張霞婧，毛肖肖，朱芳蕓，小 輝，邵勇平，鄭 凌

(1.西安市人民醫(yī)院 西安市第四醫(yī)院麻醉科，陜西 西安710004；2.開封市第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 開封475100)

腦缺血再灌注損傷嚴(yán)重威脅患者的生命安全，是一個(gè)涉及鈣超載、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、自由基損傷等一系列復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)[1-2]，特征是先出現(xiàn)短暫的腦缺血，然后再灌注。研究[3-5]表明，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，小膠質(zhì)細(xì)胞通過吞噬垂死的神經(jīng)元和激活程序性細(xì)胞死亡來調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常駐免疫細(xì)胞，負(fù)責(zé)維護(hù)腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)，在大腦發(fā)育、突觸重塑和認(rèn)知改善過程中起著重要的作用。小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的中樞炎性反應(yīng)是腦缺血再灌注損傷的主要病理生理改變之一[6]。在各種炎性刺激作用下，穩(wěn)態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞被活化，促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥病理過程的發(fā)展?；罨∧z質(zhì)細(xì)胞具有兩種極化表型，稱為促炎表型(M1型)和抑炎表型(M2型)，M1型可釋放炎癥介質(zhì)和自由基，損傷神經(jīng)元，破壞突觸結(jié)構(gòu)；而M2型可吞噬清除壞死細(xì)胞，釋放腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子[7]等神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進(jìn)腦組織修復(fù)。因此，對小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2極化表型的調(diào)控被認(rèn)為是治療腦缺血再灌注損傷的重要靶點(diǎn)之一[8]。丙酮酸是生物體代謝中的重要物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、改善細(xì)胞代謝等多種功能，并能提高細(xì)胞對缺氧的耐受能力[9-10]。丙酮酸乙酯(Ethyl pyruvate,EP)是丙酮酸的酯化物，可溶于水且性質(zhì)穩(wěn)定，進(jìn)入生物體后轉(zhuǎn)化為丙酮酸發(fā)揮作用。有研究[11-12]表明，腹腔注射EP溶液可顯著減小大鼠腦缺血再灌注丘腦梗死容積[13]，改善神經(jīng)功能缺損評分，并降低損傷側(cè)皮層炎癥因子白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的蛋白表達(dá)，提示EP可能通過抗炎作用減輕大鼠腦缺血再灌注損傷。但其對小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響尚不清楚。本研究擬評價(jià)EP對腦缺血再灌注損傷大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞極化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 清潔級成年雄性SD大鼠72只，體重220～250 g，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，飼養(yǎng)室溫度22～25 ℃，給予12 h明暗循環(huán)，動物自由進(jìn)食和飲水，在造模前適應(yīng)性飼養(yǎng)6 d。本研究經(jīng)過西安市第四醫(yī)院倫理委員會審批(20180018)。線栓購自北京西濃科技有限公司，EP購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組：采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為三組(n=24)：假手術(shù)組(Sham組)、大腦中動脈栓塞組(MCAO組)和EP+大腦中動脈栓塞組(EP+MCAO組)。

1.2.2 MCAO小鼠模型制備方法：MCAO組和EP+MCAO組參照文獻(xiàn)[14]采用Zea-Longa法制備大鼠大腦中動脈栓塞模型。使用氯胺酮麻醉大鼠，頸部備皮，消毒，做頸部正中切口，暴露右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，在距離頸總動脈分叉處3 mm處的頸外動脈上剪一個(gè)小口將線栓向內(nèi)插入到大腦中動脈，90 min后拔除線栓，絲線結(jié)扎頸外動脈近心端，縫合頸部傷口。兩組在拔除線栓后分別靜脈注射0.9%氯化鈉溶液或EP溶液(批號E822646)。Sham組僅暴露頸外動脈而不置入線栓，并與其他兩組在同一時(shí)間靜脈注射0.9%氯化鈉溶液。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 神經(jīng)功能缺損評價(jià)：分別于模型制作成功后24、48、72 h時(shí)，根據(jù)文獻(xiàn)[15]采用神經(jīng)功能缺損評分(NSS)評估大鼠神經(jīng)功能受損的程度：0分，無神經(jīng)功能缺損；1分，損傷側(cè)前爪不能完全伸展；2分，行走時(shí)，大鼠向損傷側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，行走時(shí)，大鼠身體向損傷側(cè)傾倒；4分，不能自拔行走，有意識喪失。深麻醉下處死大鼠，0.9%氯化鈉溶液灌注后取腦，在冰箱中速凍20 min，根據(jù)文獻(xiàn)[8]報(bào)道的方法切為5～6片，進(jìn)行TTC染色，評估腦梗死容積。

1.3.2 酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定炎癥因子釋放：在造模成功后24、48、72 h時(shí)，深麻醉下處死大鼠，斷頭取腦，勻漿后4 ℃下10 000 r/min 離心5 min，離心半徑13.5 cm，取上清液檢測IL-1β、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)、白細(xì)胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的濃度。嚴(yán)格按照各指標(biāo)ELISA試劑盒(美國R&D公司)說明書進(jìn)行操作。

1.3.3 免疫熒光染色標(biāo)記一氧化氮合酶陽性和精氨酸酶-1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞：取損傷側(cè)腦組織，制備石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，抗原修復(fù)和山羊血清封閉液孵育后，滴加兔抗鼠誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)(英國Abcam公司，1∶150稀釋)或精氨酸酶-1(Arginase-1，Arg-1)(英國Abcam公司，1∶100稀釋)抗體工作液4 ℃孵育過夜；洗去一抗工作液后滴加FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗工作液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，1∶500稀釋)避光孵育2 h，棄去二抗工作液后滴加DAPI染液襯染細(xì)胞核，中性樹脂封片，避光保存。在熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)下隨機(jī)采集5個(gè)400倍視野，分別在標(biāo)記iNOS陽性和Arg-1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞的切片中，計(jì)數(shù)該視野內(nèi)標(biāo)記綠色熒光細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，分別取平均值并計(jì)算標(biāo)記綠色熒光細(xì)胞占視野內(nèi)總細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.3.4 Western blot法檢測iNOS和Arg-1的表達(dá)水平：取損傷側(cè)大鼠腦組織，加入RIPA裂解液(北京百奧萊博科技有限公司)在冰上勻漿，于4 ℃、10 000 r/min離心5 min，離心半徑13.5 cm，取上清液進(jìn)行總蛋白定量，加入5×上樣緩沖液(北京百奧萊博科技有限公司)煮沸制備蛋白樣品。經(jīng)SDS凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜完成后，將聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride，PVDF)膜放入5%脫脂奶-TBS溶液中室溫下封閉4 h，分別加入免抗鼠iNOS(英國Abcam公司，1∶1000稀釋)或Arg-1(英國Abcam公司，1∶1000稀釋)抗體工作液4 ℃孵育過夜；洗去一抗工作液后使用辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔二抗工作液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，1∶5000稀釋)室溫下孵育2 h，洗去二抗工作液后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影，采集圖像，測定各條帶的灰度值，計(jì)算目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值反映目的蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 三組大鼠造模后各時(shí)間點(diǎn)NSS評分比較 與Sham組比較，MCAO組和EP+MCAO組造模后各時(shí)間點(diǎn)NSS升高(均P<0.05)；與MCAO組比較，EP+MCAO組NSS降低(均P<0.05)。見表1。

表1 三組大鼠造模后各時(shí)間點(diǎn)NSS評分比較(分)

2.2 三組大鼠造模后各時(shí)間點(diǎn)腦梗死容積比較 與Sham組比較，MCAO組和EP+MCAO組腦梗死容積升高(均P<0.05)；與MCAO組比較，EP+MCAO組腦梗死容積降低(P<0.05)。見表2。

表2 三組大鼠造模后各時(shí)間點(diǎn)腦梗死容積比較(mm3)

2.3 三組大鼠造模后各時(shí)間點(diǎn)炎癥因子濃度比較 與Sham組比較，MCAO組和EP+MCAO組IL-1β、IL-6、IL-10、BDNF濃度升高(均P<0.05)；與MCAO組比較，IL-1β和IL-6濃度降低(均P<0.05)，IL-10、BDNF濃度升高(均P<0.05)。見表3。

表3 三組大鼠造模后各時(shí)間點(diǎn)炎癥因子濃度比較(pg/ml)

2.4 三組大鼠造模后各時(shí)間點(diǎn)小膠質(zhì)細(xì)胞極化標(biāo)志物水平比較 與Sham組比較，MCAO組和EP+MCAO組iNOS和Arg-1表達(dá)上調(diào)(均P<0.05)；與MCAO組比較，EP+MCAO組iNOS表達(dá)下調(diào)，Arg-1表達(dá)上調(diào)(均P<0.05)。見表4。

表4 三組大鼠造模后各時(shí)間點(diǎn)小膠質(zhì)細(xì)胞極化標(biāo)志物水平比較

3 討 論

本研究參照文獻(xiàn)[9]Zea-Longa法制備大鼠MCAO模型，結(jié)果表明，與Sham組比較，MCAO組NSS升高，腦梗死容積增大，提示大鼠MCAO模型制備成功。本研究根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇4 mg/kg為丙酮酸乙酯的給藥劑量，結(jié)果表明，與MCAO組比較，EP+MCAO組NSS降低，腦梗死容積減小，提示丙酮酸乙酯減輕了大鼠腦缺血再灌注損傷。

缺血后炎癥通過一系列細(xì)胞事件導(dǎo)致缺血性損傷，包括循環(huán)免疫細(xì)胞的浸潤、常駐細(xì)胞(包括小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞)和內(nèi)皮細(xì)胞的激活。據(jù)報(bào)道，在這些細(xì)胞中，小膠質(zhì)細(xì)胞通過釋放各種細(xì)胞毒性分子，如一氧化氮、氧自由基和細(xì)胞因子，以及對促炎細(xì)胞因子的反應(yīng)，發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[16]。小膠質(zhì)細(xì)胞在靜息狀態(tài)下不斷監(jiān)測神經(jīng)元活動和穩(wěn)態(tài)的改變，當(dāng)有病原體侵入、組織損傷或異常蛋白質(zhì)及核苷酸等物質(zhì)存在的情況下，小膠質(zhì)細(xì)胞迅速活化，根據(jù)其所處微環(huán)境不同，可極化為M1型，釋放IL-1β、IL-6等多種炎性因子，介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)，或M2型，釋放IL-10和BDNF等多種物質(zhì)，抑制炎性反應(yīng)擴(kuò)散[17]，促進(jìn)細(xì)胞碎片吞噬和組織修復(fù)，即小膠質(zhì)細(xì)胞的“雙刃效應(yīng)”[18-19]。其中 iNOS為M1型標(biāo)志物之一，Arg-1為M2型標(biāo)志物之一[20]。本研究分別采用免疫熒光染色方法和Western blot法檢測缺血側(cè)腦組織iNOS和Arg-1的表達(dá)水平，采用ELISA方法檢測大鼠損傷側(cè)腦組織勻漿中炎性因子IL-1β、IL-6、IL-10的濃度，以及促進(jìn)組織修復(fù)的重要物質(zhì)BDNF的濃度。結(jié)果表明，丙酮酸乙酯可明顯下調(diào)iNOS的表達(dá)，抑制促炎因子IL-1β、IL-6的生成，上調(diào)Arg-1的表達(dá)，增加抑炎因子IL-10和BDNF的生成，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞極化表型由M1型向M2型轉(zhuǎn)化，提示丙酮酸乙酯減輕MCAO后大鼠腦缺血再灌注損傷的機(jī)制可能與調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極性轉(zhuǎn)化有關(guān)。

丙酮酸是生物體新陳代謝過程非常重要的一個(gè)中間產(chǎn)物，處在糖的無氧酵解和有氧氧化的連接點(diǎn)上，能改善休克狀態(tài)下線粒體功能，保護(hù)糖代謝，提高細(xì)胞對缺氧的耐受能力。丙酮酸乙酯抗炎作用的持久性以及活性表明，丙酮酸乙酯可以共價(jià)修飾細(xì)胞內(nèi)成分，從而導(dǎo)致細(xì)胞對促炎細(xì)胞因子的反應(yīng)持續(xù)改變，雖然它是一個(gè)非常簡單的分子，但丙酮酸乙酯在氧化還原和炎癥介導(dǎo)的細(xì)胞或組織損傷的各種體外和體內(nèi)模型系統(tǒng)中具有藥理活性。丙酮酸乙酯的保護(hù)作用是由于其抗炎、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡和離子螯合作用。已經(jīng)提出了各種分子機(jī)制來解釋其抗炎作用。Sims等[21]研究發(fā)現(xiàn)，丙酮酸乙酯乳酸林格氏液可減輕大鼠腸缺血再灌注損傷。Yang等[22]發(fā)現(xiàn)丙酮酸乙酯可下調(diào)出血性休克小鼠肝臟和腸黏膜組織炎癥相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子:核因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)的表達(dá)，抑制多個(gè)促炎因子的釋放，降低模型動物死亡率，NF-κB已被證明可調(diào)節(jié) 100 多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄，其中許多基因與程序性細(xì)胞死亡、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)有關(guān)[16]。Jun等[23]發(fā)現(xiàn)丙酮酸乙酯對高血糖下的缺血再灌注損傷具有腎臟保護(hù)作用。此外，丙酮酸乙酯還通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活發(fā)揮抗炎作用，NF-κB的DNA 結(jié)合活性和隨后的下游促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生。本研究的結(jié)果表明丙酮酸乙酯可減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2極化表型轉(zhuǎn)化，抑制中樞炎性反應(yīng)，促進(jìn)缺血后損傷修復(fù)有關(guān)。

綜上所述，丙酮酸乙酯可減輕大鼠腦缺血再灌注損傷，其機(jī)制可能與調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化表型轉(zhuǎn)化，抑制中樞炎性反應(yīng)有關(guān)。