王俐慧,蘇東風,隋汝波

(1.錦州醫(yī)科大學解放軍北部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地,遼寧 沈陽110042;2.錦州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院,遼寧 錦州 121012)

急性腦梗死是缺血性的病變，其發(fā)生與動脈粥樣硬化有關，多見于老年人。本病具有致殘性疾病，同時也是影響老年人死亡的重要原因之一[1]。在急性腦梗死的早期，影像學常不能提示腦梗死灶，且患者病變較重時亦存在搬運的風險，因此疾病的早期診斷常不能完全依托于影像學[2]。近年學者關注到血清中一些指標在病變早期有改變，這也為臨床尋找特異性強、敏感性好的血清學指標提供了支持[3-4]。微小RNA(micrRNA,miR)是近年發(fā)現(xiàn)的一種非編碼短鏈RNA，其在多種疾病中異常表達，主要作用特征為調控下游的靶基因[5]。學者近年在神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育和病理過程中發(fā)現(xiàn)了不同miR的差異表達，亦在急性腦梗死患者血清和腦脊液中發(fā)現(xiàn)了部分miR的異常表達，認為miR的異常表達在急性腦梗死的發(fā)生發(fā)展中具有一定作用[6]。微小RNA-34b(microRNA-34b,miR-34b)是近年關注度較高的因子，在腫瘤細胞形成及神經(jīng)細胞的缺血再灌注損傷的保護中可能具有一定作用[7]。生信分析顯示miR-34b 與CXC趨化因子配體12(CXC chemokine ligand-12,CXCL12)具有結合的位點，且CXCL12在急性腦梗死中常伴有較高的表達，是病變形成的促進因子?；诖吮緦嶒灆z測急性腦梗死患者血清中miR-34b和CXCL12 的表達特征，探討其相關性及臨床意義，以期為臨床診斷及治療提供幫助。

1 對象與方法

1.1 研究對象 患者均為2021年1月至2021年12月在我院確診并治療的急性腦梗死住院患者。病例納入標準：①初次發(fā)??；②確診后存活時間超過72 h；③均經(jīng)CT或核磁確診。排除標準：①精神疾病史或頭顱部手術史；②血液系統(tǒng)疾病；③出血性腦卒中；④短暫性腦缺血發(fā)作；⑤近期有其他血栓性疾病，如心肌梗死、深靜脈血栓等。共納入87例作為觀察組。收集同期在我院進行體檢證實為無明顯器官質性疾病(主要是無心、腦血管疾病及特殊類型疾病)的成人血清(健康成人)87例作為對照組。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準同意，患者或家屬簽訂知情同意書。

1.2 血清中miR-34b和CXCL12的表達檢測 兩組均留取確診后的空腹靜脈血3 ml，3000 r/min離心15 min后將血清分離。應用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測血清中miR-34b的表達。試劑盒購自上海萊楓生物科技有限公司和美國ABI公司，引物由上海生工生物合成。應用Trizol提取總RNA，并進行濃度和純度的測定(OD260/280比值在1.8～2.1之間)。cDNA第一鏈合成(TaqMan microRNA反轉錄試劑盒)。miR-34b上游引物：5’-TGACAACCGTTTTT-TTGACTG-3’,下游：5’-TACTGTTTTGAAAATC-GTT-3’。以U6作為內參，上游引物：5’-GGAACAGAGAAAGATTAGC-3’，下游：5’-TTGGAATTCACGAATTCCG-3’。程序設定：95 ℃ 10 min，循環(huán)1次；95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。60 ℃采集熒光信號，記錄Ct值。應用羅氏Light Cycler480 Ⅱ PCR儀完成實驗，結果以2-ΔΔCT表示。應用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測血清中CXCL12的表達，試劑盒購自上海碧云天公司。操作均由同一技術人員完成，減少誤差，做好質控工作。

1.3 格拉斯哥預后(GOS)評分 于確診后30 d對患者進行的GOS的評分評定。GOS評分標準：死亡為1分；植物生存，僅有最小反應為2分；重度殘疾，日常生活需要照料為3分；輕度殘疾，但可獨立生活為4分；有輕度缺陷，但能正常生活為5分[8]。

2 結 果

2.1 兩組一般資料比較 見表1。兩組年齡、性別、吸煙史和飲酒史等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。87例腦梗死患者，年齡50～88歲，平均年齡(67.34±7.36)歲，其中男47例，女40例，吸煙36例，不吸煙51例，梗死最大徑0.6～8.2 cm，平均(3.25±0.85)cm。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組miR-34b和CXCL12表達水平比較 見表2。觀察組中 miR-34b的表達水平明顯低于對照組[(1.06±0.25)與(1.32±0.34)，P<0.01]，CXCL12的表達水平明顯高于對照組[(19.47±3.26與(7.37±1.06),P<0.01]。

表2 兩組miR-34b和CXCL12表達水平比較

2.3 急性腦梗死患者血清中miR-34b、CXCL12表達對急性腦梗死的診斷價值 見圖1。miR-34b曲線下面積AUC為0.7187，95%置信區(qū)間(CI)：0.6427～0.7946。血清中miR-34b表達下調對急性腦梗死診斷具有預測價值。CXCL12曲線下面積AUC為0.9880，95%CI：0.9772～0.9988。血清中CXCL12表達上調對急性腦梗死診斷具有預測價值，且CXCL12的預測價值要優(yōu)于miR-34b。

圖1 miR-34b(左)、CXCL12(右)表達對急性腦梗死診斷的ROC曲線

2.4 miR-34b和CXCL12在不同臨床特征中的表達差異 見表3。miR-34b在不同梗死灶最大徑和有無高血壓、高血脂患者的比較中差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，而在不同性別、年齡、有無吸煙和飲酒史的比較中差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。

表3 不同臨床特征中miR-34b和CXCL12表達的差異

2.5 miR-34b、CXCL12表達與GOS評分相關性 見圖2。為進一步研究miR-34b和CXCL12的表達與預后的相關性，利用GOS評分作為急性腦梗死患者發(fā)病后30 d的短期預后判斷指標。其中1分8例，2分23例，3分32例，4分15例，5分8例。相關回歸分析顯示miR-34b與GOS評分具有正相關性(Y=2.059X+0.7179，P<0.01)，CXCL12與GOS評分具有負相關性(Y=-0.05924X+4.062，P<0.01)。

圖2 miR-34b(左)、CXCL12(右)表達與GOS評分的相關性

2.6 miR-34b與CXCL12表達的相關性 見圖3。應用相關回歸分析，顯示miR-34b和CXCL12具有負相關性(Y=-16.24X+36.74，P<0.01)。

圖3 miR-34b與CXCL12表達的相關性

3 討 論

腦梗死的形成與血管損傷和阻塞密切相關，表現(xiàn)為神經(jīng)細胞缺血缺氧性的壞死、脂類物質聚集能力的增強，內皮下血管壁結構的改變等[9-10]。miRNA是近年關注到的與損傷及缺血相關的因子，在病變形成和進展中具有調控作用，miRNA主要作用是調控下游靶基因發(fā)揮作用，并具有轉錄水平的調節(jié)作用[11]。miRNA種類多，作用機制復雜，在細胞周期、分化、細胞增殖和凋亡、炎性進展的調控等方面均有重要作用[12]。miR-34b是在神經(jīng)細胞損傷中關注度較高的因子，劉曉蓓等[7]發(fā)現(xiàn)miR-34b可以調控Keap1減弱神經(jīng)細胞損傷后的氧化應激反應。CXCL12是應用生信分析發(fā)現(xiàn)的與miR-34b有結合位點的因子之一，其可能作為miR-34b的下游因子之一，與腦梗死形成相關。CXCL12為炎性損傷形成過程中調節(jié)相關的重要因子[13-14]，其基因均定位于4q21上，是結構上具有與家族中其他成員具有同源性的小分子的分泌蛋白，不僅能被干擾素誘導產生并活化，還能定向趨化并活化T細胞，促進炎性進展時的免疫性損傷[15]。研究認為CXCL12與受體結合后，能有效激活CD4陽性的T細胞、組織細胞及NK細胞，加速腦梗死形成后神經(jīng)細胞的損傷，并形成局灶區(qū)的炎性反應[16]。

本研究結果顯示急性腦梗死患者血清中miR-34b的表達明顯下調，CXCL12的表達明顯上調，兩者在不同梗死灶最大徑和有無高血壓、高血脂患者的比較中差異有統(tǒng)計學意義，提示miR-34b下調和CXCL12上調均參與急性腦梗死病變的形成和進展。miR-34b表達下調時對神經(jīng)細胞的微環(huán)境有明顯影響，尤其是缺氧后神經(jīng)細胞的應激性損傷[17]，此途徑可能與對CXCL12的調節(jié)作用有關。粥樣硬化是血管損傷及阻塞的重要原因，其機制與巨噬細胞形成及聚集、炎性反應等有關，miR-34b和CXCL12可能均參與機體損傷神經(jīng)細胞周圍巨噬細胞聚集效應，促進機體局部炎性反應[18]。miR-34b下調可能是巨噬細胞的活化及平滑肌細胞反應性增生的誘導因子，參與到脂質代謝過程[19]。但是相關研究均顯示CXCR2、CXCR4和CXCL12等的作用過程相似，這種調控可能還涉及ERK、MAPK、AMPK和NF-κB等更多的橋聯(lián)因子，共同調節(jié)神經(jīng)細胞的損傷、修復及微環(huán)境的改變等[20]。也有研究顯示miRNA可通過調控腫瘤壞死因子的釋放，改善血管內皮細胞的黏附作用，使平滑肌細胞的修復功能增加，當其表達下調后修復功能下降，加重神經(jīng)細胞的損傷[21]。CXCL12與受體CXCR3結合的敏感性和程度較高，能高效誘導炎性相關細胞聚集并釋放相關遞質，如腫瘤壞死因子-α、白介素-6(IL-6)等，促進炎性損傷后細胞增殖的功能。本研究結果顯示miR-34b的下調、CXCL12上調均對急性腦梗死診斷具有預測價值，提示兩指標的改變在病變早期診斷中有重要價值，本研究結果更傾向于CXCL12的預測效果更理想。miR-34b和CXCL12均與發(fā)病后30 d時的GOS評分具有相關性，即miR-34b下調、CXCL12上調的患者預后較差，提示早期檢測miR-34b和CXCL12的表達對患者早期進行預后評估有一定意義。雖然本研究發(fā)現(xiàn)了miR-34b和CXCL12具有診斷及預后評估價值，但是后續(xù)實驗應擴大樣本進行多中心的實驗進一步驗證，并確定其臨界值。

總之，急性腦梗死患者血清中miR-34b的表達下調、CXCL12的表達上調，兩者具有負相關性，對病變形成和進展有一定促進作用，早期檢測miR-34b和CXCL12對判斷預后有一定價值。