王 磊，王海強(qiáng)

(1.西安市中心醫(yī)院心內(nèi)科,陜西 西安 710004;2.空軍第九八六醫(yī)院心血管內(nèi)科,陜西 西安 710054)

心肌梗死(Myocardial infarction,MI)是指因冠狀動(dòng)脈出現(xiàn)阻塞，心臟肌肉因急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死,是最嚴(yán)重的一種心臟病,常導(dǎo)致猝死,嚴(yán)重威脅人類健康[1-2]。流行病學(xué)研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，在全球范圍內(nèi)MI的發(fā)病呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，并且急診科接收的胸痛患者中約10%被確診為MI。在中國，每年約新發(fā)急性MI患者70萬例，盡管全國各級醫(yī)院心痛中心的建立極大降低了MI的病死率，但MI患者病死率仍高達(dá)30%[5]。引起MI患者死亡的主要原因是，在發(fā)病早期約25%的患者臨床癥狀不明顯，未能及時(shí)引起患者的重視，到院后確診也較困難[5]。此外，研究[6-7]表明，MI患者發(fā)展為心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)是非MI患者的8倍，約20%～68%存活的MI患者會(huì)繼發(fā)心力衰竭，心力衰竭是造成MI患者死亡的重要誘因之一。因此，研究MI后心力衰竭發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制對降低MI后心力衰竭的發(fā)生率，延緩MI患者的生命意義重大。3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase 1，PDK1)是AGC蛋白激酶家族中的重要一員，其位于AGC蛋白激酶家族的上游，調(diào)控該蛋白激酶家族下游多個(gè)成員的轉(zhuǎn)錄，包括磷酸化核糖體S6蛋白激酶、蛋白激酶B以及叉頭框蛋白O等，而該蛋白激酶家族中的多個(gè)因子被證實(shí)參與心臟心力衰竭和心血管重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展[8]。此外，研究[9]發(fā)現(xiàn)，PDK1參與調(diào)控細(xì)胞各種生命活動(dòng)，包括增殖、分化、凋亡、壞死、遷移以及侵襲等，并且在心臟中特異性敲除PDK1可通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和心臟結(jié)構(gòu)的改變而導(dǎo)致心力衰竭。然而，目前尚無PDK1表達(dá)對MI誘導(dǎo)的心力衰竭小鼠心血管重構(gòu)影響的研究報(bào)道。因此，本研究通過比較心臟PDK1特異性敲除對MI誘導(dǎo)的心力衰竭小鼠心電圖、血流動(dòng)力學(xué)和心室重構(gòu)的影響，以研究PDK1基因敲除對MI誘導(dǎo)的心力衰竭小鼠心血管重構(gòu)的影響，并探討其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 35只昆明小鼠(8周齡，雄性，18～22 g)，SPF級別，購買自賽業(yè)生物科技有限公司[SCXK(粵)-2021-0005]，分為對照組15只，模型組20只，對模型組小鼠制作MI模型。另外20只心肌組織PDK1基因敲除昆明小鼠為PDK1組(8周齡，雄性，18～22 g)，SPF級別，購買自賽業(yè)生物科技有限公司。所有小鼠均飼養(yǎng)在正常晝夜環(huán)境中(光照12 h/d)，室溫控(23±3)℃，相對濕度50%，飲用水為純凈水。本研究所有動(dòng)物操作都符合倫理要求，且研究得到了動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器與試劑 酶標(biāo)儀(型號(hào)Infinite-F50，瑞士TECAN公司)，電子天平(型號(hào)BT25S，德國賽多利斯)，動(dòng)物心電圖機(jī)(型號(hào)DE12-Vet，江蘇大為寵物醫(yī)療有限公司)，戊巴比妥鈉(貨號(hào)150205，美國西格瑪)，鼠腦鈉肽(BNP)檢測試劑盒(貨號(hào)ab193694，ABCAM公司)、鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)檢測試劑盒(貨號(hào)ab208348，ABCAM公司)、鼠白細(xì)胞介素質(zhì)1β(IL-1β)檢測試劑盒(貨號(hào)ab197742，ABCAM公司)和鼠白細(xì)胞介素10(IL-10)檢測試劑盒(貨號(hào)ab255729，ABCAM公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MI誘導(dǎo)建立心力衰竭模型：將模型組和PDK1組的小鼠經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，暴露氣管和心臟，在距離小鼠左心耳尖端2 mm處，結(jié)扎小鼠左冠動(dòng)脈前降支，觀察心肌組織變白，且心電圖ST段顯著抬高，持續(xù)時(shí)間為10～15 min，即可證明心力衰竭模型建立成功。對照組小鼠僅開胸而不結(jié)扎動(dòng)脈。術(shù)后1周，模型組存活15只，PDK1組存活15只，對照組存活15只，繼續(xù)飼養(yǎng)3周。

1.3.2 心電圖檢測：術(shù)后4周，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠，麻醉后的小鼠取仰臥位固定，連接小動(dòng)物心電圖機(jī)器測量小鼠心電圖指標(biāo)P波、QRS波寬度、S波。

1.3.3 血流動(dòng)力學(xué)檢測：術(shù)后4周，各組小鼠在完成心電圖測量后，去除心電圖儀，暴露并分離小鼠右頸總動(dòng)脈，使用5-0絲線結(jié)扎遠(yuǎn)心端右頸總動(dòng)脈，同時(shí)使用手術(shù)剪刀在右頸總動(dòng)脈處制作一個(gè)V型缺口，插入血流動(dòng)力學(xué)儀器檢測導(dǎo)管持續(xù)記錄2～5 min平穩(wěn)信號(hào)波形，測量并記錄血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo):左心室收縮壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左室最大壓力下降速率(-dp/dtmax)和左室最大壓力上升速率(+dp/dtmax)。

1.3.4 心室重構(gòu)指標(biāo)：術(shù)后4周，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠，測量小鼠體重(g)，完成心電圖和血流動(dòng)力學(xué)檢測后，通過頸椎脫臼安樂死小鼠，然后分離小鼠心臟組織并測量心臟組織重量(mg)，計(jì)算心重指數(shù)，心重指數(shù)=心臟重量(mg)/小鼠體重(g)。小鼠心臟組織經(jīng)蘇木素-伊紅染色后在電子顯微鏡下測量心肌細(xì)胞橫截面積。

1.3.5 血清和心肌組織炎性因子及BNP含量檢測：術(shù)后4周，斷尾取小鼠外周血，離心以收集血清，通過Elisa檢測試劑盒測量小鼠血清BNP、TNF-α、IL-1β、IL-10含量。取小鼠部分心臟組織，組織勻漿后離心收集組織勻漿上清液，然后采用Elisa檢測試劑盒測量小鼠心肌組織BNP、TNF-α、IL-1β和IL-10含量。

2 結(jié) 果

2.1 三組小鼠心電圖指標(biāo)比較 見表1。與對照組相比，模型組和PDK1組小鼠心電圖均出現(xiàn)異常改變，S-T段升高明顯，其中P波高度和QRS波寬度顯著降低(均P<0.05)，而P波寬度、S波寬度和高度均顯著升高(均P<0.05);與模型組相比，PDK1組小鼠心電圖S-T段明顯升高，其中P波高度和QRS波寬度顯著降低(均P<0.05)，而P波寬度、S波寬度和高度均顯著升高(均P<0.05)。

表1 三組小鼠心電圖指標(biāo)比較(ˉ

2.2 三組小鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較 見表2。與對照組比較，模型組和PDK1組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)LVEDP顯著升高(P<0.05)，而LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均顯著降低(均P<0.05)；與模型組相比，PDK1組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)LVEDP顯著升高(P<0.05)，而LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均顯著降低(均P<0.05)。

表2 三組小鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較(ˉ

2.3 三組小鼠心室重構(gòu)指標(biāo)比較 見表3。與對照組小鼠相比，模型組和PDK1組小鼠心重指數(shù)、心肌細(xì)胞橫截面積均顯著升高(均P<0.05)，并且PDK1組小鼠心重指數(shù)、心肌細(xì)胞橫截面積均顯著高于模型組小鼠(均P<0.05)。

表3 三組小鼠心室重構(gòu)指標(biāo)比較

2.4 三組小鼠血清和心肌組織炎性因子及BNP含量比較 見表4、5。與對照組小鼠相比，模型組和PDK1組小鼠血清和心肌組織TNF-α、IL-1β和BNP均顯著升高(均P<0.05)，而IL-10含量卻顯著下降(P<0.05)。此外，PDK1組小鼠血清和心肌組織TNF-α、IL-1β和BNP均顯著高于模型組小鼠，而IL-10含量卻顯著低于模型組小鼠(均P<0.05)。

表4 三組小鼠血清炎性因子及BNP含量比較(ng/ml)

表5 三組小鼠心肌組織炎性因子及BNP含量比較(ng/ml)

3 討 論

心力衰竭是一種嚴(yán)重威脅生命的疾病，特別是心肌梗死后心力衰竭大大增加患者的病死率。國內(nèi)外數(shù)據(jù)均顯示，心梗后心衰的發(fā)生率呈上升趨勢。基于中國人群的數(shù)據(jù)顯示,ST段抬高型心梗(ST segment elevation myocardial infarction,STEMI)患者心梗后7 d內(nèi)心衰的發(fā)生率為19.3%[10]。而研究提示，心梗后心衰的發(fā)生可顯著增加患者短期及長期不良事件風(fēng)險(xiǎn)。數(shù)據(jù)顯示，在接受冠脈介入治療的STEMI患者中，出院后第1年內(nèi)發(fā)生心衰者的5年累積全因死亡(36.3%與10.1%)、心衰住院(40.4% 與4.3%)、心血管死亡(19.1%與3.3%)，風(fēng)險(xiǎn)均明顯高于未發(fā)生心衰的患者[11]。傳統(tǒng)改善心肌收縮力的藥物，諸如β腎上腺素能受體激動(dòng)劑，磷酸二酯酶抑制劑等,盡管可以改善患者癥狀,但也增加患者遠(yuǎn)期死亡風(fēng)險(xiǎn)，因此迫切需要研發(fā)更加安全有效的藥物[6-7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與野生型心肌梗死誘導(dǎo)的心力衰竭小鼠相比，心臟PDK1特異性敲除的心肌梗死誘導(dǎo)的心力衰竭小鼠心電圖S-T段異常改變更加明顯，表明心臟PDK1特異性敲除加重心肌梗死后心力衰竭小鼠心電重構(gòu)，這與牛燕等[9]的研究結(jié)果一致。牛燕等[9]研究發(fā)現(xiàn)，心臟PDK1特異性敲除可誘發(fā)心衰，其機(jī)制可能與通過影響代謝重構(gòu)而影響心臟功能或心臟重構(gòu)有關(guān)。心肌梗死后心室重構(gòu)將影響心臟的收縮功能和舒張功能、心臟瓣膜功能以及其他心臟并發(fā)癥，比如心肌瘢痕和心室壁血栓。血流動(dòng)力學(xué)是指血液在心血管系統(tǒng)中流動(dòng)的力學(xué)，主要研究血流量、血流阻力、血壓以及它們之間的相互關(guān)系，其可被用于評估心功能和血流灌注[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，PDK1組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)LVEDP較模型組顯著升高，而LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax較模型組均顯著降低，表明PDK1組小鼠心功能較模型組差。進(jìn)一步分析可知，PDK1作為AGC蛋白激酶家族的一員，其功能與AGC蛋白激酶家族類似；之前的研究[9]表明，PDK1缺乏表達(dá)的小鼠心肌收縮功能將出現(xiàn)下降，并對缺血缺氧的敏感性增強(qiáng)，被證實(shí)與多種心臟疾病(心律失常、心力衰竭和心肌擴(kuò)張)的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。而在心肌梗死后，由細(xì)胞因子或激素等刺激引起的病理性心肌肥厚可誘發(fā)心臟收縮功能和舒張功能異常[13-14]。結(jié)合本次研究可知，心臟PDK1特異性敲除加劇了心肌梗死后引起的心臟功能異常。

現(xiàn)有的研究[15]表明，缺氧引起的心肌細(xì)胞凋亡或壞死是導(dǎo)致心肌梗死后心室重構(gòu)和心力衰竭的重要原因，而心室重構(gòu)是心力衰竭發(fā)生的基本病理過程。本研究比較PDK1表達(dá)對心肌梗死后心力衰竭小鼠心室重構(gòu)的影響，結(jié)果顯示：PDK1組小鼠心重指數(shù)、心肌細(xì)胞橫截面積均顯著高于模型組小鼠，表明PDK1心臟特異性敲除加重心肌梗死后心力衰竭小鼠心臟肥大和心肌肥厚，即加重心室重構(gòu)。心梗后凋亡及壞死的心肌細(xì)胞引起免疫損傷，觸發(fā)嚴(yán)重的炎性反應(yīng)，加重組織功能受損，直接導(dǎo)致一系列病理生理改變，加重心臟重構(gòu)，最終導(dǎo)致心衰[16-17]。為進(jìn)一步研究PDK1敲除加重心肌梗死誘導(dǎo)的心力衰竭小鼠心血管重構(gòu)的機(jī)制，本研究比較PDK1敲除對心肌梗死后心力衰竭小鼠炎癥因子的影響，結(jié)果顯示：PDK1組小鼠血清和心肌組織TNF-α、IL-1β和BNP均顯著高于模型組小鼠，而IL-10含量卻顯著低于模型組小鼠，表明PDK1心臟特異性敲除加重心肌梗死后心力衰竭小鼠體內(nèi)炎性反應(yīng)。進(jìn)一步分析可知，心肌梗死后受損的心肌組織愈合被分為炎癥階段、修復(fù)階段和愈合階段，而過重的炎癥不僅不會(huì)促進(jìn)組織愈合，而且加重組織損傷和延緩修復(fù)階段的到來，TNF-α和IL-1β是體內(nèi)重要的促炎因子，而IL-10是重要的炎癥因子合成抑制劑[18-19]。BNP由心肌細(xì)胞合成并分泌的激素，是表征左心室功能的生物標(biāo)志物，同時(shí)在臨床上也被用于心力衰竭的診斷和嚴(yán)重程度的評估[20]。結(jié)合本文研究結(jié)果表明，PDK1基因敲除通過加重炎性反應(yīng)而加重心肌梗死后心肌損傷，進(jìn)而加劇心肌梗死后心力衰竭小鼠心血管重構(gòu)。

綜上所述，PDK1基因敲除加重心肌梗死誘導(dǎo)的心力衰竭及心血管重構(gòu)，其機(jī)制可能與PDK1基因敲除加重炎性反應(yīng)有關(guān)。