邱樂宏,鄧 偉，王 濤

海南省人民醫(yī)院/海南醫(yī)學(xué)院附屬海南醫(yī)院口腔科，海南?？?570311

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)是常見的口腔癌，每年大約有50萬人死于口腔癌。目前仍有超過60%的OSCC病例直到晚期才被確診。研究表明，OSCC的病因與原癌基因的激活和過表達(dá)相關(guān)[1-2]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一種非蛋白編碼RNA轉(zhuǎn)錄本，其失調(diào)被認(rèn)為是惡性腫瘤的潛在診斷靶點[3]。CAO等[4]發(fā)現(xiàn)，上調(diào)lncRNA-RMRP可促進(jìn)膀胱癌遷移。lncRNA CDKN2BAS通過miR-153-5p促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移[5]。lncRNA HOTAIR(HOX反義基因間RNA)定位于第12條染色體，轉(zhuǎn)錄自HOXC位點的反義鏈。ZHAO等[6]發(fā)現(xiàn)，lncRNA HOTAIR異常表達(dá)與癌癥進(jìn)展密切相關(guān)，lncRNA HOTAIR通過miR-20a-5p/HMGA2軸影響乳腺癌細(xì)胞的生長、遷移、侵襲和凋亡。此外，lncRNA HOTAIR通過下調(diào)miRNA-34a促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生[7]。但lncRNA HOTAIR調(diào)控口腔癌進(jìn)展的具體機(jī)制尚不明確。本研究主要分析了lncRNA HOTAIR在OSCC中的表達(dá)和調(diào)控OSCC進(jìn)展的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 2020年10月至2021年6月本院行手術(shù)切除的患者提供OSCC組織標(biāo)本36份，經(jīng)組織病理診斷為OSCC，20份相鄰癌旁正常組織標(biāo)本。所有病例術(shù)前均未進(jìn)行放射治療和化療。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，且所有患者知情同意，所取標(biāo)本立即在冰箱中快速冷凍。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及其細(xì)胞轉(zhuǎn)染 人OSCC細(xì)胞系(TSCCA、Tca8113)和人口腔角質(zhì)形成細(xì)胞(HOK)從中國科學(xué)院(中國上海)獲得。細(xì)胞株在添加10%胎牛血清(美國Life Technologies公司)、青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 mg/mL)的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37 ℃和5% CO2的潮濕空氣中生長。由GenePharma (中國上海)合成并獲得干擾對照質(zhì)粒(siRNA NC)、HOTAIR干擾質(zhì)粒(HOTAIR siRNA)、ADAMTS-4干擾質(zhì)粒(ADAMTS-4 siRNA)、過表達(dá)對照質(zhì)粒[pcDNA-3.1(+)]和HOTAIR過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-HOTAIR)及模擬物對照(mimics NC)、miR-126模擬物(miR-126 mimics)、抑制劑對照(inhibitor NC)、miR-126抑制劑(miR-126 inhibitor)。用Lipofectamine 2000(美國Life Technologies公司)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。48 h后，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.2.2雙熒光素酶試驗 利用靶基因預(yù)測軟件(TargetScan和miRcode)預(yù)測靶基因。該位點的DNA片段在體外合成，序列插入到psi-CHECKTM-2載體下游，構(gòu)建lncRNA HOTAIR野生型質(zhì)粒(HOTAIR wt)和ADAMTS野生型質(zhì)粒(ADAMTS-4 wt)。設(shè)計引物對與lncRNA HOTAIR、ADAMTS-4 3′UTR結(jié)合的種子序列區(qū)域進(jìn)行突變，構(gòu)建lncRNA HOTAIR突變型質(zhì)粒(HOTAIR mut)和ADAMTS-4突變型質(zhì)粒(ADAMTS-4 mut)。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分為兩大組，每組分為4小組，(1)A組：lncRNA HOTAIR wt+mimics NC；B組：lncRNA HOTAIR wt+miR-126 mimics；C組：lncRNA HOTAIR mut+mimics NC；D組：lncRNA HOTAIR mut+miR-126 mimics。(2)A組：ADAMTS-4 wt+mimics NC；B組：ADAMTS-4 wt+miR-126 mimics；C組：ADAMTS-4 mut+mimics NC；D組：ADAMTS-4 mut+miR-126 mimics。分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，采用雙熒光素酶檢測試劑盒(E1910,Promega,Madison,WI)檢測腎細(xì)胞熒光素酶活性，螢火蟲熒光素酶活性作為內(nèi)參。

1.2.3CCK-8法檢測TCA8113細(xì)胞活力 為明確lncRNA HOTAIR、miR-126和ADAMTS-4對Tca8113細(xì)胞增殖活力的影響，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分為以下3大組，(1)1組分為3小組：A為siRNA NC；B為HOTAIR siRNA；C為ADAMTS-4 siRNA；(2)2組分為兩小組：A為inhibitor NC；B為miR-126 inhibitor；(3)3組分為4小組：A為pcDNA-3.1(+)+mimics NC；B為pcDNA-HOTAIR+mimics NC；C為pcDNA-3.1(+)+miR-126 mimics；D為pcDNA-HOTAIR+miR-126 mimics。轉(zhuǎn)染成功后，將細(xì)胞(2×103)置于96孔板中培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液。細(xì)胞在37 ℃孵育2 h。用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測吸光度，試驗均為3個重復(fù)。

1.2.4Transwell試驗檢測細(xì)胞侵襲 取出基質(zhì)在冰上融化，用不完全的DMEM培養(yǎng)基(1∶8)稀釋。50 μL基質(zhì)上室在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。各組細(xì)胞用無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌2次。為明確lncRNA HOTAIR、miR-126和ADAMTS-4對Tca8113細(xì)胞侵襲的影響，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分為以下3大組，(1)1組分為3小組：A為siRNA NC；B為HOTAIR siRNA；C為ADAMTS-4 siRNA；(2)2組分為兩小組：A為inhibitor NC；B為miR-126 inhibitor；(3)3組分為4小組：A為pcDNA-3.1(+)+mimics NC；B為pcDNA-HOTAIR+mimics NC；C為pcDNA-3.1(+)+miR-126 mimics；D為pcDNA-HOTAIR+miR-126 mimics，并進(jìn)行相應(yīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。48 h后將細(xì)胞密度調(diào)整至1×109/L;將100 μL的細(xì)胞接種到Transwell室中，將含10%胎牛血清的500 μL DMEM作為趨化因子加入24孔培養(yǎng)板的下室。8 h后取出腔體。用棉簽拭除頂部殘留的細(xì)胞，固定15 min，用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，在光鏡下計數(shù)。

1.2.5實時熒光定量PCR(RT-qPCR) 培養(yǎng)Tca8113細(xì)胞，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分為以下4組：A為pcDNA-3.1(+)+mimics NC；B為pcDNA-HOTAIR+mimics NC；C為pcDNA-3.1(+)+miR-126 mimics；D為pcDNA-HOTAIR+miR-126 mimics，進(jìn)行相應(yīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染成功后收取細(xì)胞RNA樣。使用Trizol試劑(美國Life Technologies公司)從OSCC組織和細(xì)胞系中提取總RNA。RNA的濃度和質(zhì)量由NanoDrop 2000(美國Quawell公司)測定。采用Super ScriptTMⅢ反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(美國Life Technologies公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。采用TaqMan Universal Master Mix Ⅱ進(jìn)行RT-qPCR檢測，循環(huán)次數(shù)記錄為Ct。RT-qPCR：95 ℃處理15 s，60 ℃處理30 s，74 ℃處理30 min(40個循環(huán))，采用GAPDH作為內(nèi)部控制。結(jié)果采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析。引物：lncRNA HOTAIR F(5′-3′)：CAG TGG GGA ACT CTG ACT CG；R(5′-3′)：GTG CCT GGT GCT CTC TTA CC。miR-126 F(5′-3′)：GGC TCG TAC CGT GAG TAA T ；R(5′-3′)：GTG CAG GGT CCG AGG T。ADAMTS-4 F(5′-3′)：CCC AAG CAT CCG CAA TCC 3′；R(5′-3′)：CAG GTC CTG ACG GGT AAA CA。GAPDH F(5′-3′)：GAA GGT GAA GGT CGG AGT C；R(5′-3′)：GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 本研究使用凋亡檢測試劑盒(中國南京凱基生物科技有限公司)。細(xì)胞培養(yǎng)與上述相同。為明確lncRNA HOTAIR、miR-126和ADAMTS-4對Tca8113細(xì)胞凋亡的影響，同1.2.3進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞培養(yǎng)液吸收到適當(dāng)?shù)碾x心管中，用PBS沖洗貼壁細(xì)胞一次。細(xì)胞經(jīng)適量胰酶(含EDTA)消化后移至離心管。用200 μL Annexin V-FITC結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC，室溫黑暗孵育10 min。100 μL Annexin V-FITC結(jié)合緩沖液再固定細(xì)胞，加入10 μL PI，輕輕混勻，置于4 ℃黑暗中。流式細(xì)胞術(shù)檢測30～60 min。Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

2 結(jié) 果

2.1lncRNA HOTAIR、miR-126和ADAMTS-4在OSCC中的差異表達(dá)與癌旁組織比較，OSCC組織中l(wèi)ncRNA HOTAIR、ADAMTS-4基因表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，miR-126表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與HOK細(xì)胞比較，TSCCA、Tca8113細(xì)胞中l(wèi)ncRNA HOTAIR、ADAMTS-4基因表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，miR-126表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見圖1。

注：A為lncRNA HOTAIR、miR-126和ADAMTS-4在OSCC組織和癌旁組織的基因表達(dá)；B為lncRNA HOTAIR、miR-126和ADAMTS-4在HOK、TSCCA、Tca8113細(xì)胞中的基因表達(dá)；*P<0.05。圖1 lncRNA HOTAIR、miR-126和ADAMTS-4在OSCC中的差異表達(dá)

2.2HOTAIR siRNA對Tca8113細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響 lncRNA HOTAIR siRNA組Tca8113細(xì)胞內(nèi)lncRNA HOTAIR基因表達(dá)明顯低于siRNA NC組(P<0.01)。與siRNA NC組比較，HOTAIR siRNA組Tca8113細(xì)胞活力下調(diào)(P<0.01)，細(xì)胞凋亡率上升(P<0.01)，細(xì)胞侵襲數(shù)目減少(P<0.05)。見圖2、表1。

注：A為RT-qPCR檢測lncRNA HOTAIR的基因表達(dá)；B為CCK-8法檢測細(xì)胞活力；C、D為流式細(xì)胞儀檢測兩組細(xì)胞凋亡率；E、F為Transwell試驗檢測兩組細(xì)胞侵襲數(shù)目；*P<0.05。圖2 HOTAIR siRNA對Tca8113細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響

表1 HOTAIR siRNA對Tca8113細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響

2.3lncRNA HOTAIR與miR-126的關(guān)系分析 結(jié)果顯示，lncRNA HOTAIR 3′UTR和miR-126之間具有結(jié)合位點，見圖3A。與HOTAIR wt+mimics NC組比較，HOTAIR wt+miR-126 mimics組細(xì)胞熒光素酶活性下調(diào)(P<0.01)；與HOTAIR mut+mimics NC組比較，HOTAIR mut+miR-126 mimics組細(xì)胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3B。

注：A為預(yù)測lncRNA HOTAIR與miR-126的結(jié)合位點；B為檢測熒光素酶活性；*P<0.05。圖3 lncRNA HOTAIR與miR-126的關(guān)系分析

2.4miR-126 inhibitor對Tca8113細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響 miR-126 inhibitor組Tca8113細(xì)胞內(nèi)miR-126表達(dá)低于inhibitor NC組(P<0.01)。與inhibitor NC組比較，miR-126 inhibitor組Tca8113細(xì)胞活力上調(diào)(P<0.01)，細(xì)胞凋亡率降低(P<0.01)，細(xì)胞侵襲數(shù)目增加(P<0.01)，見圖4、表2。

注：A為RT-qPCR檢測 miR-126的基因表達(dá)；B為CCK-8法檢測細(xì)胞活力；C、D為流式細(xì)胞儀檢測兩組細(xì)胞凋亡率；E、F為Transwell試驗檢測兩組細(xì)胞侵襲數(shù)目；*P<0.05。圖4 miR-126 inhibitor對Tca8113細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響

表2 miR-126 inhibitor對Tca8113細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響

2.5lncRNA HOTAIR靶向miR-126對Tca8113細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲的影響 與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組比較，pcDNA-HOTAIR+mimics NC組細(xì)胞增殖活力上升(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率降低(P<0.01)，細(xì)胞侵襲數(shù)目增加(P<0.01)；與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組比較pcDNA-3.1(+)+miR-126 mimics組細(xì)胞增殖活力下調(diào)(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率上升(P<0.01)，細(xì)胞侵襲數(shù)目減少(P<0.01)；與pcDNA-3.1(+)+miR-126 mimics組比較，pcDNA-HOTAIR+miR-126 mimics組細(xì)胞增殖活力上升(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率降低(P<0.01)，細(xì)胞侵襲數(shù)目增加(P<0.01)，見圖5、表3。

注：A為CCK-8法檢測細(xì)胞活力；B～E為流式細(xì)胞儀檢測4組細(xì)胞凋亡率；F～I(xiàn)為Transwell試驗檢測4組細(xì)胞侵襲數(shù)目；*P<0.05。圖5 lncRNA HOTAIR靶向iR-126對Tca8113細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲的影響

表3 lncRNA HOTAIR靶向miR-126對Tca8113細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲的影響

2.6miR-126與ADAMTS-4的關(guān)系分析 結(jié)果顯示，ADAMTS-4 3′UTR和miR-126之間具有結(jié)合位點，見圖6A。與ADAMTS-4 wt+mimics NC組比較，ADAMTS-4 wt+miR-126 mimics組細(xì)胞熒光素酶活性下調(diào)(P<0.01)；與ADAMTS-4 mut+mimics NC組比較，ADAMTS-4 mut+miR-126 mimics組細(xì)胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖6B。

注：A為預(yù)測miR-126與ADAMTS-4的結(jié)合位點；B為檢測熒光素酶活性；*P<0.05。
圖6 miR-126與ADAMTS-4的關(guān)系分析

2.7lncRNA HOTAIR靶向miR-126對ADAMTS-4表達(dá)的影響 與pcDNA-3.1(+)+mimics NC組比較，pcDNA-HOTAIR+mimics NC組細(xì)胞內(nèi)ADAMTS-4表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，pcDNA-3.1(+)+miR-126 mimics組細(xì)胞內(nèi)ADAMTS-4表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)；與pcDNA-3.1(+)+miR-126 mimics組比較，pcDNA-HOTAIR+miR-126 mimics組細(xì)胞內(nèi)ADAMTS-4表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，見圖7。

注：*P<0.05。圖7 lncRNA HOTAIR靶向miR-126對ADAMTS-4表達(dá)的影響

2.8ADAMTS-4 siRNA對Tca8113細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響 ADAMTS-4 siRNA組Tca8113細(xì)胞內(nèi)ADAMTS-4基因表達(dá)明顯低于siRNA NC組(P<0.01)。與siRNA NC組比較，ADAMTS-4 siRNA組Tca8113細(xì)胞活力下調(diào)(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率上升(P<0.01)，細(xì)胞侵襲數(shù)目減少(P<0.05)。見圖8、表4。

注：A為RT-qPCR檢測ADAMTS-4的基因表達(dá)；B為CCK-8法檢測細(xì)胞活力；C、D為流式細(xì)胞儀檢測兩組細(xì)胞凋亡率；E、F為Transwell試驗檢測兩組細(xì)胞侵襲數(shù)目；*P<0.05。圖8 ADAMTS-4 siRNA對Tca8113細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響

表4 ADAMTS-4 siRNA對Tca8113細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響

3 討 論

發(fā)現(xiàn)新的、有效的用于OSCC診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物將有助于改善患者的臨床預(yù)后。有研究結(jié)果表明，lncRNA在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其被認(rèn)為是OSCC等腫瘤診斷和判斷預(yù)后的標(biāo)志物[7]。本研究結(jié)果顯示，lncRNA HOTAIR和ADAMTS-4在OSCC組織和細(xì)胞中明顯上調(diào)，miR-126明顯下調(diào)。lncRNA HOTAIR和ADAMTS-4沉默可抑制Tca8113細(xì)胞的增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。筆者還發(fā)現(xiàn)，lncRNA HOTAIR在OSCC組織中發(fā)揮致癌作用，并通過miR-126調(diào)節(jié)其靶蛋白ADAMTS-4的表達(dá)。

有研究結(jié)果表明，lncRNA的異常表達(dá)和功能障礙與OSCC等疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[8]。JIANG等[9]發(fā)現(xiàn)，lncRNA HOTAIR下調(diào)可通過microRNA-130a降低胰島素樣生長因子1的表達(dá)，從而緩解大鼠多囊卵巢綜合征。MA等[10]研究表明，lncRNA HOTAIR通過上調(diào)FASN參與鼻咽癌的發(fā)生。JIANG等[11]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA HOTAIR可通過調(diào)控STAT3/Cyclin D1軸抑制胃癌生長。另外還有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA UCA1通過抑制miR-184的表達(dá)促進(jìn)OSCC細(xì)胞的增殖和順鉑耐藥[12]。過表達(dá)lncRNA JPX通過miR-944/CDH2軸促進(jìn)OSCC惡性發(fā)展[13]。本研究結(jié)果顯示，lncRNA HOTAIR在OSCC組織中表達(dá)上調(diào)，敲減HOTAIR表達(dá)后，Tca8113細(xì)胞的增殖和侵襲能力明顯受到抑制，細(xì)胞凋亡率明顯升高，但lncRNA HOTAIR在Tca8113細(xì)胞中的作用及其分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

HU等[14]研究表明，lncRNA TMPO-AS1通過海綿miR-126-5p加速胃癌進(jìn)展和血管生成。WANG等[15]發(fā)現(xiàn)，lncRNA HOTAIR通過海綿miR-216和靶向ZEB1促進(jìn)骨肉瘤的發(fā)展。LI等[16]研究結(jié)果表明，miR-126通過抑制癌細(xì)胞凋亡和自噬促進(jìn)食管鱗癌的發(fā)生，提示miR-126在癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲發(fā)展過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果表明，miR-126與lncRNA HOTAIR具有結(jié)合位點，在OSCC細(xì)胞系中，lncRNA HOTAIR能夠直接靶向結(jié)合miR-126。為了進(jìn)一步探討miR-126對OSCC組織Tca8113細(xì)胞發(fā)展的影響，筆者將miR-126 inhibitor轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞并檢測了細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲情況，結(jié)果顯示，下調(diào)miR-126表達(dá)明顯促進(jìn)了Tca8113細(xì)胞增殖與侵襲，抑制癌細(xì)胞凋亡，提示miR-126在OSCC細(xì)胞發(fā)展過程中具有明顯的抑癌作用。本研究結(jié)果還表明，上調(diào)lncRNA HOTAIR表達(dá)能夠通過海綿miR-126促進(jìn)Tca8113細(xì)胞增殖和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡，更進(jìn)一步闡明了lncRNA HOTAIR的作用機(jī)制。然而，miR-126調(diào)控的靶基因尚不清楚。此外，本研究結(jié)果顯示，miR-126與ADAMTS-4具有結(jié)合位點。敲減ADAMTS-4表達(dá)后，Tca8113細(xì)胞增殖和侵襲能力下降，細(xì)胞凋亡率上升。有研究表明，ADAMTS-4在人類腫瘤組織中普遍表達(dá)上調(diào)，在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮致癌作用[17]。閆棟等[17]發(fā)現(xiàn)，浸潤性乳腺癌組織中ADAMTS-4表達(dá)上調(diào)且癌細(xì)胞活性明顯增強(qiáng)。本研究結(jié)果提示，ADAMTS-4可能通過lncRNA HOTAIR/miR-126整合通路調(diào)控，其異常表達(dá)參與了OSCC的惡性發(fā)展進(jìn)程，這可能為OSCC的治療提供新的思路。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，lncRNA HOTAIR在OSCC組織中表達(dá)上調(diào)，lncRNA HOTAIR基因敲除可抑制OSCC細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，并通過miR-126/ADAMTS-4軸在OSCC細(xì)胞中發(fā)揮促癌作用，這些數(shù)據(jù)為OSCC發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了新的見解。雖然HOTAIR已被確定為癌基因，但lncRNA HOTAIR在OSCC組織中發(fā)揮致癌作用的可能機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。