趙友學　楊燕波　朱宇峰　張國慶　薛聽聽　孫良　雷鵬　徐虹　馮小?！≡S宗奇

摘要：以1株高產(chǎn)胞外多糖的內(nèi)生細菌Pantoea alhagi NX-11為研究對象，通過構建的多糖分泌缺失菌株NX-11eps-以及分離到的胞外多糖（EPS）純品，研究菌株NX-11及其胞外多糖對低溫脅迫下水稻苗的促生效應。結果表明，菌株NX-11顯著緩解了低溫脅迫導致的水稻苗莖長、根長、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和相對含水量的降低。對其作用機制研究發(fā)現(xiàn)，NX-11通過誘導水稻苗內(nèi)抗氧化酶活性提高顯著降低了低溫脅迫對水稻苗的氧化傷害;通過增強水稻苗脂肪酸去飽和酶（FADS）活性，提高了膜脂的不飽和度和雙鍵指數(shù)，增強了膜脂流動性;通過影響水稻苗的激素合成，進而增強水稻苗在低溫脅迫環(huán)境下的調(diào)控能力，增強其低溫耐受性。與NX-11相比，低溫脅迫下，多糖分泌缺失的菌株NX-11eps-對水稻苗的促生效應降低，而胞外多糖純品表現(xiàn)出與NX-11一致的促生效果，表明NX-11胞外多糖在增強水稻苗低溫耐受性的過程中發(fā)揮了關鍵作用。

關鍵詞：Pantoea alhagi;水稻苗;胞外多糖;低溫脅迫;低溫耐受性

中圖分類號：S432.4+2文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2022）02-0296-08

Effects of endophytic bacterium Pantoea alhagi NX-11 and its extracellular polysaccharides on the growth of paddy rice seedlings under low temperature stress

ZHAO You-xue YANG Yan-bo ZHU Yu-feng ZHANG Guo-qing XUE Ting-ting SUN Liang LEI Peng XU Hong FENG Xiao-hai XU Zong-qi

Abstract：In this study， the endophytic bacterium Pantoea alhagi NX-11 with high extracellular polysaccharide production was used as the research object. The growth-promoting effects of strain NX-11 and its extracellular polysaccharides on rice seedlings under low temperature stress were studied by constructing polysaccharide secretion deficient strain NX-11eps- and adding the isolated pure extracellular polysaccharide （EPS）. The results showed that strain NX-11 significantly relieved the decrease of stem length， root length， fresh weight， dry weight and relative water content of rice seedlings caused by low temperature stress. The research on the action mechanism showed that， NX-11 significantly reduced the oxidative damage to rice seedlings under low temperature stress by inducing the increase of antioxidant enzyme activities in rice seedlings. The unsaturation degree and double bond index of membrane lipids were improved， and the fluidity of the membrane lipids was increased by enhancing the activity of the fattyacid desaturases （FADS） of the rice seedlings. The hormone synthesis of the rice seedlings was affected to enhance their regulation ability under the environment of low temperature stress， and to enhance their tolerance of low temperature. Compared with NX-11， under low temperature stress， the growth-promoting effect of polysaccharide secretion deficient strain NX-11eps- to rice seedlings was reduced， while the pure exopolysaccharide showed the same growth-promoting effect as NX-11， suggesting that exopolysaccharide of NX-11 played a key role in enhancing the low temperature tolerance of rice seedlings.

Key words：Pantoea alhagi;rice seedling;extracellular polysaccharide;low temperature stress;low temperature tolerance

因強冷空氣及寒潮侵入造成的短時間內(nèi)氣溫急劇下降引起的低溫冷凍災害，是一種使作物因環(huán)境溫度過低而受到損傷以致產(chǎn)量降低的農(nóng)業(yè)氣象災害。按照災害發(fā)生的季節(jié)區(qū)分，影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的低溫災害天氣主要包括倒春寒、寒露風、寒潮等。其中，倒春寒是指春天（一般在3-5月）發(fā)生的農(nóng)作物持續(xù)遭受凍害的天氣氣候現(xiàn)象，是一種非常常見的農(nóng)業(yè)氣象災害。水稻是中國的主要糧食作物，種植面積和總產(chǎn)量分別占糧食作物總種植面積和總產(chǎn)量的27.4%和36.1%[1]。同時水稻是一種喜溫型糧食作物，因此中國主要的水稻種植區(qū)分布在淮河以南，一般在3-4月份播種，而這段時間內(nèi)水稻苗容易遭遇“倒春寒”導致的低溫環(huán)境脅迫，造成稻苗生長受阻，嚴重時甚至會造成稻苗死亡，糧食減產(chǎn)減收[2]。

許多研究發(fā)現(xiàn)，一些植物促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）能夠緩解低溫脅迫對植物的傷害，提高植物耐寒能力[3-5]。例如Subramanian等[6]在冬季農(nóng)田土壤中篩選到40株具有低溫耐受性的菌株，分別來源于節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、黃色單胞菌屬（Flavimonas）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、馬賽菌屬（Massilia）、地桿菌屬（Pedobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）等菌屬，其中4個分離株（OS211、OB146、OB155和OS261）在15 ℃低溫脅迫下均能顯著提高番茄的萌發(fā)率和生長性能，使番茄葉片中脯氨酸合成量和膜損傷減少，抗氧化酶活性降低，表現(xiàn)出顯著的低溫耐受性。Turan等[7]將巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium） M3、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis） OSU142、巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense） Sp245、土生拉烏爾菌（Raoultella terrigena） 4種促生菌接種于小麥和大麥上，發(fā)現(xiàn)它們可以通過改變礦物質(zhì)吸收提高葉綠素含量、光合活性和相對含水量以及降低膜損傷等，誘導植物的寒冷耐受性增強。

隨著越來越多的PGPR被分離培養(yǎng)，研究者發(fā)現(xiàn)其中相當一部分（包括細菌和真菌）都具有分泌胞外多糖（Exopolysaccharide，EPS）的特性。這些胞外多糖在單糖組成、連接方式上呈現(xiàn)出多樣性，這也使得其具有豐富的功能性和獨特的生物學活性。而近些年的研究結果表明，PGPR胞外多糖的這些生物活性在影響宿主植物的生理及生長方面，也發(fā)揮著重要的作用。Alami等[8]發(fā)現(xiàn)，在干旱條件下接種分泌胞外多糖的根瘤菌YAS34顯著提高了向日葵根系上黏附土壤的體積，增強了向日葵對干旱環(huán)境的耐受能力。Ashraf等[9]發(fā)現(xiàn)給作物接種一些能分泌胞外多糖的根際內(nèi)生菌，可以減少鹽脅迫下作物對Na+的吸收，降低Na+對作物的毒害效應，并認為這與胞外多糖具有聚陰離子屬性并能夠結合陽離子的特性有關。

本研究團隊前期從灘涂海水稻根際篩選到1株高產(chǎn)胞外多糖的內(nèi)生細菌Pantoea alhagi NX-11[10]，擬考察NX-11對水稻苗低溫抗性的影響，并通過構建的多糖分泌缺失菌株以及分離到的胞外多糖純品，研究NX-11胞外多糖發(fā)揮的作用。

1材料與方法

1.1菌株

野生菌Pantoea alhagi NX-11是從海水稻根際分離出來的1株水稻內(nèi)生細菌，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC，No.15525），具有較強的胞外多糖分泌能力，發(fā)酵培養(yǎng)基中，胞外多糖產(chǎn)量可達12 g/L以上。

Pantoea alhagi NX-11eps-是野生菌株NX-11通過CRISPR/Cas 9無痕編輯系統(tǒng)敲除了胞外多糖合成關鍵基因（pspD）構建的，其胞外多糖產(chǎn)量降低至0.6 g/L[11]。

1.2發(fā)酵液的制備

挑取單菌落至液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min過夜培養(yǎng)。隨后以4%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基（10 g/L蛋白胨、10 g/L NaCl、5 g/L酵母提取物、40 g/L蔗糖）中，37 ℃ 200 r/min發(fā)酵24 h，即得發(fā)酵液。

1.3胞外多糖的提取

將P.alhagi NX-11的發(fā)酵液用3倍體積的超純水稀釋，與硅藻土充分混合抽濾除菌，再將濾液濃縮至初始體積的1/3，隨后用Sevag試劑（異戊醇∶三氯甲烷=1∶4，體積比）脫蛋白3次，水相在4 ℃下用終濃度為80%的乙醇沉淀過夜，沉淀凍干得到胞外多糖。

1.4水稻苗培育與樣品收集

水稻種子由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院饋贈。將種子用0.1%的氯化汞溶液浸泡表面消毒20 min后，用無菌水沖洗3～5次，置于水培盒中（每盒800粒種子，水培盒中的水為無菌水，總共24盒）并于24 ℃黑暗環(huán)境下催芽2～3 d。然后將水培盒中的水替換為1/2 MS營養(yǎng)液（每盒約1.5 L），置于人工氣侯室培養(yǎng)，其中，光∶暗=14 h∶8 h，溫度周期24 ℃∶20 ℃，濕度為 65%，光照度為4 000 lx。至水稻幼苗長出2張葉片（約14 d）后，隨機挑選15盒長勢相似的水稻幼苗，將其隨機等分為5個處理：NT-Control組，向水培液中加入10 ml滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基（常溫培養(yǎng)）;LT-Control組，向水培液中加入10 ml滅菌后的發(fā)酵培養(yǎng)基（低溫培養(yǎng)）;LT-NX-11組，向水培液中加入10 ml NX-11發(fā)酵液;LT-NX-11eps-組，向水培液中加入10 ml NX-11eps-發(fā)酵液（NX-11發(fā)酵液和NX-11eps-發(fā)酵液的OD600均為4.1）;LT-EPS組，向水培液中加入10 ml NX-11胞外多糖純品水溶液，胞外多糖質(zhì)量濃度為12 g/L。

按照上述處理，將水稻苗培養(yǎng)48 h。48 h后，將所有處理中的水培液更換為1/2 MS營養(yǎng)液，開始模擬低溫脅迫：將NT-Control組置于24 ℃氣候箱中;LT-Control組、LT-NX-11組、LT-NX-11eps-組、LT-EPS組置于10 ℃氣候箱中。2個氣候箱的其他參數(shù)設置一致：濕度=65%，光∶暗=14 h∶8 h，光照度=4 000 lx。試驗過程中1/2 MS營養(yǎng)液每隔2 d更換1次。

模擬低溫脅迫后的0 h、24 h、48 h、72 h、96 h和120 h，在每組處理中隨機選取30株水稻幼苗用于內(nèi)源激素檢測等相關檢測。脅迫結束后，再從各處理中隨機選取30株水稻苗用于根長、莖長、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量等表觀指標的檢測，各處理剩余樣品置于液氮中凍存。

1.5水稻苗的表觀生長指標測定

用直尺測量水稻根長和莖長，用分析天平測量水稻鮮質(zhì)量。水稻含水量的測定：將每組水稻苗浸入純水中，使水稻吸水飽和（約24 h），將水稻葉表面水珠用吸水紙擦干并稱質(zhì)量，為飽和鮮質(zhì)量;然后，將水稻幼苗置于60～80 ℃的烘箱中，干燥至恒質(zhì)量后稱質(zhì)量（約72 h），為水稻干質(zhì)量;水稻幼苗的相對含水量=（鮮質(zhì)量-干質(zhì)量）/（飽和鮮質(zhì)量-干質(zhì)量）[12]。

1.6水稻苗的生化指標測定

參照李仕友[13]的方法進行水稻苗丙二醛（MDA）含量的測定。參照Xia等[14-15]的方法進行水稻幼苗H2O2濃度的測定。參照Lei等[16]的方法進行過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）酶活性測定。使用南京草本源生物科技有限公司試劑盒測定脂肪酸去飽和酶（FADS）的活性。參考Ur等[17]的方法進行脂肪酸的提取。參照Baltruschat等[18]的方法進行脂肪酸含量的相關測定，并測定其不飽和度（UFA/SFA=不飽和脂肪酸相對含量/飽和脂肪酸相對含量）和雙鍵指數(shù)[DBI=∑（各個不飽和脂肪酸相對含量×雙鍵數(shù)目）/飽和脂肪酸相對含量]。水稻樣品中植物激素ABA（脫落酸）、JA（茉莉酸）和SA（水楊酸）的含量使用南京草本源生物科技有限公司的酶聯(lián)免疫試劑盒測定。植物樣本的提取方式參照粗酶液的提取，然后按照試劑盒的說明書操作。在波長為450 nm的條件下測定吸光度，并計算樣品的質(zhì)量濃度。

2結果與分析

2.1NX-11及其胞外多糖對水稻苗低溫耐受性的影響

如表1所示，低溫脅迫（LT-Control）抑制了水稻生長，其莖長、根長、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和相對含水量相比常溫對照組（NT-Control）分別顯著下降。與LT-Control組相比，LT-NX-11組的莖長、根長、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和相對含水量顯著提高，表明菌株NX-11能夠提高水稻苗的低溫耐受性。與LT-Control組相比，LT-NX-11eps-組莖長、根長、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量和相對含水量均顯著提高，這表明多糖缺失顯著降低了NX-11的促生活性。與LT-Control組相比，LT-EPS組的5個指標顯著提高，這進一步驗證了在NX-11增強水稻苗低溫耐受性的機制中，其胞外多糖作為一種活性成分，發(fā)揮了至關重要的作用。

2.2低溫脅迫下NX-11及其胞外多糖對水稻苗氧化傷害的緩解作用

活性氧（ROS）是生物細胞內(nèi)有氧代謝過程的產(chǎn)物。在正常情況下，植物體內(nèi)ROS的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡，而在低溫等脅迫環(huán)境中，這種平衡被破壞，導致ROS過量積累。過量的ROS與細胞蛋白質(zhì)、DNA和脂質(zhì)相互作用會引起氧化損傷，并破壞細胞的正常功能。H2O2是ROS的主要成分之一，如圖1A所示，與常溫組（NT-Control）相比，低溫對照組（LT-Control）H2O2濃度顯著提高，這表明低溫脅迫使水稻苗受到了較大的氧化傷害。與LT-Control相比，LT-NX-11組、LT-NX-11eps-組、LT-EPS組水稻苗H2O2濃度分別顯著降低了53.75%、6.54%、14.72%，這表明菌株NX-11可以促進低溫脅迫導致的ROS的清除，有利于降低ROS對細胞的傷害作用;多糖分泌能力的缺失，會降低NX-11在低溫脅迫下對水稻苗ROS的清除能力;單獨施用多糖純品水溶液也能提高水稻苗清除ROS的水平。圖1A為染色法測定的水稻根部和葉片中H2O2和O2·-濃度，顏色越深代表細胞ROS濃度越高，其結果與圖1B一致。丙二醛（MDA）是細胞脂類過氧化的終產(chǎn)物，常用來反映植物遭受逆境傷害的程度。圖1C表明，低溫脅迫導致水稻苗MDA濃度顯著升高，與LT-Control相比，LT-NX-11組、LT-NX-11eps-組、LT-EPS組水稻苗MDA濃度顯著降低，進一步表明NX-11可以緩解低溫脅迫對水稻苗的氧化傷害，并且其功效與其分泌的胞外多糖密切相關。

如圖2所示，低溫脅迫顯著提高了SOD、POD、GPX的活性，這是植物自身應對環(huán)境脅迫的主動反應。與LT-Control組相比，經(jīng)過NX-11、NX-11eps-以及EPS處理之后，SOD活性均顯著提高。POD、GPX活性的變化與SOD相似。低溫脅迫雖然沒有顯著提高APX的活性，但經(jīng)過EPS、NX-11與NX-11eps-處理，其活性也顯著提高。經(jīng)過EPS、NX-11以及NX-11eps-處理均可以提升水稻幼苗中與抗氧化相關的酶的活性。結果表明，NX-11能夠降低低溫脅迫對水稻苗的氧化傷害，可能與其誘導水稻苗內(nèi)抗氧化酶活性提高有關，并且其誘導水平受到胞外多糖的影響。

2.3低溫脅迫下NX-11及其胞外多糖對水稻苗膜脂的保護作用

由表2可知，低溫脅迫使得水稻中脂肪酸的不飽和度（UFA/SFA）和雙鍵指數(shù)（DBI）下降，與NT-Control組相比，分別顯著下降了8.71%、10.16%。相比LT-Control組，菌株NX-11處理使得脂肪酸的不飽和度與雙鍵指數(shù)有顯著提高，分別提升了26.59%、26.94%。與LT-NX-11組對比，胞外多糖處理組（LT-EPS）在脂肪酸不飽和度與雙鍵指數(shù)上無顯著差異，而LT-NX-11eps-組則表現(xiàn)為顯著下降。結果表明，NX-11能夠影響水稻苗膜脂的組成，提高脂肪酸的不飽和度和雙鍵指數(shù)，維持細胞膜在低溫環(huán)境下的流動能力。菌株NX-11對膜脂的保護作用與其分泌的胞外多糖有關。

為進一步探究NX-11及其胞外多糖影響水稻苗膜脂組分的作用機制，本研究考察了不同處理下，水稻苗FADS的活性變化。由圖3可知，低溫脅迫顯著提高了FADS活性。相比于LT-Control組，LT-NX-11組和LT-EPS組FADS活性提升較為顯著，分別達到了LT-Control組的2.0倍、1.5倍。LT-NX-11eps-組的FADS活性與LT-Control組相比也有顯著提升，但是提升程度顯著低于LT-EPS組和LT-NX-11組。結果表明，NX-11及其胞外多糖可以通過增強水稻苗FADS活性，提高膜脂的不飽和度和雙鍵指數(shù)，增強膜脂流動性，在低溫環(huán)境下維持細胞形態(tài)。

2.4低溫脅迫下NX-11及其胞外多糖對水稻苗抗逆激素的影響

植物激素參與植物對各種生物脅迫和非生物脅迫的響應，在調(diào)節(jié)植物發(fā)育和信號傳遞網(wǎng)絡過程中發(fā)揮著重要作用。ABA、SA和JA是植物重要的抗逆激素。本研究檢測了各處理組在處理0 h、24 h、48 h、72 h、96 h和120 h時的水稻苗中SA、ABA、JA含量。由圖4可知，在低溫脅迫的72 h內(nèi)，各處理組中的水稻苗激素含量基本無顯著差異。當?shù)蜏孛{迫到96 h以后，LT-Control組的ABA、JA、SA含量較常溫處理組顯著降低，這表明低溫脅迫降低了植物合成激素的水平，抑制了植物通過自我調(diào)控應對脅迫的能力。與LT-Control組相比，LT-NX-11組、LT-NX-11eps-組和LT-EPS組的SA、ABA、JA含量盡管出現(xiàn)了動態(tài)波動，但整個處理期基本維持在相對較高的水平。結果表明，菌株NX-11及其胞外多糖可能通過影響水稻苗的激素合成，進而增強水稻苗在低溫脅迫環(huán)境下的調(diào)控能力，增強其低溫耐受性。

3討論

低溫災害是對中國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟有重要影響的非生物脅迫因子[19-20]。盡管現(xiàn)在全球面臨氣候變暖的趨勢，但低溫冷害氣候也時有發(fā)生，特別是持續(xù)時間較長的突發(fā)性低溫氣候，往往會給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大經(jīng)濟損失。

一些植物促生微生物一方面能夠通過固氮、解磷、解鉀等功能提高植物的養(yǎng)分利用效率[21]，另一方面它們能夠分泌植物激素（如生長素、赤霉素、乙烯等）、抗氧化物等活性物質(zhì)，提高植物應對環(huán)境脅迫的能力[22]。近年來植物促生微生物作為一種綠色高效的微生態(tài)肥料，開始備受關注[23-24]。隨著研究的深入，越來越多的PGPR被發(fā)現(xiàn)能夠分泌細胞外聚合物物質(zhì)或細胞外多糖，形成生物膜，促進其與植物根表面的黏附作用[25]。EPS是PGPR向環(huán)境中釋放的高分子量聚合物，一般是作為PGPR對不良環(huán)境（如高鹽[26]、不適溫度[27]或重金屬污染[28]）產(chǎn)生的應對策略，用以保護這些PGPR免受外部環(huán)境變化的影響。伴隨著近年來興起的天然活性多糖研究熱，這些PGPR胞外多糖的生物活性逐漸被揭示，包括抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥、抗過敏及益生元活性等多種生物活性。PGPR分泌的EPS可能在緩解植物非生物脅迫方面也發(fā)揮重要作用。然而，迄今PGPR胞外多糖自身生理活性與其宿主植物脅迫抗性之間的關系卻鮮有報道，特別是涉及PGPR胞外多糖與植物低溫抗性之間的研究更是寥寥無幾。Kasotia等[29]發(fā)現(xiàn)Pseudomonas sp.胞外多糖能夠限制土壤Na+的自由流動，通過減少植物對Na+的吸收量緩解鹽脅迫對大豆的傷害。Khan等[30]發(fā)現(xiàn)，PGPR胞外多糖能夠通過維持土壤較高水分含量，緩解小麥干旱脅迫。一些研究發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫可以提升PGPR分泌胞外多糖的能力。例如，來自喜馬拉雅山西北部的耐凍假單胞菌在寒冷條件下能夠比常溫條件下產(chǎn)生更多的EPS[31]。同樣的，芽孢桿菌CJCL2和RJGP41可以通過分泌EPS來增強小麥幼苗的抗寒能力，不僅可以使細菌細胞能夠在冷脅迫下生存，還可分泌特定的代謝物來保護它們的寄主植物，并促進PGPR在低溫環(huán)境下的根際定植[32]。此外，低溫脅迫會導致植物的脫水和滲透不平衡，改變根系中Na+與K+的濃度比，影響許多代謝酶活性和營養(yǎng)攝取，而PGPR產(chǎn)生的EPS可以螯合Na+，限制根系對Na+的吸收，從而保護植物免受低溫介導的脫水[33-34]。本研究中，菌株NX-11分泌的胞外多糖可能作為一種植物生物刺激素或信號類物質(zhì)，通過影響水稻苗的激素合成，進而提高水稻苗在低溫脅迫下的抗氧化酶、脂肪酸去飽和酶等相關抗逆酶活性水平，增強水稻苗在低溫脅迫中ROS清除能力，維持膜脂流動性，進而緩解了低溫脅迫對細胞的傷害，促進了水稻苗在低溫中的生長性能。

低溫脅迫導致水稻苗生長性能降低，本研究考察了菌株NX-11及其胞外多糖對低溫脅迫下水稻苗的促生效應。外源施用NX-11及其分泌的EPS緩解了低溫脅迫對水稻苗生長的不利影響，通過提高水稻苗內(nèi)抗氧化酶活性顯著降低了低溫脅迫對水稻苗的氧化傷害;通過增強水稻苗FADS活性，提高了膜脂的不飽和度和雙鍵指數(shù)，增強了膜脂流動性;通過影響水稻苗的激素合成，進而增強水稻苗在脅迫環(huán)境下的調(diào)控能力，增強其低溫耐受性。綜上所述，將P. alhagi NX-11或者其分泌物EPS開發(fā)成為具有緩解低溫脅迫能力的生物肥料具有非常大的潛力。

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（責任編輯：陳海霞）

收稿日期：2021-07-28

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金項目（3180011491）;江蘇省自然科學基金青年科學基金項目（BK20180158）;國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計劃項目（202110291010Z）

作者簡介：趙友學（1999-），山東聊城人，本科，研究方向為根際促生微生物對作物的促生抗逆作用機制。（E-mail）201821019117@njtech.edu.cn

通訊作者：雷鵬，（E-mail）lei-peng@njtech.edu.cn