石金杰 劉宏瀟

(1.北京中醫(yī)藥大學2019級碩士研究生,北京 100029；2.中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院風濕病科，北京 100053)

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)多發(fā)生于青壯年男性群體，是以中軸關節(jié)附著點炎癥為主要表現的慢性免疫性炎性疾病，嚴重者可引起脊柱強直和纖維化，造成不同程度多系統(tǒng)病變。我國AS患病率約為0.3%，具有遺傳性，有較高的致殘率，嚴重影響患者生活質量，晚期發(fā)生脊柱強直、關節(jié)畸形后病情不可逆轉，因此減少致殘率的關鍵在于早診斷、早治療[1-3]?，F代生物制劑雖可有效抑制炎癥，但價格高，不易儲存，且在新骨形成方面的作用不甚理想。大量研究表明，中醫(yī)藥治療AS有一定的特色和優(yōu)勢，可從整體出發(fā)，辨證論治，因其個體化方案、多靶點、副作用少、價格居中的特點，逐漸成為當今研究治療AS新型藥物的重要方向。

淫羊藿始載于《神農本草經》，為小檗科植物，性溫，味辛、甘，入腎、肝經，有溫腎壯陽、強筋健骨、祛風除濕作用[4]?，F代藥理學研究表明，淫羊藿具有免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗氧化等多種藥理活性[5]，作為補腎類代表性藥物，臨床治療AS療效明確。因此，本研究從網絡藥理學角度出發(fā)，探討淫羊藿治療AS的作用機制。

1 材料與方法

1.1 淫羊藿活性成分和作用靶點的查詢與篩選 運用中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)，搜索關鍵詞“淫羊藿”，設定口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18，進一步篩選其活性成分及對應的潛在作用靶點。為標準化靶點信息，利用Perl軟件和Uniprot(https://www.uniprot.org)數據庫，將活性成分作用的靶點進行規(guī)范，獲取淫羊藿靶點。

1.2 AS疾病靶點篩選 以“Ankylosing Spondylitis”為檢索詞分別在GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://www.omim.org/)數據庫進行疾病基因靶點的查詢篩選，獲取AS目前確定的疾病靶點。

1.3 淫羊藿-AS交集靶點獲取及藥物-活性成分-靶點-疾病網絡構建 利用韋恩在線繪制網站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)獲得淫羊藿靶點與AS疾病靶點的交集靶點。將淫羊藿活性成分及淫羊藿與AS的交集靶點導入Cytoscape 3.7.1軟件，進行藥物-活性成分-靶點-疾病網絡構建及可視化，并進行拓撲分析，再次篩選淫羊藿治療AS的主要活性成分。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡構建 將交集靶點輸入STRING 11.0數據庫(https://string-db.org)構建 PPI網絡模型，生物種類設定為“Homo sapiens”，設置medium confidence參數為0.9，去除邊緣游離蛋白，其余設置均為默認設置。利用Cytoscape 3.7.1軟件的分析插件MCODE對PPI網絡圖的拓撲屬性分析和功能模塊進行分析，得到淫羊藿治療AS的核心靶點。

1.5 基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 利用Metascape(https://metascape.org)平臺，將獲得的交集靶點輸入該平臺，以P<0.05為篩選條件，得到GO、KEGG富集分析結果，最終借助微生信平臺(https://www.bioinformatics.com.cn/)可視化。

2 結果

2.1 淫羊藿活性成分及作用靶點的獲取 經藥代動力學[吸收(Absorption)、分布(Distribution)、代謝(Metabolism)、排泄(Excretion)，ADME]分析后，獲取淫羊藿活性成分23種(見表1)，淫羊藿作用靶點201個。

2.2 AS疾病靶點的獲取 合并GeneCards、OMIM數據庫得到的疾病靶點，并刪除重復靶點，最終得到2771個AS疾病靶點。

2.3 淫羊藿-AS交集靶點獲取及藥物-活性成分-靶點-疾病網絡圖 將篩選的淫羊藿與AS交集靶點繪制韋恩圖，最終得到68個交集靶點(見圖1)。運用Cytoscape 3.7.1軟件獲得藥物-活性成分-靶點-疾病網絡圖及可視化(見圖2)，深藍色橢圓形表示中藥淫羊藿，藍色菱形表示AS，黃色方形表示淫羊藿的活性成分，綠色橢圓形表示AS與淫羊藿的交集靶點。運用Cytoscape 3.7.1軟件中Network Analyzer工具對其進行拓撲分析，得到連接度(Degree)、緊密度 (closeness centrality, CC) 及介度 (betweeness centrality,BC)結果。靶點之間邊的數量為靶點的Degree值，篩選Degree值前5的活性成分為淫羊藿治療AS的核心活性成分(見表2)。

表1 淫羊藿活性成分

圖1 淫羊藿-AS交集靶點韋恩圖

圖2 藥物-活性成分-靶點-疾病網絡圖

表2 淫羊藿治療AS的核心活性成分

2.4 PPI網絡構建及分析 將68個交集靶點輸入到STRING 11.0平臺，得到PPI網絡(見圖3)。運用Cytoscape 3.7.1軟件對其進行拓撲分析Degree值，以Degree值為標準，圖中節(jié)點顏色越深、大小越大表示該靶點的Degree值越高，與其他靶點相關性越大,篩選Degree值前10的靶點為淫羊藿治療AS的核心靶點，即白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF)、CXC趨化因子配體8(CXCL8)、IL-1β、血管內皮生長因子A(VEGFA)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、CC趨化因子配體2(CCL2)、IL-10、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、表皮生長因子受體(EGFR)為PPI網絡圖中的核心靶點。

圖3 PPI網絡圖

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 將上述68個交集靶點導入Metascape數據庫進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，將所得結果可視化。獲得1070條GO功能條目(P<0.05)，包括1291個生物過程(BP)、56個細胞組分(CC)、82個分子功能(MF)；KEGG通路富集分析獲得240條通路。以P值為標準，-LogP值越大表明富集程度越大，篩選每部分顯著性前10的條目繪制GO功能富集分析條形圖(見圖4)和顯著性前20的通路繪制KEGG通路富集分析條形圖(見圖5)。

由上述結果可知，BP與對脂多糖的反應(response to lipopolysaccharide)、對細菌起源的分子的反應(response to molecule of bacterial origin)、對細菌的反應(response to bacterium)、炎性反應調節(jié)(regulation of inflammatory response)、防御反應調節(jié)(regulation of defense response)等相關，CC與囊泡腔(vesicle lumen)、薄膜筏(membrane raft)、膜微區(qū)(membrane microdomain)、分泌顆粒腔(secretory granule lumen)、胞質囊腔(cytoplasmic vesicle lumen)等相關，MF與細胞因子活性(cytokine activity)、細胞因子受體結合(cytokine receptor binding)、受體配體活性(receptor ligand activity)、信號受體激活劑活性(signaling receptor activator activity)、信號受體調節(jié)劑活性(signaling receptor regulator activity)等相關，推測淫羊藿的活性成分主要通過調節(jié)以上功能來治療AS。

KEGG通路富集分析結果主要富集在IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、晚期糖基化終末產物-晚期糖基化終末產物受體(AGE-RAGE)信號通路、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、流體剪切應力和動脈粥樣硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、利什曼病(Leishmania infection)、細胞因子-細胞因子受體相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)。此外與AS相關的通路還有輔助性T 淋巴細胞17(Th17)細胞分化信號通路、核轉錄因子-κB(NF-κB)信號通路、T細胞受體信號通路等通路。

圖4 GO功能富集分析條形圖

圖5 KEGG通路富集分析條形圖

3 討論

中醫(yī)學認為，AS屬腎痹、骨痹、大僂范疇。腎主骨生髓，若先天稟賦不足，腎氣虛衰，風、寒、濕等外邪深侵腎督，督脈失養(yǎng)，阻滯經絡、脊柱、關節(jié)等處，則發(fā)而為痹[6]，臨床可表現為關節(jié)屈伸不利、腰背疼痛、行動不便等癥狀。腎為先天之本，補腎類藥物可調節(jié)人體免疫，平衡免疫網絡。AS根本病機以腎虛為本，補腎強督法為基本治則貫穿始終。淫羊藿溫腎壯陽，強筋骨，祛風濕，是治療AS補腎方中的代表藥物。

炎癥損傷和新骨形成是AS發(fā)病甚至致殘的重要機制，因此控制炎癥、延緩新骨形成具有重要的臨床意義，也是治療AS的首要目標?，F代藥理學研究發(fā)現，淫羊藿可通過調節(jié)Th17的分化及IL-17的表達水平,達到控制AS炎癥的作用[7]。本研究發(fā)現，淫羊藿主要通過槲皮素、木犀草素、山奈酚、8-(3-甲基丁-2-烯基)-2-苯基色酮、脫水淫羊藿素、“C-Homoerythrinan,1,6-didehydro-3,15,16-trimethoxy-,(3-beta.)-”、淫羊藿苷等核心活性成分作用于IL-6、TNF、趨化因子CXCL8、IL-1β、VEGFA、MAPK1、CCL2、IL-10、ICAM-1、EGFR等核心靶點，從而達到發(fā)揮抑制炎癥、抗纖維化、保護軟骨的作用[8]。細胞因子在免疫反應中交織成網絡并影響和調節(jié)細胞間的免疫應答，大量研究表明，細胞因子網絡異常是AS病理機制的關鍵，在AS病理進展過程中發(fā)揮重要作用[9]。TNF及處于其下游的IL-6是各類脊柱關節(jié)病的主要炎癥介質，VEGF、IL-10、IL-1等細胞因子與AS疾病活動均相關。研究發(fā)現，槲皮素、木犀草素、山奈酚可通過抑制IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的表達水平發(fā)揮抗炎作用[10-11]。木犀草素能降低由 TNF介導的IL-6、IL-8 、VEGF的表達，也可能通過NF-κB信號通路從而抑制免疫而產生抗炎作用[12]。吳漢軍等[13]研究發(fā)現，木犀草素抑制小鼠T淋巴細胞增殖和活化的作用機制可能與抑制IL-2 mRNA、干擾素γ(INF-γ)mRNA的表達有關。淫羊藿苷在控制炎癥和延緩新骨形成方面發(fā)揮著重要作用，首先在控制炎癥方面，淫羊藿苷可以影響T淋巴細胞的功能,抑制Th1/Th17軸應答而控制炎癥發(fā)展；在延緩新骨形成方面，淫羊藿苷可以通過調控細胞因子骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)、轉化生長因子β1(TGF-β1)而影響成纖維細胞向成骨型的分化[14]。

GO功能富集展示了淫羊藿治療AS的靶蛋白在細胞內的存在位點、潛在分子及生物學過程。KEGG通路富集分析顯示，淫羊藿治療AS的生物學通路主要作用于IL-17信號通路、AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、NF-κB信號通路、Th17細胞分化信號通路等。Th17/IL-17炎癥軸在AS炎癥中發(fā)揮了十分重要的作用[15-16]。炎癥細胞因子IL-17通過IL-6積累中性粒細胞，促使急性炎癥的發(fā)生，且有研究證實男性AS患者IL-17水平比女性患者高表達[17]。AGE-RAGE 的相互作用也在IL-17免疫反應中發(fā)揮作用，AGE 通過介導 RAGE 表達上調，使IL-17A的分泌增加，從而促進炎癥的發(fā)生[18]。TNF-α在AS患者的外周血中高表達，可造成患者關節(jié)局部一系列炎癥反應，而IL-17A已被證明能增強TNF介導的關節(jié)炎癥和組織破壞能力，加強破骨細胞的活性和溶骨作用，從而損害關節(jié)[19]。多項研究證實，AS患者的血液呈高凝狀態(tài)，主要機制與TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17等細胞因子紊亂和NF-κB信號通路之間的相互作用相關[20]。

本研究從淫羊藿的物質基礎出發(fā)，從生物信息學角度預測分析其核心活性成分槲皮素、木犀草素、山奈酚、淫羊藿苷等潛在活性成分可通過調控IL-17信號通路、TNF信號通路、NF-κB信號通路等多靶點、多途徑影響AS疾病進展，可為中藥新藥的研發(fā)和臨床治療AS提供研究基礎和創(chuàng)新思路。