李宏豐，李 剛，云惟琳，張前飛，張秋葉

文昌市人民醫(yī)院：1.耳鼻咽喉科；2.檢驗科，海南文昌 571300

鼻咽癌在我國南方和東南亞地區(qū)高度流行，年發(fā)病率為15/100 000～50/100 000[1]。然而，由于發(fā)病部位隱匿，多數(shù)患者早期無癥狀或僅表現(xiàn)出非特異性癥狀，80%以上的鼻咽癌患者在晚期(Ⅲ或Ⅳ期)才被首次確診，這導致患者生存率大大降低[2-3]。因此，鼻咽癌的早期診斷是一個重大的臨床挑戰(zhàn)。異常的DNA甲基化已被報道為鼻咽癌等癌癥的一種重要病變機制，甚至在癌變早期就能夠檢測到[4]。循環(huán)細胞游離DNA(ccfDNA)是存在于循環(huán)體液中游離狀態(tài)的DNA，被認為與細胞的壞死、凋亡等相關[5]。近年來ccfDNA甲基化檢測作為一種液體活組織檢查技術已成為疾病診療中的研究熱點[6]。在許多癌癥類型中，RAS樣雌激素調節(jié)生長因子(RERG)基因普遍以“全基因組”或“整體”DNA高甲基化的形式出現(xiàn)，進而導致RERG蛋白低表達。因此，RERG基因高甲基化是許多癌癥常見的特征性甲基化變化之一[7-8]。在本研究中，筆者利用實時熒光定量PCR法DNA甲基化分析(qAMP)評估ccfDNA中RERG mRNA甲基化狀態(tài)作為預期的鼻咽癌篩選生物標志物的潛力。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1月至2021年6月本院100例經組織學確診的原發(fā)性鼻咽癌患者作為鼻咽癌組，另選取97例年齡、性別相匹配的非癌志愿者作為對照組。本研究已獲本院醫(yī)學倫理審查委員會批準通過(批準號：2019-10-07)。所有參與者均簽署書面知情同意書，并接受內窺鏡檢查。鼻咽癌組納入標準：經病理活檢和影像學檢查確診為鼻咽癌，為初診患者且具有完整的病歷資料。鼻咽癌組排除標準：(1)既往接受過放化療或有其他惡性腫瘤病史，如非鼻咽癌頭頸部惡性腫瘤或下腔靜脈癌；(2)合并有嚴重心腦血管疾病、肝、腎、肺、胃腸等基礎疾病。對照組納入標準：年齡、性別與鼻咽癌組患者人群相匹配，經血液和超聲等相關檢查排除任何惡性腫瘤的臨床證據(jù)。對照組排除標準：(1)存在惡性腫瘤的臨床證據(jù)和高危因素(鼻咽癌病史、吸煙、飲酒、經常食用腌制或鹽漬食品)；(2)存在有毒化學品等職業(yè)暴露；(3)合并有嚴重心腦血管疾病、肝、腎、肺、胃腸等基礎疾病。鼻咽癌組中男67例，女33例；年齡19～78歲，平均(51.27±14.99)歲；根據(jù)AJCC/UICC第8版分期系統(tǒng)[9]，進行臨床分期：TNM分期Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ～Ⅳ期66例；T1分期25例，T2分期34例，T3分期30例，T4分期11例；N0/1分期55例，N2/3分期45例；M0分期100例；Charlson合并癥指數(shù)中位值1分(范圍：0～3分)。對照組中男63例，女34例；年齡19～81歲，平均(50.79±15.19)歲；Charlson合并癥指數(shù)中位值1分(范圍：0～3分)，對照組EB病毒(EBV)檢測均為陰性。兩組年齡、性別構成、Charlson合并癥指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1血液采集 采集患者入院時靜脈外周血5 mL于乙二胺四乙酸(EDTA)管中。血液在4 ℃下3 500 r/min離心10 min，收集血漿，然后在4 ℃下20 000 r/min離心10 min，去除額外的細胞碎片和來自受損血細胞的基因組核酸污染?；顧z標本和血漿保存在-80 ℃，備用。另外收集鼻咽癌組患者EBV檢測結果，包括衣殼抗原-早期抗原免疫球蛋白A(VCA-IgA)、早期抗原-早期抗原免疫球蛋白A(EA-IgA)、核心抗原(EBNA1-IgA)、EBV DNA拷貝數(shù)。

1.2.2活檢組織DNA和ccfDNA提取 將活檢標本用核糖核酸酶處理后，利用QIAamp DNA Mini試劑盒(德國Qiagen公司)提取總RNA游離基因組DNA。組織DNA用超凈水洗脫。對于血漿樣品，用NanoDrop 2000超微量分光光度計測定414 nm處的光密度值(溶血臨界值為0.13)。使用QIAamp MinElute ccfDNA Mini試劑盒(德國Qiagen公司)提取ccfDNA，每個受試者的血漿標本2 mL(1毫升/柱)用于DNA提取，每個色譜柱用30 μL超凈水洗脫。從一份200 μg的組織標本中提取的組織DNA平均水平為50～240 ng，從一份血漿標本中提取的ccfDNA平均水平為3 ng。

1.2.3RERG基因甲基化率檢測 通過qAMP法量化基因啟動子甲基化率[10]。使用EpiTect Methyl Ⅱ DNA restriction Kit(德國Qiagen公司)，用甲基化敏感和/或甲基化依賴的限制性內切酶對分離的ccfDNA進行處理，包括非酶(Mo)、甲基化敏感酶(Ms)、甲基化依賴酶(Md)和甲基化敏感依賴酶(Msd)。反應消化液在37 ℃孵化過夜。培養(yǎng)后，在65 ℃加熱滅活酶20 min后停止反應。采用 RT2 SYBR Green ROX qPCR Mastermix(德國Qiagen公司)和EpiTect Methyl Ⅱ PCR Primer Assay(德國Qiagen公司)分別對Mo、Ms、Md和Msd 4項指標進行甲基化定量PCR。數(shù)據(jù)分析模板用于計算甲基化率和數(shù)據(jù)質量控制。甲基化定量PCR的閾值周期值由制造商提供的數(shù)據(jù)分析電子表格計算，只有當單錯校正和雙錯校驗結果為“通過”(意味著限制性內切酶是活躍的，能有效地消化DNA)時，才使用目標基因的甲基化率進行統(tǒng)計分析。

1.2.4生物信息學分析 這項研究包括來自TCGA數(shù)據(jù)庫(https：//portal.gdc.cancer.gov)的兩組數(shù)據(jù)，RNA-Seq轉錄本數(shù)據(jù)和來自頭頸部鱗狀細胞癌(HNSC)標本的相應患者臨床數(shù)據(jù)(HTSeq-FPKM類型)通過數(shù)據(jù)傳輸工具(GDC癌癥數(shù)據(jù)共享系統(tǒng))獲得，共下載了528例HNSC患者HNSC組織和44例正常組織的RNA-Seq數(shù)據(jù)。將HTSeq-FPKM數(shù)據(jù)轉換為TPM(每百萬轉錄本讀數(shù))進行分析。根據(jù)HNSC患者RERG mRNA的中位表達值，分為低表達組和高表達組。這項研究使用R軟件從GEO數(shù)據(jù)庫中下載了GSE41613數(shù)據(jù)表中的RERG mRNA 表達數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，作為生存分析的外部驗證。通過Kaplan-Meier 分析評估RERG mRNA 的預后意義。此外RERG mRNA的拷貝數(shù)變異(CNV)和甲基化水平數(shù)據(jù)是通過 cBioPortal網絡平臺(https：//www.cbioportal.org/)獲得的。利用SMART網絡平臺(http：//www.bioinfo-zs.com/smartapp/)分析和比較TCGA數(shù)據(jù)中RERG mRNA在HNSC組織和正常組織中的甲基化水平。使用MethSurv在線工具(https：//biit.cs.ut.ee/methsurv/)分析RERG mRNA甲基化水平的預后價值。β值表明DNA甲基化程度從0(未甲基化)到1(完全甲基化)不等。不同的β值最佳截斷值已被認為表明超甲基化(β值：0.50～0.70)或低甲基化(β值：0.25～0.30)。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析，呈偏態(tài)分布的計量資料以M(P25，P75)表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗。繪制受試者工作特征(ROC)曲線，并分析曲線下面積(AUC)、靈敏度及特異度以確認RERG mRNA甲基化率的診斷效能。采用Spearman相關分析ccfDNA和組織中RERG mRNA甲基化率的相關性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1TCGA數(shù)據(jù)庫資料分析 基于TCGA數(shù)據(jù)庫的兩組數(shù)據(jù)，HNSC組織中RERG mRNA表達明顯低于正常組織，見圖1A。RERG mRNA在HNSC組織中的表達情況與患者總生存預后無關(P>0.05)，見圖1B。此外，HNSC組織中RERG mRNA甲基化β值高于正常組織(P<0.001)，見圖1C、D。

注：A為RERG在HNSC組織和正常組織中的表達差異；B為Kaplan-Merei曲線分析RERG mRNA表達與HNSC患者生存預后的關系；C為RERG mRNA在HNSC組織和正常組織中甲基化差異；D為RERG mRNA在HNSC組織及其配對的癌旁組織中甲基化差異。圖1 基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析RERG mRNA在HNSC組織中的表達和甲基化情況

2.2鼻咽癌組和對照組ccfDNA中RERG mRNA甲基化率比較 鼻咽癌組和對照組ccfDNA中RERG mRNA甲基化率分別為0.127(0.095，0.175)和0.023(0.014，0.036)，鼻咽癌組ccfDNA中RERG mRNA甲基化率高于對照組(Z=-11.881，P<0.001)，見圖2。經ROC曲線分析，ccfDNA中RERG mRNA甲基化率診斷鼻咽癌的AUC為0.990(95%CI：0.980～0.999)，最佳截斷值為0.059，此時靈敏度和特異度分別為93.0%和100.0%，見圖3。

圖2 兩組ccfDNA中RERG mRNA甲基化率比較

圖3 ccfDNA中RERG mRNA甲基化率診斷鼻咽癌的ROC曲線

2.3鼻咽癌患者ccfDNA和腫瘤組織中RERG mRNA甲基化率情況及相關性 鼻咽癌組ccfDNA中RERG mRNA甲基化率低于腫瘤組織[0.127(0.095，0.175)vs.0.278(0.184，0.364)，Z=-8.369，P<0.001]。Spearman相關分析結果顯示，ccfDNA和腫瘤組織中RERG mRNA甲基化率呈正相關(r=0.407，P<0.001)，見圖4。

注：A為腫瘤組織和ccfDNA中RERG mRNA甲基化率比較；B為Spearman相關分析散點圖。圖4 鼻咽癌組患者ccfDNA和組織中RERG mRNA甲基化率的關系

2.4ccfDNA中RERG mRNA甲基化狀態(tài)與鼻咽癌患者臨床特征的關系 鼻咽癌患者ccfDNA中RERG mRNA甲基化率在不同腫瘤T分期、N分期、TNM分期及EBV DNA狀態(tài)人群之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 鼻咽癌患者ccfDNA中RERG mRNA甲基化率與臨床病理特征的關系[M(P25,P75)]

續(xù)表1 鼻咽癌患者ccfDNA中RERG mRNA甲基化率與臨床病理特征的關系[M(P25,P75)]

3 討 論

鼻咽癌是一種發(fā)生于鼻咽組織的高度浸潤性腫瘤，由于鼻咽癌早期相對無癥狀，很多患者在疾病晚期才被確診。篩查識別早期鼻咽癌可能會改善患者治療結果，因此尋求新的能夠預測鼻咽癌的生物指標對于及時采取措施進行預防和治療鼻咽癌具有重要的臨床意義。

癌癥診斷的“金標準”是組織活檢，這種方法為侵入性，可能造成患者不適，且存在潛在并發(fā)癥風險[11]。此外，腫瘤活檢的可及性有限，不能反映腫瘤內部的異質性或腫瘤進化過程中新的亞克隆的出現(xiàn)。然而，液體活檢是一種很有前途的方法，可以克服這些缺點。世界范圍內人類癌癥的發(fā)病率和死亡率較高，大部分與確診較晚而導致治療干預效果較差有關。而ccfDNA則為癌癥患者的早期診斷提供了一種非侵入性的途徑[12]。ccfDNA是由與細胞或細胞片段無關的雙鏈核酸短片段組成。ccfDNA在血漿和血清中以0.1～20.0 kb的多核苷酸鏈存在。創(chuàng)傷、腦卒中及劇烈運動等刺激因素都可以引起ccfDNA水平明顯增加[13]。健康人血液中ccfDNA水平范圍為0～100 ng/mL。相比之下，癌癥患者體內的ccfDNA水平平均高出4～40倍，上限超過1 000 ng/mL。腫瘤細胞普遍存在無限增殖能力，這也部分解釋了患者較高的血漿ccfDNA水平[14]。RERG位于12p12染色體上，編碼一個小的Ras超家族GTP結合和水解蛋白(GTPase)。RERG在多種正常組織中廣泛表達，但在胰腺癌、乳腺癌、食管癌等腫瘤組織中則缺失表達[8,15-16]。此外，ZHAO等[17]結合甲基DNA結合域捕獲技術和cDNA微陣列分析，發(fā)現(xiàn)了一種在鼻咽癌組織中表達下調的特異性高甲基化基因-RERG，并借助于體外細胞實驗證實RERG在HK1、C666-1細胞株中的異位表達對細胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲能力，以及外細胞信號調節(jié)激酶(ERK)/核因子κB(NF-κB)具有明顯的抑制作用，說明RERG在鼻咽癌組織中常因為CpG島甲基化而表達沉默，并通過抑制ERK/NF-κB信號通路發(fā)揮抑癌基因的活性。上述數(shù)據(jù)都支持RERG作為鼻咽癌治療新的分子靶點。在本研究中，筆者利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析，證實RERG mRNA在HNSC組織中表達下調，且普遍存在基因高甲基化。然后進一步利用qAMP檢測了臨床標本中RERG mRNA甲基化率，證實鼻咽癌組ccfDNA中RERG mRNA甲基化率高于對照組，腫瘤組織和ccfDNA中RERG mRNA甲基化率呈正相關，且ccfDNA中RERG mRNA甲基化率與腫瘤進展及EBV感染有關。ZHAO等[17]研究曾證實，在EBV相關的NPC細胞系中，RERG經常被甲基化，導致RERG表達下調，進而通過ERK/NF-κB信號通路促進細胞增殖、集落形成和遷移。本研究結果顯示，ccfDNA中RERG mRNA甲基化率略低于腫瘤組織，原因之一可能是ccfDNA不僅來自腫瘤細胞，部分也可能來自正常細胞。同時，標本類型之間的這種差異可能也包含生物學檢測技術的偏差，例如限制性脫氧核糖核酸進入血液循環(huán)，或次優(yōu)的血漿標本處理導致溶血。為了盡量控制誤差，本研究中使用的非溶血性血漿可以防止血細胞中的核酸污染。此外經ROC曲線分析，ccfDNA中RERG mRNA甲基化率用于診斷鼻咽癌的AUC為0.990(95%CI：0.980～0.999)，說明其具有較好的診斷效能。

綜上所述，ccfDNA中RERG mRNA甲基化鼻咽癌篩查中一個潛在的血液學生物標志物；雖然本研究標本數(shù)量有限，而且缺乏連續(xù)監(jiān)測數(shù)據(jù)，但是最終的結果也為評估利用qAMP檢測ccfDNA中基因甲基化率作為鼻咽癌特異性表觀遺傳標志物的大標本篩選方法提供了科學依據(jù)。