陳艷麗,宋 鵬,劉接威,徐楊斌,陳麗文

(寧德師范學(xué)院附屬寧德市醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，福建 寧德352000)

慢性鼻竇炎伴鼻息肉(Chronic rhinosinusitis with nasal polypsis,CRSwNP)根據(jù)嗜酸性粒細(xì)胞(Eosinophils,EOS)浸潤(rùn)程度程度分為嗜酸粒細(xì)胞性慢性鼻竇炎伴鼻息肉(Eosinophilic chronic rhinosinusitis with nasal polyps，ECRSwNP)和非嗜酸粒細(xì)胞性慢性鼻竇炎伴鼻息肉(non-eosinophilic chronic rhinosinusitis with nasal polyps，nECRSwNP)兩類；目前研究[1]證實(shí)，東亞人群中nECRSwNP占比更高，可見(jiàn)明顯中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；同時(shí)nECRSwNP患者接受激素治療效果遜于ECRSwNP。白細(xì)胞介素-17A(Interleukin-17A，IL-17A)是人體內(nèi)常見(jiàn)促炎細(xì)胞因子之一，相關(guān)研究[2]已證實(shí)，其與變應(yīng)性鼻炎、哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種疾病進(jìn)展關(guān)系密切。以往研究[3]證實(shí)，CRSwNP患者鼻黏膜組織中IL-17A水平明顯增高，但對(duì)于IL-17A在nECRSwNP和ECRSwNP人群中表達(dá)情況仍無(wú)明確定論。此外IL-17A還可加快氣道纖維化和氣道重塑進(jìn)程，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞聚集，導(dǎo)致激素治療抵抗發(fā)生及哮喘遷延難愈[4]。本次研究納入我院2018年1月至2020年3月收治行鼻內(nèi)鏡手術(shù)治療CRSwNP患者共84例，分析鼻黏膜組織中IL-17A、CD8+、CD4+、IL-6、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)及IL-23表達(dá)情況，采用FCM確定IL-17A來(lái)源，探討nECRSwNP患者IL-17A表達(dá)特征及可能機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究納入我院2018年1月至2020年3月收治行鼻內(nèi)鏡手術(shù)治療CRSwNP患者共84例，其中男66例，女18例，年齡18～65歲，平均年齡(37.51±6.80)歲。入選患者根據(jù)EOS細(xì)胞數(shù)占炎癥細(xì)胞總數(shù)比例分組，其中>10%設(shè)為ECRSwNP組共28例，≤10%設(shè)為nECRSwNP組共56例。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國(guó)慢性鼻竇炎診斷和治療指南(2018)》診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；②年齡≥18歲；③鼻黏膜組織標(biāo)本送檢病理；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴阿司匹林不耐受三聯(lián)征；②原發(fā)性纖毛運(yùn)動(dòng)功能障礙；③近4周內(nèi)使用糖皮質(zhì)激素或抗真菌藥物；④上頜竇后鼻孔息肉；⑤鼻內(nèi)鏡手術(shù)史；⑥自身免疫系統(tǒng)疾??；⑦妊娠哺乳期女性。本研究方案設(shè)計(jì)符合《赫爾辛基宣言》要求。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集：手術(shù)過(guò)程中收集鼻息肉、竇口鼻道復(fù)合體黏膜組織，去骨質(zhì)并以0.9%氯化鈉溶液清洗表面黏液及血液，放于-80 ℃環(huán)境凍存待ELISA法檢測(cè)；另制備單細(xì)胞懸液完成FCM檢測(cè)。

1.2.2 ELISA法檢測(cè)：采用ELISA法檢測(cè)IL-17A、IL-6、IL-23及TGF-β含量，試劑盒由廣州艾迪康生物技術(shù)有限公司提供，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒由上海生工生物技術(shù)有限公司提供。取適量組織標(biāo)本在液氮中研磨成粉，每100 mg干粉加入1 ml含蛋白酶抑制劑提取緩沖液，4 ℃下10 000 r/min離心10 min，取上清檢測(cè)并計(jì)算被測(cè)蛋白濃度。

1.2.3 FCM法檢測(cè)：FCM檢測(cè)采用BD FACS Calibur全自動(dòng)高速分選流式細(xì)胞儀；一抗、固定/破膜液及激活劑均由美國(guó)達(dá)科為公司提供。首先將新鮮組織標(biāo)本采用PBS充分沖洗，胰酶消化30 min后輕柔研磨；采集濾液制備單細(xì)胞懸液；2×106個(gè)細(xì)胞+2 μl激活劑+1 ml 1640培養(yǎng)基(10%FBS)，37 ℃和5% CO2環(huán)境下避光染色，培養(yǎng)時(shí)間5～6 h。加入U(xiǎn)V染料室溫下避光孵育30 min后離心收集細(xì)胞，加入含細(xì)胞表面標(biāo)記流式抗體100 μl，4 ℃下避光孵育30 min；破膜后加入胞內(nèi)因子抗體標(biāo)記，繼續(xù)4 ℃下避光孵育30 min，最后上樣檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié) 果

2.1 IL-17A來(lái)源 FCM檢測(cè)結(jié)果顯示ECRSwNP組和nECRSwNP組患者IL-17A均主要由Tc17細(xì)胞和Th17細(xì)胞合成，見(jiàn)表1。

表1 FCM法檢測(cè)IL-17A來(lái)源(%)

2.2 兩組鼻黏膜組織相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 nECRSwNP組IL-17A水平、產(chǎn)IL-17A淋巴細(xì)胞比例、產(chǎn)IL-17A的CD8+/CD4+T細(xì)胞比例及Tc17、Th17細(xì)胞比例分別為(157.82±15.89)pg/ml、(10.56±2.80)%、(6.41±1.65)%、(26.96±4.80)%、(3.95±1.87)%、(1.70±0.67)%，均顯著高于ECRSwNP組的(9.10±2.33)pg/ml、(3.19±0.65)%、(2.88±0.62)%、(12.49±2.75)%、(1.63±0.93)%、(0.44±0.15)%(均P<0.001)，見(jiàn)表2。

表2 兩組鼻黏膜組織相關(guān)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

2.3 IL-17A與IL-6、TGF-β及IL-23表達(dá)相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，IL-17A與IL-6間呈正相關(guān)(P<0.001)；IL-17A與TGF-β、IL-23間無(wú)相關(guān)性(均P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 IL-17A與IL-6、TGF-β及IL-23表達(dá)的相關(guān)性

3 討 論

慢性鼻-鼻竇炎是一類異質(zhì)性的鼻腔鼻竇慢性炎癥性疾病，主要臨床表現(xiàn)包括鼻塞、膿涕或鼻涕倒流、頭痛、面部脹痛及嗅覺(jué)減退[6]。中國(guó)慢性鼻竇炎診斷和治療指南(2018)根據(jù)是否合并鼻息肉將慢性鼻-鼻竇炎分為 CRSwNP和慢性鼻-鼻竇炎不伴鼻息肉(CRSsNP)兩類；CRSwNP主要以Th2炎癥反應(yīng)及嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主，而CRSsNP則以Thl炎癥反應(yīng)及非嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主[7]。慢性鼻-鼻竇炎的發(fā)病機(jī)制一直是耳鼻喉科亟待解決的問(wèn)題，目前關(guān)于鼻竇炎發(fā)病的可能機(jī)制有諸多假說(shuō)；金黃色葡萄球菌超抗原可能與鼻竇炎尤其CRSwNP發(fā)生發(fā)展有關(guān)；CRSwNP患者息肉組織通常含有高水平Th2細(xì)胞、IL-5、IL-13及組胺，而嗜酸性組織浸潤(rùn)可能是由于Th2 細(xì)胞通過(guò)IL-5釋放、聚集嗜酸性粒細(xì)胞。然而，另一方面似乎能夠?qū)е麓龠M(jìn)Th細(xì)胞功能的TGF-β和Treg細(xì)胞的總體水平下調(diào)，進(jìn)一步導(dǎo)致了組織水腫和膠原沉積[8]。CRSwNP中觀察到的聚集炎性反應(yīng)通常被分類為由Th2 細(xì)胞介導(dǎo)同時(shí)合并IL-4、IL-5及IL-13 釋放的Ⅱ型炎性反應(yīng)；另外有文獻(xiàn)證明CRSwNP的細(xì)胞因子譜及Th細(xì)胞類別因地理位置而異，其中中國(guó)CRSwNP 患者群體中，Th細(xì)胞極性傾向于Th1和Th17，因此約半數(shù)患者組織中中性粒細(xì)胞水平增加[9]。而另一項(xiàng)研究顯示與83%和50%白人患者相比，僅16%的中國(guó)CRSwNP 患者表達(dá)IL-5，不足10%患者存在組織嗜酸粒細(xì)胞[10]。

有學(xué)者提出對(duì)于CRSwNP患者可根據(jù)鼻息肉組織中嗜酸性粒細(xì)胞的百分比將CRSwNP分為ECRSwNP和nECRSwNP[11]。IL-17A產(chǎn)生依賴于脂多糖或粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子作用于激活單核細(xì)胞，主要作用為誘導(dǎo)Th2細(xì)胞因子表達(dá)，是Th2免疫反應(yīng)中最重要的調(diào)節(jié)因子之一，與哮喘、銀屑病及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生密切相關(guān)[12]。CRSwNP作為一種全球范圍性慢性疾病，盡管很少初選致命性疾病結(jié)局，但其異質(zhì)性和易復(fù)發(fā)性，給患者正常工作生活帶來(lái)極大影響，給社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)較重負(fù)擔(dān)；而其中異質(zhì)性和易復(fù)發(fā)性特征最明顯的ECRSwNP作為其中的典型代表，主要表現(xiàn)為組織的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，且嗜酸性粒細(xì)胞水平與患者鼻腔組織重塑有明顯的相關(guān)性[13]。與西方國(guó)家的ECRSwNP高發(fā)病率相比，亞洲人群中超過(guò)一半(53.6%)的CRSwNP患者表現(xiàn)為nECRSwNP，但考慮到ECRSwNP在復(fù)發(fā)率方面顯著高于nECRSwNP，故ECRSwNP仍獲得醫(yī)學(xué)界的廣泛重視[14]；除一般CRSwNP 的臨床表現(xiàn)外，ECRSwNP另一主要臨床特征為早期的嗅覺(jué)喪失，從現(xiàn)有臨床調(diào)查數(shù)據(jù)分析，大部分ECRSwNP患者疾病早期即可出現(xiàn)嗅覺(jué)功能減退或喪失情況[15]。

本次研究結(jié)果顯示，nECRSwNP組IL-17A水平顯著高于ECRSwNP組，與以往報(bào)道結(jié)果相符。有學(xué)者研認(rèn)為IL-17A可刺激鼻黏膜成纖維細(xì)胞IL-8、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)致癌基因α(GRO-α)等合成量增加，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；同時(shí)其還與中性粒細(xì)胞相關(guān)炎性發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[16]，與本次研究結(jié)果相符。導(dǎo)致nECRSwNP和ECRSwNP患者鼻黏膜組織中IL-17A表達(dá)水平差異原因目前仍存在爭(zhēng)議；既往報(bào)道證實(shí)CRSwNP鼻黏膜組織中IL-17A主要由CD3+T淋巴細(xì)胞合成[17-18]；本次研究中采用FCM法檢測(cè)證實(shí)，ECRSwNP組和nECRSwNP組患者IL-17A均主要由Tc17細(xì)胞和Th17細(xì)胞合成；同時(shí)兩組患者鼻黏膜組織中CD8+和CD4+T細(xì)胞比例比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；此外nECRSwNP組IL-17A水平、產(chǎn)IL-17A淋巴細(xì)胞比例、產(chǎn)IL-17A的CD8+/CD4+T細(xì)胞比例及Tc17/Th17細(xì)胞比例分別為(157.82±15.89)pg/ml、(10.56±2.80)%、(6.41±1.65)%、(26.96±4.80)%、(3.95±1.87)%、(1.70±0.67)%，均顯著高于ECRSwNP組的(9.10±2.33)pg/ml、(3.19±0.65)%、(2.88±0.62)%，(12.49±2.75)%、(1.63±0.93)%、(0.44±0.15)%，以上證據(jù)提示nECRSwNP與ECRSwNP患者CD8+和CD4+T細(xì)胞數(shù)量接近，但nECRSwNP患者分化為Tc17和Th17細(xì)胞能力更強(qiáng)。

最新研究[19-21]結(jié)果顯示，IL-6和TGF-β均是CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化的主要激活細(xì)胞因子；其中IL-6敲除小鼠往往無(wú)法形成Th17細(xì)胞應(yīng)答。IL-23則被證實(shí)可直接作用于分化完成的Th17細(xì)胞，能夠提高Th17細(xì)胞穩(wěn)定性和活性[18]。部分研究[1,12]顯示，Th17細(xì)胞極化相關(guān)細(xì)胞因子可調(diào)控Tc17細(xì)胞分化，同時(shí)IL-6和TGF-β水平升高還可誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞喪失細(xì)胞毒性功能，誘導(dǎo)IL-17合成分泌。對(duì)于nECRSwNP患者Tc17、Th17細(xì)胞分化能力更強(qiáng)具體機(jī)制尚不明確，本次研究中nECRSwNP組IL-6和TGF-β表達(dá)水平顯著高于ECRSwNP組，但兩組間IL-23水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)nECRSwNP患者中IL-6和TGF-β高水平可能與IL-17A高表達(dá)有關(guān)。進(jìn)一步采用Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果顯示IL-17A與IL-6間呈正相關(guān)，但與TGF-β、IL-23間無(wú)相關(guān)性，說(shuō)明nECRSwNP患者IL-6和IL-17A間存在相互促進(jìn)作用，但I(xiàn)L-17A與TGF-β與IL-23并無(wú)無(wú)相關(guān)性，認(rèn)為這可能與以下因素有關(guān)：①TGF-β并非促進(jìn)IL-17A合成分化的獨(dú)立影響因素，存在更為復(fù)雜未知協(xié)同調(diào)控作用存在；②IL-17A與IL-23間并無(wú)簡(jiǎn)單協(xié)同或抑制效應(yīng)存在，IL-23可能僅為Tc17、Th17細(xì)胞分化終產(chǎn)物，但以上推測(cè)仍有待后續(xù)研究進(jìn)一步確證。研究不足：本次研究屬于單中心回顧性報(bào)道，且納入樣本量較少，所得結(jié)論仍有待后續(xù)更為深入研究確證；同時(shí)對(duì)于炎性環(huán)境可刺激Tc17、Th17細(xì)胞分化具體機(jī)制仍有待探索。

綜上所述，nECRSwNP患者鼻黏膜組織IL-17A高表達(dá)與Tc17、Th17細(xì)胞表達(dá)分化增強(qiáng)有關(guān)，同時(shí)IL-17A與IL-6水平間呈正相關(guān)，提示該類人群病變組織特殊炎性環(huán)境可刺激Tc17、Th17細(xì)胞分化。