邵 娟，白淑瑋，田蘊霖

(西安市人民醫(yī)院 西安市第四醫(yī)院，陜西 西安710004)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy,DR)是目前發(fā)達國家成年人視力喪失的主要原因之一，越來越多的2型糖尿病患者出現(xiàn)DR，包括高血糖、胰島素抵抗和胰島素相對缺乏，目前可用的治療方法有限[1]。DR的第一個臨床特征是玻璃體視網(wǎng)膜微血管異常[2]，最初的跡象是非增殖性的,例如血管破裂、毛細血管擴張功能障礙和微動脈瘤等[3]。此外，玻璃體通透性增加和變性會導(dǎo)致DR和視力障礙的發(fā)生。玻璃體的通透屏障包括血水屏障和血視網(wǎng)膜屏障，可以保護眼睛免受炎癥細胞和血液成分的侵害[4]。這些屏障管理視網(wǎng)膜的血液供應(yīng)，并負責(zé)神經(jīng)視網(wǎng)膜的穩(wěn)態(tài)。細胞間緊密連接有助于形成嚴格調(diào)節(jié)的擴散屏障,從而產(chǎn)生高選擇性滲透性[5]。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶的非吞噬細胞氧化酶(Non-phagocytic cell oxidase,Nox)是線粒體外活性氧(Reactive oxygen species,ROS)生成的主要來源[6]。Nox由膜結(jié)合亞基、胞質(zhì)亞基和小G蛋白Rac組成。研究[7]表明，血管NADPH氧化酶亞型的失調(diào)與DR的發(fā)展和Nox異構(gòu)體有關(guān)，吞噬細胞樣NADPH氧化酶-2(Nox2)是ROS的主要胞質(zhì)來源，Nox2在DR的發(fā)展中起關(guān)鍵作用。高遷移率族蛋白1(High mobility group box-1 protein,HMGB1)是一種非組蛋白DNA結(jié)合核蛋白，在染色質(zhì)組織和轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起重要作用[8]。大量證據(jù)表明HMGB1在介導(dǎo)炎癥、血視網(wǎng)膜屏障破壞、氧化應(yīng)激、細胞凋亡和糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)病變中具有重要意義[9]。然而，DR中HMGB1和ROS生成機制仍不清楚。根據(jù)上述相關(guān)研究，我們假設(shè)了一種新機制，該機制描述了糖尿病視網(wǎng)膜微環(huán)境中HMGB1和Nox衍生的ROS之間的相互增強，這可能作為糖尿病誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜電圖波幅和玻璃體的通透性發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，本研究的目的是探討HMGB1和NADPH氧化酶衍生活性氧相互增強對視網(wǎng)膜電圖波幅和玻璃體通透性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗大鼠：40只雄性SD大鼠(8～9周齡，200～220 g)購自武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物實驗中心，許可證號SYXK(鄂)2020-0027。于標準實驗室環(huán)境[溫度(25±2)℃，濕度45%～65%，12 h循環(huán)光照和黑暗],自由進食飼料、飲水。所有動物程序均按照視覺和眼科研究協(xié)會(ARVO)關(guān)于在眼科和視覺研究中使用動物的聲明進行，并得到動物科學(xué)院機構(gòu)動物護理和使用委員會的批準。

1.1.2 其他材料：夾竹桃素(購自Sigma-Aldrich)，檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5)(購自Sigma-Aldrich)，2’-7’-二氯熒光素-二乙酸酯(DCFH-DA，購自北京百奧萊博科技有限公司)，Spectra Max Gemini XPS 熒光酶標儀(購自美國Molecular Devices),gp91 phox(Nox2)、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1[poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1]和Caspase 3抗體(均購自圣克魯斯生物技術(shù)公司)，高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(購自美國伯樂)，高性能cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、YBR Green/ROX qPCR Master Mix[均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司]，牛血清白蛋白(Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate,FITC-BSA，購自美國Sigma公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大鼠DR模型的誘發(fā)：30只大鼠禁食過夜，將鏈脲佐菌素(STZ)55 mg/kg溶于10 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5)，于腹膜內(nèi)注射。如果大鼠的血糖高于250 mg/dl，則認為患有糖尿病，持續(xù)3周誘導(dǎo)DR模型。48～72 h后尾靜脈采血，全血血糖≥16.7 mmol/L，尿糖～，維持1周以上確定為DR模型建立。

1.2.2 實驗分組：將實驗大鼠分為對照組(未做任何處理的SD大鼠，n=10)、DR模型組(n=10)、HMGB1注射組(注射5 ng/5 μl重組HMGB1滅菌溶液的DR大鼠，n=10)、ROS抑制劑組(給予ROS抑制劑-夾竹桃素飲用水的DR大鼠，n=10)四組。

1.2.3 ROS檢測：使用2’-7’-二氯熒光素-二乙酸酯(DCFH-DA)檢測視網(wǎng)膜組織勻漿中ROS的生成，使用玻璃勻漿器在PBS中勻漿視網(wǎng)膜。將含有20 μg蛋白質(zhì)在PBS中稀釋的樣品與5 μmol/L DCFH-DA黑暗孵育15 min。使用Spectra Max Gemini XPS 熒光酶標儀檢測熒光，每15 min測量1次，持續(xù)1 h，激發(fā)和發(fā)射波長分別為488、525 nm。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡分析：視網(wǎng)膜和細胞裂解液在蛋白質(zhì)裂解緩沖液(30 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5、5 mmol/L EDTA,1 % Triton X-100、250 mmol/L蔗糖、1 mmol/L釩酸鈉和蛋白酶抑制劑混合物)中勻漿。裂解物在4 ℃下以14 000 g離心15 min，收集上清，上樣蛋白質(zhì)(25～50 μg)進行SDS-PAGE電泳，結(jié)束后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。應(yīng)用小鼠抗大鼠Nox2單克隆抗體(1∶400)、小鼠抗大鼠HMGB1單克隆抗體(1∶400)、小鼠抗大鼠Occludin單克隆抗體(1∶400)和小鼠抗大鼠ZO-1單克隆抗體(1∶40)。剝離膜后用β-肌動蛋白重新探測評估泳道加載控制。使用高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)使條帶可視化，并應(yīng)用Gene Tools軟件量化強度。

1.2.5 實時反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測大鼠視網(wǎng)膜組織PARP-1、Caspase 3 mRNA表達：按照美國Molecular Research Center(MRC)公司的TRIZOL試劑說明書從視網(wǎng)膜中提取總RNA。使用高性能cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以1 μg RNA合成cDNA；同時用SYBR Green/ROX qPCR Master Mix進行RT-PCR。標準PCR條件：50 ℃、2 min和95 ℃、10 min，40個循環(huán)，95 ℃ 延伸15 s，60 ℃延伸1 min。自動調(diào)整閾值線至與擴增曲線線性部分中的擴增線相交，自動記錄循環(huán)至閾值(CT)值。mRNA以β-肌動蛋白為內(nèi)參，計算標準化后的ΔΔCT值表示mRNA的相對表達量。

1.2.6 視網(wǎng)膜電圖檢查：大鼠暗適應(yīng)過夜(>12 h)，腹腔注射戊巴比妥鈉(65 mg/kg)麻醉，0.5%鹽酸丙胺卡因滴眼液進行角膜表面麻醉，復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳。將圓形角膜電極置于大鼠雙側(cè)角膜表面，不銹鋼針參比電極插入大鼠耳后皮下，接地電極刺入大鼠尾部皮下端(在暗紅燈下進行上述操作)。顯示屏基線穩(wěn)定后，記錄視網(wǎng)膜電圖(Electroretinogram,ERG)的a波和b波的振幅變化。

1.2.7 玻璃體通透性評估：將異硫氰酸熒光素標記的牛血清白蛋白(FITC-BSA)溶解在磷酸鹽緩沖液(PBS)中，通過尾靜脈灌注大鼠。灌注1 h后，立即摘除眼球，用4%多聚甲醛中固定2 h。解剖視網(wǎng)膜，通過日本奧林巴斯熒光顯微鏡BX53觀察，放大倍數(shù)100倍。實驗至少重復(fù)3次。根據(jù)正常大鼠血漿中獲得的FITC-BSA標準曲線，收集血漿并用熒光分光光度計測定熒光強度。

2 結(jié) 果

2.1 四組大鼠視網(wǎng)膜ROS水平比較 通過DCFH-DA檢測大鼠視網(wǎng)膜組織勻漿中ROS的生成，DR模型組、HMGB1注射組較對照組大鼠視網(wǎng)膜ROS水平升高(均P<0.05)，ROS抑制劑組較DR模型組、HMGB1注射組ROS水平降低(均P<0.05)，見表1。

表1 四組大鼠視網(wǎng)膜ROS水平比較(μg/ml)

2.2 四組大鼠視網(wǎng)膜組織Nox2、HMGB1、Occludin、ZO-1蛋白表達比較 DR模型組和HMGB1注射組較對照組Nox2和HMGB1的蛋白表達升高(均P<0.05)，ROS抑制劑組較HMGB1注射組和DR模型組Nox2和HMGB1的蛋白表達降低(均P<0.05)。大鼠視網(wǎng)膜Occludin和ZO-1的蛋白表達，HMGB1注射組和DR模型組較對照組Occludin和ZO-1的蛋白表達降低(均P<0.05)，ROS抑制劑組較HMGB1注射組和DR模型組Occludin和ZO-1的蛋白表達升高(均P<0.05)。見表2。

表2 四組大鼠視網(wǎng)膜組織Nox2、HMGB1、Occludin、ZO-1蛋白表達比較

2.3 四組大鼠視網(wǎng)膜組織PARP-1、Caspase 3 mRNA表達比較 HMGB1注射組和DR模型組較對照組大鼠視網(wǎng)膜PARP-1、Caspase 3 mRNA表達升高(均P<0.05)，ROS抑制劑組較HMGB1注射組和DR模型組降低(均P<0.05),見表3。

表3 四組大鼠視網(wǎng)膜組織PARP-1、Caspase 3 mRNA表達比較

2.4 四組大鼠視網(wǎng)膜電圖波幅比較 通過視網(wǎng)膜電圖分析大鼠a波和b波振幅，HMGB1注射組和DR模型組較對照組a波和b波振幅減少(均P<0.05)，ROS抑制劑組較HMGB1注射組和DR模型組振幅升高(均P<0.05)，見表4。

表4 四組大鼠視網(wǎng)膜電圖波幅比較(μV)

2.5 四組大鼠玻璃體FITC-BSA熒光強度比較 通過測量FITC-BSA熒光評估大鼠玻璃體通透性，DR模型組和HMGB1注射組較對照組熒光強度升高(均P<0.05)，ROS抑制劑組較DR模型組和HMGB1注射組熒光強度降低(均P<0.05)，見表5。

表5 四組大鼠玻璃體FITC-BSA熒光強度比較

3 討 論

臨床研究報道，HMGB1在DR患者的視網(wǎng)膜前膜和玻璃體液中表達上調(diào)，其表達與疾病的活動和炎癥生物標志物的水平相關(guān)[10]。本研究證明HMGB1表達在糖尿病大鼠的視網(wǎng)膜中上調(diào)，且HMGB1在介導(dǎo)糖尿病引起的視網(wǎng)膜血管病變和神經(jīng)病變中起關(guān)鍵作用。同時發(fā)現(xiàn)在正常大鼠玻璃體內(nèi)注射HMGB1誘導(dǎo)視網(wǎng)膜中ROS水平和Nox2、Caspase 3和PARP-1的表達顯著上調(diào)，而Occludin和ZO-1表達降低。ROS抑制劑減弱糖尿病誘導(dǎo)的ROS水平升高，同時下調(diào)視網(wǎng)膜中HMGB1、Nox2、Caspase 3和PARP-1的表達。表明DR中HMGB1和Nox衍生的ROS之間存在相互增強，這可能是促進糖尿病誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜電圖波幅和玻璃體的通透性改變的機制。

越來越多的證據(jù)支持這樣一種假設(shè)，血糖波動通過一些途徑可激活引起細胞的結(jié)構(gòu)、功能損壞，增加ROS生成和蛋白質(zhì)修飾能力而導(dǎo)致氧化應(yīng)激增加，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜細胞發(fā)生變化[11]。最近的證據(jù)表明，吞噬性Nox2是血管細胞、白細胞和組織巨噬細胞中超氧化物產(chǎn)生的主要內(nèi)源性細胞，其激活與糖尿病的血管并發(fā)癥密切相關(guān)[12]。以往研究表明，糖尿病小鼠視網(wǎng)膜和高糖處理的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞中Nox2的表達增加與細胞內(nèi)黏附分子1和血管內(nèi)皮生長因子的上調(diào)、增加的白細胞黏附和血視網(wǎng)膜屏障破壞相關(guān)[13]。此外，Nox2的缺失或NADPH氧化酶的抑制完全阻止了糖尿病誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生的增加，使細胞間黏附分子1正?；⒆柚沽艘暰W(wǎng)膜血管通透性[14]。目前研究結(jié)果表明HMGB1通過激活Nox衍生的ROS生成來激活糖尿病視網(wǎng)膜中的屏障介質(zhì)[15]。證明了玻璃體內(nèi)使用HMGB1可誘導(dǎo)ROS生成和Nox2表達的上調(diào)。一份報告表明，HMGB1通過激活NADPH氧化酶誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，且針對HMGB1的中和抗體阻止了失血性休克/復(fù)蘇誘導(dǎo)的p47phox在循環(huán)中性粒細胞中的p47phox激活。此外，用重組HMGB1體外刺激中性粒細胞導(dǎo)致NADPH氧化酶的TLR4依賴性激活以及ROS產(chǎn)生增加。在本研究中，我們證明糖尿病引起ROS生成和Nox2、PARP-1和Caspase 3表達的顯著上調(diào)，Occludin和ZO-1降低，并且持續(xù)攝入ROS抑制劑可有效預(yù)防糖尿病引起的ROS、Nox2、PARP-1，以及視網(wǎng)膜中的Caspase 3表達升高，促進Occludin和ZO-1表達。

有報道證明ROS抑制劑對NADPH氧化酶的抑制作用僅限于表達髓過氧化物酶的白細胞，并且該化合物不抑制無髓過氧化物酶血管細胞中的NADPH氧化酶[16]。他們還證明，該化合物可以作為血管細胞中的抗氧化劑，并且在血管細胞中觀察到的ROS抑制劑的顯著效果可能是ROS清除的結(jié)果。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明糖尿病視網(wǎng)膜中HMGB1和ROS生成之間存在正反饋回路。糖尿病視網(wǎng)膜中NADPH氧化酶衍生的ROS生成增加，導(dǎo)致視玻璃體通透性增加，視網(wǎng)膜電圖波幅降低，從而導(dǎo)致血管病變和神經(jīng)病變。在體外和體內(nèi)模型中產(chǎn)生的大量實驗數(shù)據(jù)表明，糖尿病誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜中PARP-1和Caspase 3過度表達會導(dǎo)致細胞死亡，這是一種先于組織病理學(xué)變化發(fā)展的現(xiàn)象[17]。氧化應(yīng)激增加細胞凋亡的潛在機制似乎很復(fù)雜，可能涉及炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變。在持續(xù)的氧化應(yīng)激情況下，過度的DNA損傷會導(dǎo)致PARP-1過度活化，通過消耗煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和能量衰竭來切換細胞死亡模式[18]。在許多病理條件下，PARP-1的活性改變介導(dǎo)細胞凋亡。在視網(wǎng)膜中，糖尿病會誘導(dǎo)PARP-1的過度表達，這種上調(diào)與視網(wǎng)膜細胞凋亡有關(guān)。類似地，在糖尿病視網(wǎng)膜細胞凋亡期間觀察到氧化應(yīng)激和Caspase 3激活之間的密切關(guān)系。最近，大量證據(jù)表明HMGB1在介導(dǎo)疾病細胞凋亡中的重要性[19]。在目前的研究中，玻璃體內(nèi)給予HMGB1上調(diào)了正常大鼠視網(wǎng)膜中PARP-1和Caspase 3的表達。此外，我們證明糖尿病視網(wǎng)膜中PARP-1和Caspase 3的表達上調(diào)，并且ROS抑制劑的給予減弱了糖尿病誘導(dǎo)的PARP-1和Caspase 3上調(diào)。我們的研究結(jié)果表明，ROS抑制劑在糖尿病視網(wǎng)膜中阻止糖尿病誘導(dǎo)的PARP-1和Caspase 3表達的機制可能是通過降低ROS的產(chǎn)生。DR中血管通透性的增加伴隨著視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞中緊密連接蛋白的減少。ZO家族和Occludin是視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞緊密連接的充分表征成分。特別是，ZO家族可以引起通透性變化，因為它與Occludin密切相關(guān)，Occludin的磷酸化有助于通透性的調(diào)節(jié)。ZO-1和ZO-2是與緊密連接的細胞質(zhì)表面相關(guān)的連接蛋白，位于膜接觸點與原纖維[20]。它們參與緊密連接的形成，它們的細胞定位與血管內(nèi)皮細胞的通透性密切相關(guān)。我們已經(jīng)提出ZO家族是視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞緊密連接的一個組成部分，其表達為與玻璃體的滲透性呈負相關(guān)。在此，當阻斷或降低HMGB1和Nox衍生的ROS之間相互作用可有效抑制糖尿病視網(wǎng)膜血管滲漏，并恢復(fù)ZO-1和Occludin的表達。研究中對各組大鼠中進行了12 h的暗適應(yīng)后進行視網(wǎng)膜電圖檢查。a波反映視錐細胞和桿狀細胞的功能，b波反映與桿狀細胞相連的雙極細胞的功能。結(jié)果顯示，與對照組大鼠相比，HMGB1注射組和DR模型組大鼠的a波和b波的幅度降低，然而，ROS抑制劑治療顯著減輕了大鼠的a波和b波振幅降低。這一發(fā)現(xiàn)表明大鼠視覺功能的部分恢復(fù)，減輕氧化應(yīng)激引起的視覺損傷。

綜上所述，糖尿病視網(wǎng)膜中HMGB1和Nox衍生的ROS之間存在正反饋，這可能是促進糖尿病誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜電圖波幅降低和玻璃體通透性增加的機制。因此，對HMGB1和Nox衍生的ROS之間相互增強為我們提供了揭示DR發(fā)病機制的新見解，并將有助于定義一系列新穎且有前景的治療方法。