鼠骨骼肌成肌細胞ASC、Caspase-1和NLRP3 蛋白水平，見表4。

表3 各組C2CL2細胞中ASC、Caspase-1、NLRP3 mRNA表達水平比較

表4 各組C2CL2細胞中ASC、Caspase-1、NLRP3蛋白水平比較

ASC mRNA表達水平，空白對照組與LPS干預組、NO抑制組、NO激動組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與含藥血清組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；LPS干預組與NO抑制組、NO激動組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與含藥血清組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；NO激動組與含藥血清組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

Caspase-1及NLRP3 mRNA表達水平，空白對照組與各干預組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；LPS干預組與各組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

ASC 蛋白水平，空白對照組與LPS干預組、NO抑制組、NO激動組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與含藥血清組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；LPS干預組與NO抑制組、NO激動組、含藥血清組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；NO激動組與含藥血清組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

空白對照組與各干預組Caspase-1、NLRP3蛋白水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；LPS干預組與各組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討 論

外因可致經(jīng)筋受損，氣機不暢，筋肉失于濡養(yǎng)，“凝血蘊里不散”，發(fā)為紅腫熱痛。中醫(yī)的“筋”實指解剖學肌肉[6]，因此急性骨骼肌損傷是由于“經(jīng)脈不通，血氣不行”，導致的 “氣滯血瘀”。

消腫噴劑主藥蘇木、梔子、姜黃、乳香、沒藥等具有較強的活血、祛瘀、行氣功效[1]。NO是由L-精氨酸合成的信號分子[7-9],NLRP3炎癥小體是由ASC、Caspase-1、NLRP3組成的多蛋白復合體，炎癥刺激能夠誘導NLRP3炎性小體發(fā)生寡聚化，同時募集相關反應蛋白[10-12]。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，消腫噴劑主藥蘇木乙醇提取物caesppanin A和tectorigenin，能夠顯著抑制LPS誘導的小鼠單核巨噬細胞白血病細胞釋放NO,發(fā)揮抗炎作用[13];梔子主要有效成分藏紅花素能夠抑制類風濕性關節(jié)炎大鼠模型中一氧化氮合酶(iNOS)的產(chǎn)生和血清TNF-α、IL-1β和 IL-6表達[14],梔子苷通過NLRP3/ASC/Caspase-1途徑，抑制系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠模型，炎癥細胞浸潤、IL-1β、IL-18等炎癥因子產(chǎn)生[15]；姜黃素能夠通過調(diào)控SIRT1激活途徑[16]和線粒體介導的內(nèi)源性途徑[17]影響炎癥反應；乳香、沒藥能夠通過抑制 NF-κB和MAPK 信號通路[18-20]的活性等抑制炎性介質(zhì)的釋放。

為了進一步研究消腫噴劑促進急性骨骼肌損傷炎癥修復的作用機制及NO在急性骨骼肌損傷修復過程中的作用機制，我們進行了消腫噴劑主藥對體外炎癥模型IL-1β、IL-18及NLRP3相關蛋白表達影響的實驗研究。

實驗中我們應用LPS干預C2C12細胞，成功復制了體外炎癥模型。分別應用NO抑制劑L-NAME、NO激動劑SNP以及消腫噴劑主藥含藥血清對造模細胞進行干預。發(fā)現(xiàn)LPS干預C2C12細胞，造成體外炎癥模型，IL-1β、IL-18表達明顯。應用NO抑制劑L-NAME，抑制NO表達，IL-1β、IL-18表達明顯提高，而應用NO活化劑SNP，進一步活化NO表達，IL-1β、IL-18表達明顯降低，應用消腫噴劑主藥含藥血清干預C2C12細胞外炎癥模型，能夠顯著降低IL-1β、IL-18表達；qRT-PCR檢測小鼠骨骼肌成肌細胞ASC、Caspase-1和NLRP3 mRNA表達水平以及Western blot檢測結(jié)果小鼠骨骼肌成肌細胞ASC、Caspase-1和NLRP3 蛋白水平發(fā)現(xiàn)，LPS誘導C2C12細胞體外炎癥模型，應用NO抑制劑L-NAME和NO活化劑SNP，ASC、Caspase-1和NLRP3 mRNA表達水平和蛋白水平均明顯提高L-NAME或降低SNP，消腫噴劑主藥含藥血清有類似SNP作用，能夠顯著降低ASC、Caspase-1和NLRP3 mRNA和蛋白表達。

基于以上實驗我們推斷，LPS激活NO-NLRP3-IL炎癥軸，誘導建立C2C12細胞體外炎癥模型。NO通過NO/ASC/Caspase-1/NLRP3/IL-1β/IL-18軸，調(diào)控骨骼肌體外炎癥模型炎癥因子表達,消腫噴劑可能通過干預NO表達，減輕炎癥反應，促進骨骼肌損傷修復。