施 健，胡千慧 ，張雪杰

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，遼寧 錦州121000；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 錦州121012)

口腔鱗癌是頭頸部最常見(jiàn)的腫瘤之一，起源于鱗狀上皮的惡性轉(zhuǎn)變。鱗癌細(xì)胞具有高增殖性，病變具有侵襲性、進(jìn)展性的特征[1-2]，其發(fā)病原因尚不清楚。近年隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，學(xué)者重點(diǎn)關(guān)注基因調(diào)控通路異常在腫瘤形成和進(jìn)展中的作用，并認(rèn)為多種因子參與腫瘤的進(jìn)展，也是腫瘤形成的重要因素之一[3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，LncRNA)是指超過(guò)200 bp的單核苷酸序列的統(tǒng)稱，近年學(xué)者關(guān)注到其與腫瘤的形成和進(jìn)展相關(guān)，由于其種類眾多，因此現(xiàn)階段對(duì)LncRNA的研究較為局限。LncRNA雖然不具有編碼蛋白的功能，但是其可作為多種具有調(diào)控因子的下游因子發(fā)揮作用，其下游因子包括微小RNA(microRNA,miRNA)及相關(guān)靶蛋白等[4]。本研究探討LncRNA LINC01605(LINC01605)在口腔鱗癌中的表達(dá)特征，分析其與增殖相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系，探討其臨床意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2017年1月至2018年4月在我院確診為口腔鱗狀細(xì)胞癌的患者作為研究對(duì)象。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①均行手術(shù)根治性治療，術(shù)后經(jīng)病理檢查確診，符合WHO的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)；②臨床隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前行放、化療者；②伴有較嚴(yán)重的基礎(chǔ)性疾病者；③病理形態(tài)中具有異源性分化者。共選擇58例，其中男30例，女28例，年齡38～83歲，中位年齡59歲，其中高分化21例，中分化27例，低分化10例。留取腫瘤組織和距腫物邊緣>3 cm的正?？谇火つそM織為對(duì)照，標(biāo)本均于術(shù)后30 min內(nèi)完成取材，并立即置于-80℃冰箱中凍存。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，符合《赫爾辛基宣言》中的要求。

1.2 研究方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR：基于術(shù)后新鮮凍存組織進(jìn)行檢測(cè)，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative PCR)法檢測(cè)LINC01605的表達(dá)。應(yīng)用Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)提取總RNA，鑒定純度。反轉(zhuǎn)錄法(廣州復(fù)能基因有限公司)獲得cDNA。引物由廣州復(fù)能基因有限公司合成，LINC01605引物上游：5’-GCTAACACTGGAAGAGAGATCGCT-3’，下游：5’-CTGTGAGTGGGCCGGTGCCAAAC-3’。選擇U6作為內(nèi)參，上游：5’-CTCGTTTACGCAACGTATACACA-3’，下游：5’-AACGGCAGCCGAGGTACGTGT-3’。執(zhí)行實(shí)時(shí)PCR(PCR儀為美國(guó)伯樂(lè)公司生產(chǎn))，程序設(shè)定：95 ℃預(yù)變性30 s；變性95 ℃ 30 s，退火60 ℃ 10 s，延伸72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)。結(jié)果以2-ΔΔCT表示。

1.2.2 免疫組化實(shí)驗(yàn)：應(yīng)用免疫組化二步法檢測(cè)腫瘤組織中Ki67的表達(dá)，Ki67工作液購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司。腫瘤組織經(jīng)中性福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋后，切取4 μm切片后應(yīng)用免疫組化二步法進(jìn)行檢測(cè)，DAB顯色。操作嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)步驟完成，設(shè)陽(yáng)性對(duì)照(扁桃體組織)，做好質(zhì)控工作。Ki67的表達(dá)部位為細(xì)胞核，以棕黃色為陽(yáng)性，選擇3個(gè)高倍視野(400倍)計(jì)算百分率，取平均值計(jì)為增殖指數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 LINC01605在口腔鱗癌和正?？谇火つそM織中的表達(dá)量比較 LINC01605在口腔鱗癌中的表達(dá)量(1.32±0.25)明顯高于正?？谇火つそM織(1.02±0.30)(t=4.31，P=0.010)。

2.2 LINC01605在口腔鱗癌不同臨床病理特征分組中的表達(dá)比較 LINC01605的表達(dá)在不同腫瘤最大徑、分化程度及有無(wú)脈管癌栓的分組中表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。而在不同性別、年齡、有無(wú)吸煙史及有無(wú)神經(jīng)累犯的分組中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 LINC01605在口腔鱗癌不同臨床病理特征分組中的表達(dá)比較

2.3 口腔鱗癌組織中LINC01605與Ki67的相關(guān)性分析 免疫組化檢測(cè)到口腔鱗癌中Ki67增殖指數(shù)的范圍是10%～70%，平均32.58%。應(yīng)用Pearson相關(guān)分析顯示LINC01605與Ki67增殖指數(shù)具有正相關(guān)性(r=0.64，P=0.029)。見(jiàn)圖1。

圖1 口腔鱗癌組織中LINC01605表達(dá)與Ki67的相關(guān)性

2.4 口腔鱗癌組織中LINC01605表達(dá)與患者生存時(shí)間的關(guān)系 對(duì)患者進(jìn)行術(shù)后3年(36個(gè)月)生存時(shí)間的隨訪，隨訪到患者術(shù)后的生存時(shí)間為10～36個(gè)月，中位生存期26個(gè)月，其中失訪2例(計(jì)為刪失值)。應(yīng)用K-M生存分析顯示LINC01605的表達(dá)與術(shù)后生存時(shí)間相關(guān)(臨界值1.32，χ2=4.24，P=0.040)。即LINC01605高表達(dá)患者生存時(shí)間較短。見(jiàn)圖2。

圖2 口腔鱗癌組織中LINC01605表達(dá)與患者生存時(shí)間的關(guān)系

3 討 論

LncRNA是近年研究的熱點(diǎn)。研究顯示LncRNA由對(duì)應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄形成，具有5’帽子和ploy尾巴，通過(guò)剪切形成的成熟體，參與表觀遺傳學(xué)調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和細(xì)胞分化調(diào)控[5-6]。雖然近些年發(fā)現(xiàn)在ceRNA機(jī)制中LncRNA通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA調(diào)控其對(duì)應(yīng)的靶基因，但是相關(guān)實(shí)驗(yàn)仍然發(fā)現(xiàn)LncRNA在腫瘤中可能具有獨(dú)立地調(diào)控生物學(xué)功能的作用，尤其是其表達(dá)異常時(shí)可能預(yù)示著某些生物學(xué)功能[7-8]。LINC01605是我們?cè)谶M(jìn)行生物信息分析時(shí)發(fā)現(xiàn)的與腫瘤相關(guān)的因子，應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)LINC01605在口腔鱗癌中表達(dá)升高，證實(shí)了Gepia中的分析結(jié)果，提示LINC01605具有癌基因樣的作用，對(duì)腫瘤形成有重要的促進(jìn)作用。本研究結(jié)果顯示LINC01605在口腔鱗癌不同腫瘤最大徑的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示LINC01605高表達(dá)時(shí)腫瘤可能處于快速生長(zhǎng)狀態(tài)，LINC01605與Ki67的相關(guān)性，亦證實(shí)了LINC01605高表達(dá)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)具有的促進(jìn)作用，但是關(guān)于LINC01605是否具有直接調(diào)控腫瘤增殖的作用，尚有待基礎(chǔ)研究中的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，并應(yīng)用CCK-8等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行明確。LINC01605促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)可能是其經(jīng)典作用，其下游的多種調(diào)控因子也具有增殖促進(jìn)作用。Wang等[9]研究發(fā)現(xiàn)LINC01605通過(guò)調(diào)控miR-493-3p促進(jìn)鱗癌的增殖、抑制凋亡；Qin等[10]通過(guò)高通量測(cè)序鑒定LncRNA在腫瘤中的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)LINC01605在膀胱癌組織中表達(dá)上調(diào)。通過(guò)PCR法檢測(cè)膀胱癌和正常尿路上皮組織以及人類膀胱癌細(xì)胞系中LINC01605的相對(duì)表達(dá)水平，并通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)、集落形成實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)和異種移植瘤小鼠模型等，發(fā)現(xiàn)LINC01605在膀胱癌細(xì)胞和組織中均高表達(dá)，且與組織學(xué)分級(jí)和臨床分期有關(guān)，并通過(guò)生存分析證實(shí)LINC01605高表達(dá)的患者預(yù)后差，并發(fā)現(xiàn)LINC01605可激活上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metalloprotein,MMP-9)的表達(dá)，認(rèn)為L(zhǎng)INC01605可以通過(guò)激活EMT信號(hào)通路和上調(diào)MMP-9表達(dá)，促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。此研究的部分結(jié)論與本研究在口腔鱗癌的結(jié)論相仿。本研究結(jié)果還顯示LINC01605的表達(dá)與腫瘤的分化程度相關(guān)，提示LINC01605對(duì)腫瘤由幼稚到成熟的分化過(guò)程可能有調(diào)控作用，即LINC01605對(duì)腫瘤分化可能有抑制作用[11]。低分化的腫瘤細(xì)胞常伴有更原始的形態(tài)、細(xì)胞有多向分化及旺盛的生長(zhǎng)能力，LINC01605在趨于原始的腫瘤細(xì)胞中具有高表達(dá)，或者說(shuō)具有標(biāo)記作用，提示LINC01605可能具有干細(xì)胞的標(biāo)記作用或促進(jìn)干細(xì)胞分化的相關(guān)功能[12]，但這需要后續(xù)更多實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。本研究結(jié)果還顯示LINC01605的表達(dá)與腫瘤的脈管癌栓相關(guān)，提示LINC01605高表達(dá)可能對(duì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的脈管侵犯或腫瘤細(xì)胞的遷移有關(guān)，也提示LINC01605高表達(dá)預(yù)示著腫瘤具有較強(qiáng)的侵襲性[13]。LINC01605的作用方式復(fù)雜，其在腫瘤中的相關(guān)調(diào)控功能多，雖然多種靶因子如miR-145[14]和EZH2等[15]是已被證實(shí)的調(diào)節(jié)軸，但是由于其下游因子眾多[16-17]，其生物學(xué)調(diào)節(jié)通路可能具有交叉性及協(xié)同性。Yue等[18]從GSE97300、GSE84983、GSE110715、GSE70880和GSE75970微陣列中篩選差異表達(dá)的LncRNA，分析LINC01605的表達(dá)與登記的結(jié)直腺癌患者的臨床表型之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)LINC01605在腫瘤中高表達(dá)，不僅證實(shí)了其高表達(dá)患者預(yù)后差，還發(fā)現(xiàn)了LINC01605受SMYD2-EP300介導(dǎo)的組蛋白H3K4me3和H3K27ac修飾的調(diào)節(jié)，并發(fā)現(xiàn)LINC01605與METTL3結(jié)合能促進(jìn)SPTBN2 mRNA的m6A修飾，促進(jìn)SPTBN2的翻譯，認(rèn)為這是結(jié)腸癌發(fā)生的機(jī)制之一。Garcia-Etxebarria等[19]發(fā)現(xiàn)LINC01605、PROKR2和CCSER1基因可能是結(jié)腸腺瘤惡變的風(fēng)險(xiǎn)基因，且LINC01605可以作為預(yù)測(cè)結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)模型的重要因子。因此要闡明LINC01605的表達(dá)特征與機(jī)制有待更多實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步明確，這不僅對(duì)闡明鱗癌的進(jìn)展有意義[20-21]，還對(duì)基于ceRNA理論闡明LINC01605的作用過(guò)程有更深入的理解[22-23]。本研究結(jié)果證明LINC01605高表達(dá)患者的預(yù)后差，提示檢測(cè)LINC01605的表達(dá)對(duì)初步判斷口腔鱗癌的預(yù)后有一定價(jià)值，但是這需要后續(xù)研究進(jìn)行多中心、大樣本等研究后明確，并對(duì)其可能的臨界值進(jìn)行確定。學(xué)者在其他的惡性腫瘤中也發(fā)現(xiàn)了LINC01605對(duì)預(yù)后判斷有一定價(jià)值[10]，LINC01605在不同腫瘤中對(duì)預(yù)后判斷的價(jià)值也是后續(xù)研究的內(nèi)容。

總之，口腔鱗癌中LINC01605的表達(dá)升高，在病變的形成和進(jìn)展中有重要作用，LINC01605與增殖指標(biāo)具有相關(guān)性，術(shù)后檢測(cè)LINC01605的表達(dá)對(duì)判斷預(yù)后可能有一定價(jià)值。