◎ 隨晶晶，焦春偉,2，陳家明，岑思恩，鄭嬌吉，謝意珍,2

（1.廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510663；2.廣東粵微生物科技有限公司，廣東 肇慶 526000）

靈芝是多孔菌真菌赤芝［Ganoderma lucidum（Leyss.exFr.）Karst.］或紫芝（Ganoderma sinenseJ.D. Zhao，L.W. Hsu & X.Q. Zhang）的干燥子實(shí)體[1]。靈芝菌絲體成熟后釋放的卵型生殖細(xì)胞是靈芝孢子，含有水溶性膳食纖維、水解氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分[2-3]。采用破壁、超臨界CO2流體萃取濃縮靈芝孢子粉，得到含有三萜、不飽和脂肪酸等有效成分的油狀脂質(zhì)物靈芝孢子油。研究表明，靈芝孢子油具有增強(qiáng)免疫力[4-6]、心臟保護(hù)和促進(jìn)傷口愈合等作用[7-8]。

番茄紅素是植物性食物中存在的一類胡蘿卜素，存在于許多紅色蔬菜水果中。研究表明，番茄紅素具有增強(qiáng)免疫力、保護(hù)神經(jīng)、調(diào)節(jié)糖代謝和脂代謝及預(yù)防心血管疾病等作用[9-12]。本研究對(duì)番茄紅素靈芝孢子油軟膠囊開展毒理學(xué)和免疫學(xué)功能試驗(yàn)，以期為番茄紅素靈芝孢子油軟膠囊新產(chǎn)品開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試物

粵微牌番茄紅素靈芝孢子油軟膠囊，廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)環(huán)境條件

KM小鼠：SPF級(jí)，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（粵）2013-0002，質(zhì)量合格證編號(hào)分別為44007200036794、4407200037628、44007200037398和44007200040297；飼料：廣東省醫(yī)學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心；動(dòng)物試驗(yàn)室環(huán)境：屏障環(huán)境，使用許可證號(hào)為SCXK（粵）2013-0011，室溫20～26 ℃，濕度40%～70%。

1.3 儀器與試劑

二氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Fisher公司；CASY DT型細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，德國(guó)Innovatis公司；SOFT maxPRO酶標(biāo)分析儀，瑞士Tecan公司；超凈工作臺(tái)；JJ1000型電子天平，江蘇常熟市雙杰測(cè)試儀器廠。

環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX），Sigma（生產(chǎn)批號(hào)：IVXBC0418V）；NaN3，Sigma-Aldrich（生產(chǎn)批號(hào)：BCBM5389V）；2-AF，Sigma-Aldrich（生產(chǎn)批號(hào)：SLBC3357V）；敵克松，F(xiàn)irst Standard（生產(chǎn)批號(hào)：ALT600523）；絲裂霉素C，Sigma-Aldrich（生產(chǎn)批號(hào)：SLBF5285V）；1,8-二羥蒽醌，Sigma-Aldrich（生產(chǎn)批號(hào)：STBD7414V）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

選體重為18～22 g小鼠20只，雌雄各半，動(dòng)物禁食16 h，不限制飲水，按照0.2 mL/10 g bw（20.0 g受試物加玉米油定容至40.0 mL配制）間隔4 h灌胃2次，連續(xù)觀察7 d，記錄小鼠中毒癥狀和死亡情況。數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)。

1.4.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

將60只小鼠隨機(jī)分陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組和低、中、高3個(gè)劑量組，雌雄各半。各組以0.2 mL·（kg bw）-1劑量灌胃，陰性對(duì)照組（玉米油），受試物低、中、高 劑 量[2.50 g·（kg bw）-1、5.00 g·（kg bw）-1、10.00 g·（kg bw）-1劑量]，陽(yáng)性對(duì)照組[（40 mg·（kg bw）-1劑量的CTX溶液）]。以相同劑量染毒，間隔24 h，第2次染毒6 h后處死小鼠，取其胸骨骨髓制片，吉姆薩染色，每只小鼠在油鏡下記錄1 000個(gè)嗜多染紅細(xì)胞（Polychromatic Erythrocytes，PCE）并計(jì)算各組微核發(fā)生率（%）。統(tǒng)計(jì)看到200個(gè)PCE時(shí)的成熟紅細(xì)胞（Normochromatic Erythrocyte，NCE）數(shù)，計(jì)算嗜多染紅細(xì)胞數(shù)與成熟紅細(xì)胞數(shù)的比值（PCE/NCE）。數(shù)據(jù)用泊松分布方法作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)

將雄性小鼠30隨機(jī)分為低、中、高3個(gè)劑量組、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，各組以0.2 mL/10 g bw每天灌胃1次，連續(xù)5天。陰性對(duì)照組（等量玉米油），受試物低、中、高劑量組[2.50 g·（kg bw）-1、5.00 g·（kg bw）-1、10.00 g·（kg bw）-1劑量]，陽(yáng)性對(duì)照組[40 g·（kg bw）-1劑量的CTX溶液]。染毒后34 d后處死小鼠，取雙側(cè)副睪制片并染色，在高倍鏡下鏡檢觀察每只小鼠，并計(jì)數(shù)1 000條完整的精子。每組共檢查5 000條精子，計(jì)算精子畸形發(fā)生率（‰）。數(shù)據(jù)用Wilcoson秩和檢驗(yàn)方法作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4.4 Ames試驗(yàn)

選用組氨酸缺陷型鼠傷寒沙門氏菌株TA97、TA98、TA100和TA102，向頂層培養(yǎng)基中加入試驗(yàn)菌株增菌液0.10 mL，受試物溶液0.1 mL（50.00 mg·mL-1、10.00 mg·mL-1、2.00 mg·mL-1、0.40 mg·mL-1和0.08 mg·mL-1二甲基亞砜溶解液）和多氯聯(lián)苯（PCB）0.5 mL誘導(dǎo)的大鼠肝臟勻漿S9液為代謝活化系統(tǒng)，同時(shí)設(shè)置未處理對(duì)照組、溶劑對(duì)照組（二甲基亞砜）及陽(yáng)性對(duì)照組（NaN3、2-AF、敵克松、絲裂霉素C和1,8-二羥蒽醌）。染毒后以37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，記錄每皿回變菌落數(shù)。

1.4.5 免疫功能試驗(yàn)

將小鼠分為低、中、高劑量組和陰性對(duì)照組4組，低、中、高劑量組分別灌胃40 mg·（kg bw）-1、80 mg·（kg bw）-1、250 mg·（kg bw）-1的番茄紅素靈芝孢子油軟膠囊，持續(xù)4周。根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》要求進(jìn)行遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和抗體生成細(xì)胞試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果以（xˉ±s）表示，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

受試物急性毒性試驗(yàn)結(jié)果如表1所示，小鼠口服受試物在一周觀察期內(nèi)未見任何中毒癥狀，無(wú)一例動(dòng)物死亡，MTD＞20 g·（kg bw）-1。按照急性毒性分級(jí)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)毒性。

表1 受試物急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表

2.2 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

陽(yáng)性對(duì)照組（CTX）雌雄小鼠微核率顯著高于陰性對(duì)照組（P＜0.01）；各劑量組雌雄小鼠微核率、NCE、PCE/NCE與陰性對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性（見表2）。

表2 受試物對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果表

2.3 小鼠精子畸形試驗(yàn)

陽(yáng)性對(duì)照組（CTX）雄性小鼠精子畸形率顯著高于陰性對(duì)照組（P＜0.01）；各劑量組雄性小鼠精子畸形率與陰性對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），每個(gè)劑量組分別與陰性對(duì)照組比較，畸形率至少為陰性組的倍數(shù)或經(jīng)統(tǒng)計(jì)有顯著意義即判定為陽(yáng)性。因此，精子畸形試驗(yàn)結(jié)果為陰性（見表3）。

表3 受試物對(duì)小鼠精子畸形試驗(yàn)結(jié)果表

2.4 Ames試驗(yàn)

受試物對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的回變菌落數(shù)結(jié)果如表4所示。各劑量組的回變菌落數(shù)與陰性對(duì)照組無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；當(dāng)受試物組回變菌落數(shù)增加1倍以上（即回變菌落數(shù)等于或大于2乘以未處理對(duì)照數(shù)），并有劑量-反應(yīng)關(guān)系或至少某一測(cè)試點(diǎn)有可重復(fù)的并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的陽(yáng)性反應(yīng)即判定為陽(yáng)性。本試驗(yàn)4種菌株各劑量回變突變菌落數(shù)低于陰性對(duì)照組2倍，Ames試驗(yàn)陰性。

表4 受試物對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的回變菌落數(shù)表

2.5 免疫功能試驗(yàn)

受試物的免疫功能試驗(yàn)結(jié)果如表5所示，與陰性對(duì)照組比較，低劑量組能顯著增加足跖增厚值（P＜0.05），中劑量組能顯著增強(qiáng)Con A誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞增殖（P＜0.05），中劑量和高劑量組能顯著增加溶血空斑數(shù)（P＜0.01）。結(jié)果表明，綿羊紅細(xì)胞誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)、Con A誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖試驗(yàn)和綿羊紅細(xì)胞免疫受試動(dòng)物后脾細(xì)胞抗體生成的試驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性。體液免疫由B細(xì)胞介導(dǎo)，主要針對(duì)胞外病原體與毒素；細(xì)胞免疫由T細(xì)胞介導(dǎo)，主要針對(duì)胞內(nèi)病原體，如胞內(nèi)寄生菌、病毒等[13]。番茄紅素靈芝孢子油軟膠囊能夠增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫功能。

3 結(jié)論

本研究中采用MTD的急性毒性試驗(yàn)劑量為20.0 g·（kg bw）-1，相當(dāng)于受試物日服用量的2 400倍；在10.0 g·（kg bw）-1、5.0 g·（kg bw）-1、2.5 g·（kg bw）-1劑量下進(jìn)行小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、精子畸形試驗(yàn)和4種菌種的Ames試驗(yàn)，相當(dāng)于受試物日服用量300～1 200倍，所有指標(biāo)均未顯示毒性。

功能試驗(yàn)中，受試物能增強(qiáng)脾細(xì)胞抗體的生成，表明受試物能夠增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫功能；受試物能進(jìn)一步增強(qiáng)小鼠遲發(fā)性變態(tài)反應(yīng)和脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，表明受試物能增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫功能。

本研究表明，番茄紅素靈芝孢子油軟膠囊使用安全且有提高機(jī)體免疫力的功能作用，具有保健食品的開發(fā)前景。