張瑤　高弢　馬桂珍　史建榮

摘要：植物源酚類化合物愈創(chuàng)木酚可以顯著抑制禾谷鐮刀菌的生長，本研究利用轉錄組測序分析愈創(chuàng)木酚對禾谷鐮刀菌的作用機制，采用RNA-Seq技術從轉錄組水平分析禾谷鐮刀菌在0.4 μl/ml愈創(chuàng)木酚脅迫下的響應機制。結果顯示，共篩選到905個差異表達基因表達量發(fā)生了變化，其中表達量上調的基因為464個，表達量下調的基因為441個。差異表達基因的COG、GO及Pathway功能分析發(fā)現(xiàn)，愈創(chuàng)木酚影響禾谷鐮刀菌氧化應激反應、膜組分及離子運輸途徑。表明，愈創(chuàng)木酚處理后，禾谷鐮刀菌的細胞膜完整性受到了破壞，Ca2+運輸途徑受到破壞，同時愈創(chuàng)木酚作為抗氧化劑也能顯著影響禾谷鐮刀菌的氧化應激反應。

關鍵詞：禾谷鐮刀菌;愈創(chuàng)木酚;轉錄組;抑菌機制

中圖分類號：Q946.887文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2022）02-0343-09

Analysis on the antifungal mechanism of Fusarium graminearum treated by guaiacol based on transcriptome sequencing

ZHANG Yao GAO Tao MA Gui-zhen SHI Jian-rong

[1.Jiangsu Ocean University， Lianyungang 222000， China;2.Institute of Food Safety and Nutrition， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Control Technology and Standard for Agro-Products Safety and Quality， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Key Lab of Agro-product Safety Risk Evaluation（Nanjing）， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Key Laboratory of Food Quality and Safety， Nanjing 210014， China]

Abstract：The plant derived phenolic compound guaiacol can significantly inhibit the growth of Fusarium graminearum. In this study， the action mechanism of guaiacol on F. graminearum was analyzed by transcriptome sequencing， and the response mechanism of F. graminearum under 0.4 μl/ml guaiacol stress was analyzed by RNA-Seq technique at transcriptome level. The results showed that， 905 differentially expressed genes （DEGs） were screened to be varied in expression quantity， of which 464 were up-regulated and 441 were down-regulated. Analysis on the function of COG， GO and pathway of DEGs showed that， guaiacol affected oxidative stress response， membrane components and ion transport pathways of F. graminearum. In conclusion， the integrity of the cell membrane and Ca2+ transport pathway of F. graminearum were damaged after treated with guaiacol， and guaiacol could also significantly affect the oxidative stress response of F. graminearum as an antioxidant.

Key words：Fusarium graminearum;guaiacol;transcriptome;antifungal mechanism

江蘇農業(yè)學報2022年第38卷第2期

張瑤等：基于轉錄組測序技術分析愈創(chuàng)木酚對禾谷鐮刀菌的抑菌機制

主要由禾谷鐮刀菌復合種（Fusarium graminearum species complex）引起的小麥赤霉病是世界范圍內廣泛發(fā)生的一種主要病害[1]。小麥赤霉病不僅會造成小麥產量降低，還會產生多種鐮刀菌毒素，嚴重影響小麥質量安全，威脅人畜健康。篩選、培育和種植具有穩(wěn)定抗赤霉病和抗毒素積累的小麥品種是防控鐮刀菌危害最安全有效的措施之一，但目前尚未開發(fā)出可以商業(yè)化種植的抗病品種。利用化學藥劑進行防控是控制鐮刀菌毒素產生和累積的最有效的措施之一[2]。自20世紀70年代以來，中國使用的多菌靈等苯并咪唑類和戊唑醇等三唑類殺菌劑，在控制病害流行、穩(wěn)定小麥生產上發(fā)揮了重要作用[3]。但是，長期單一使用化學農藥導致中國長江中下游部分小麥產區(qū)病原菌產生明顯的抗藥性[4]，嚴重威脅了環(huán)境生態(tài)健康。因此，探尋針對禾谷鐮刀菌的新型高效殺菌劑，已成為目前有效防治小麥赤霉病的關鍵突破口之一。

愈創(chuàng)木酚（2-甲氧基酚），別名甲基兒茶酚，是一種白色或微黃色結晶或無色至淡黃色透明油狀液體，在自然界中主要存在于愈創(chuàng)樹脂或松油中，也是木材干餾所得雜酚油中的主要成分[5]。愈創(chuàng)木酚在工業(yè)上用途廣泛，常用愈創(chuàng)木酚來生產各種香料，如丁香酚、香蘭素和人造麝香[6]。愈創(chuàng)木酚在醫(yī)藥上也有大量應用，它可被用于合成苯磺酸愈創(chuàng)木酚（愈創(chuàng)木酚磺酸鉀）、用于制作局部麻醉劑或防腐劑[7]，還可用于制備祛痰口服液和治療消化不良[8]。目前，利用愈創(chuàng)木酚抑制植物病原菌方面的研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)，一些含有取代酚（丁香酚、百里香酚、卡瓦克酚和愈創(chuàng)木酚）的精油表現(xiàn)出很強的抗菌和抗氧化作用[9]，而多種具有抑菌作用的植物提取物及木醋液中均含有大量的愈創(chuàng)木酚[10-12]。前期研究發(fā)現(xiàn)愈創(chuàng)木酚能夠抑制禾谷鐮刀菌的生長和產毒，但是抑菌機制尚不明確。本研究借助轉錄組測序手段初步分析愈創(chuàng)木酚對禾谷鐮刀菌的殺菌作用及其抑菌機制，為禾谷鐮刀菌的防治提供新思路，為開發(fā)新的、具有優(yōu)良防效的植物源農藥提供應用基礎。

轉錄組，是指特定生長階段某組織或細胞內所有轉錄產物的集合，主要包括mRNA和非編碼RNA（ncRNA）[13]。利用新一代轉錄組測序RNA-Seq （RNA-sequencing）分析愈創(chuàng)木酚處理后的禾谷鐮刀菌轉錄組的變化，篩選鑒定差異基因，并通過GO功能和KEGG途徑注釋分析，探究禾谷鐮刀菌響應愈創(chuàng)木酚脅迫的關鍵基因，可為后續(xù)闡明愈創(chuàng)木酚作用機制的基因組學研究提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試菌株為禾谷鐮刀菌標準菌株PH-1;供試藥劑為99%愈創(chuàng)木酚（Macklin），4 ℃保存?zhèn)溆?。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L。YEPD培養(yǎng)基：葡萄糖 20 g/L，酵母粉 3 g/L，胰蛋白胨10 g/L，調pH至7.0，高溫高壓滅菌后常溫保存。PrimeScript TM RT反轉試劑盒 （寶日醫(yī)生物技術有限公司產品，貨號：DRR036A）用于RNA反轉成cDNA;TB Green TM Premix Ex TaqTM Ⅱ（寶日醫(yī)生物技術有限公司產品，貨號：DRR820A）用于實時熒光定量PCR。

1.2試驗方法

1.2.1禾谷鐮刀菌菌絲處理與RNA提取收集禾谷鐮刀菌分生孢子（1 ml 105個）接種至YEPD培養(yǎng)基中，25 ℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，加入愈創(chuàng)木酚提取液使其終濃度為0.4 μl/ml，以不加愈創(chuàng)木酚為對照組，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)24 h后收集菌絲并凍干研磨成粉末。使用TRIzol 試劑從組織中提取總RNA，并使用DNA酶（寶日醫(yī)生物技術有限公司產品，貨號：2270A）去除基因組DNA。

1.2.2構建文庫及轉錄組測序提取樣品的總RNA送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行轉錄組測序。首先使用fastx_toolkit_0.0.14軟件對原始數(shù)據(jù)的相關質量進行評估，包括堿基質量分布統(tǒng)計、堿基錯誤率分布統(tǒng)計和堿基（A、T、G、C）含量分布統(tǒng)計;隨后，使用SeqPrep和Sickle軟件對測序接頭序列、低質量讀段、不確定堿基信息率較高序列及長度過短序列進行去除，獲得質控后的原始數(shù)據(jù)，即clean data（reads），利用TopHat2和HISAT2將clean reads與參考基因組Fusarium_graminearum （GCF_000240135.3）進行比對，獲得用于后續(xù)轉錄本組裝、表達量計算等的 mapped data（reads），同時對該轉錄組測序的比對結果進行質量評估。使用StringTie或Cufflinks軟件對Mapped Reads進行拼接和組裝。

1.2.3差異表達基因分析及功能分析將轉錄組組裝獲得的所有基因和轉錄本在六大數(shù)據(jù)庫（NR、Swiss-Prot、Pfam、EggNOG、GO和KEGG）中進行比對分析，獲得基因和轉錄本的功能信息。通過與NR數(shù)據(jù)庫比對，可以查看轉錄本序列與相近物種的相似情況，以及同源序列的功能信息;通過與Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫比對，可以了解轉錄本注釋中蛋白質的功能、轉錄后修飾、特殊位點和區(qū)域、二級結構、四級結構。通過Pfam數(shù)據(jù)庫比對可以對組裝出來的轉錄本進行蛋白質家族的注釋;EggNOG提供了更細致的OG分析，可以根據(jù)物種所屬的進化分支選擇參考數(shù)據(jù)集;利用GO數(shù)據(jù)庫可以獲得轉錄本的功能分類情況;通過與KEGG數(shù)據(jù)庫比對，獲得基因或轉錄本可能參與的具體生物學通路情況。使用RSEM、Kallisto和Salmon軟件對基因的表達量進行定量分析，隨后根據(jù)基因/轉錄本在不同樣本間的表達情況，對樣本間共有與特有表達基因/轉錄本（venn分析）、相關性和主成分（PC）進行分析。

在獲得基因/轉錄本的Read Counts數(shù)后，采用DESeq2、DEGseq或edgeR 軟件，對多樣本項目進行樣本間或組間基因/轉錄本差異表達分析，鑒定出差異表達的基因/轉錄本。在EggNOG、GO和KEGG 3個數(shù)據(jù)庫中對差異表達基因進行功能分類分析，隨后利用Goatools軟件進行GO富集分析，從而分析獲得的顯著差異表達基因主要具有哪些GO功能，分析方法為Fisher精確檢驗，當經過校正的P值<0.05時，認為此GO功能存在顯著富集情況;采用R腳本對差異富集基因/轉錄本進行KEGG Pathway富集分析，計算原理同GO功能富集分析，當經過校正的P值<0.05時，認為此KEGG Pathway功能存在顯著富集情況。

1.2.4熒光定量PCR驗證分別提取愈創(chuàng)木酚處理和對照組的禾谷鐮刀菌RNA，并反轉為 cDNA，反應程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存?？傮w系10.0 μl：2.0 μl 5×PrimeScriptTM Buffer，0.5 μl PrimeScriptTM RT Enzyme Mix I，0.5 μl Oligo dT Primer （50 μmol/L），0.5 μl Random 6 mers （100 μmol/L），2.0 μl total RNA，4.5 μl RNase Free dH2O。以cDNA為模板進行實時定量PCR反應，反應程序：96 ℃預變性120 s;94 ℃變性5 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，45個循環(huán)。融合階段：94 ℃變性20 s; 56 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s?？傮w系25.0 μl：12.5 μl TB Green Premix Ex Taq，1.0 μl PCR Forward Primer，1.0 μl PCR Reverse Primer，2.0 μl cDNA;8.5 μl dH2O。反應所用引物見表1。獲得的所有數(shù)據(jù)參照GAPDH基因（編號：FGSG_06257.1）進行校準，目的基因的相對表達水平利用LightCycler 96 SW 1.1分析軟件生成。每個處理設置3個重復。

2結果與分析

2.1轉錄組測序數(shù)據(jù)質量控制

試驗設置對照（CK）和愈創(chuàng)木酚處理（Gua），各有3個生物學重復，建立了6個cDNA文庫。經過測序后，禾谷鐮刀菌在對照、愈創(chuàng)木酚處理下的平均Clean reads分別為42 887 328和45 133 555，Q20（測序質量在99.0%以上的堿基占總堿基的比例）分別平均達到98.86%和98.59%，Q30（測序質量在99.9%以上的堿基占總堿基的比例）分別平均達到94.18%和93.94%，G+C平均含量分別為52.63%、52.76%。以上結果說明，本次測序所得cDNA文庫質量高，可以進行后續(xù)生物信息學的進一步研究。具體數(shù)據(jù)見表2。

2.2轉錄組表達量差異分析

共檢測到表達基因12 611個，其中已知基因12 000個，新基因611個。分析對照組的樣品和處理組的基因表達量，默認參數(shù)為：P<0.05 & |log2FC|≥1（FC表示2個樣品間基因表達量的比值）。愈創(chuàng)木酚處理禾谷鐮刀菌后，共有905個基因表達量發(fā)生了變化（圖1），其中表達量上調的基因為464個，表達量下調的基因為441個（圖1A）。表達差異倍數(shù)大于5的基因有65個，占比7.18%，其中表達量上調的基因23個，表達量下調的基因42個;表達差異倍數(shù)小于5的基因占比92.82%，其中表達差異倍數(shù)在1～2倍的基因有378個，表達差異倍數(shù)在2～5倍的基因有462個，表達量上調的基因210個，表達量下調的基因252個。

2.3轉錄組的COG注釋

對愈創(chuàng)木酚處理后的差異表達基因進行COG功能分析，差異表達基因共參與了25個代謝過程。如圖2所示，除去652個功能不明的差異表達基因，其余差異表達基因中39個與翻譯后修飾、蛋白質翻轉、伴侶相關，35個與碳水化合物的代謝運輸相關，30個與RNA的轉錄相關。

2.4差異表達基因的GO功能富集分析

對愈創(chuàng)木酚處理后的差異表達基因進行GO功能注釋分析，將差異表達基因分為參與的生物學過程、構成細胞的組分、實現(xiàn)的分子功能三大類。結果如圖3所示，共有706個差異表達基因屬于生物學功能類，其中有285個差異表達基因為代謝過程相關基因;共有681個差異表達基因屬于構成細胞的組分，其中有252個差異表達基因屬于膜組分相關基因;共有609個差異表達基因屬于實現(xiàn)的分子功能類，其中有294個差異表達基因為催化活性相關基因。

對注釋完的差異表達基因進行GO功能富集分析，在差異顯著（P<0.05） 的前提下總結基因差異富集度排名前20位的基因功能，發(fā)現(xiàn)差異表達基因主要富集在氧化還原相關生物進程、膜整體組成成分以及離子運輸途徑等（圖4）。表明愈創(chuàng)木酚能夠影響禾谷鐮刀菌代謝過程，使細胞膜組分發(fā)生變化。

2.5差異表達基因的KEGG Pathway富集分析

將愈創(chuàng)木酚處理后的差異表達基因按照參與的通路或行使的功能進行分類，結果如圖5所示。上調表達基因的功能主要為新陳代謝途徑中的氨基酸代謝途徑、碳水化合物代謝途徑及能量代謝途徑，遺傳信息處理途徑中的折疊、分類和降解途徑，細胞過程途徑中的運輸和分解代謝途徑;下調表達基因的功能主要為新陳代謝途徑中的碳水化合物代謝途徑和脂質代謝途徑。

采用R腳本對獲得的差異表達基因/轉錄本進行KEGG Pathway富集分析，按P<0.05的前提下顯示顯著的富集結果，P值越小表示越顯著。主要富集途徑如表3所示，差異表達基因主要富集在新陳代謝途徑的氮代謝通路和谷胱甘肽代謝通路中。

2.6差異表達基因的qRT-PCR驗證

對轉錄組測序結果中表達量差異倍數(shù)為5倍以上的差異表達基因進行篩選分析，除去功能未知的蛋白質后，選取另外14個基因進行qRT-PCR驗證，基因編號及表達量上調、下調結果見表4和圖6。這14個基因在愈創(chuàng)木酚處理后發(fā)生不同程度的表達。與轉錄組測序結果相比，除FGSG_05882表達量由下調變?yōu)樯险{外，其余基因的表達量變化趨勢與測序結果相符，表明轉錄組測序的分析結果是可靠的。

2.7Ca2+轉運相關基因表達量分析

有研究發(fā)現(xiàn)，作為當歸的有效活性成分，愈創(chuàng)木酚已被證實可以通過抑制破骨細胞中NF-κB、MAPK和AKT信號通路，抑制Ca2+外排，引起胞內Ca2+紊亂，影響破骨細胞的形成，最終達到治療骨質疏松等疾病的目的[14]。在本研究中亦發(fā)現(xiàn)愈創(chuàng)木酚處理后Ca2+-ATPase 3（PMCA3）基因表達量顯著下調，對測序結果中PMCA相關基因進行分析，發(fā)現(xiàn)

0.4 μl/ml愈創(chuàng)木酚處理禾谷鐮刀菌后4個PMCA基因均表現(xiàn)為下調（表5）。利用qRT-PCR驗證不同濃度愈創(chuàng)木酚處理后4個PMCA基因的表達情況，結果發(fā)現(xiàn)愈創(chuàng)木酚不同程度地抑制了這4個基因的表達，其中PMCA1基因（FGSG_00508）和2個PMCA3基因（FGSG_08985、FGSG_04919）的表達量整體上隨著藥劑處理濃度的升高而逐漸降低;另一個 PMCA3基因（FGSG_04245）在低濃度處理下表達量顯著提高，隨后又逐漸降低（圖7）。

3討論

近年來，通過比較藥劑處理后基因表達差異情況可以分析藥劑的潛在作用途徑。已有研究結果表明，以愈創(chuàng)木酚為主要成分的各種木醋液對多種病原真菌均表現(xiàn)出一定的抑菌作用[15]，但愈創(chuàng)木酚的作用機制尚不明確。本研究利用RNA-seq技術研究愈創(chuàng)木酚處理后禾谷鐮刀菌基因表達的差異，旨在探尋愈創(chuàng)木酚的有效作用途徑，為今后開發(fā)以愈創(chuàng)木酚為主要成分的禾谷鐮刀菌殺菌劑提供理論依據(jù)。

測序結果表明，經過藥劑處理后有905個基因表達量發(fā)生變化，其中表達差異倍數(shù)大于5的基因有65個，上調表達基因23個，下調表達基因42個，表明藥劑處理后表達量變化較大的基因變化趨勢以下調表達為主。已有研究結果表明，作為木質素生物油主要成分的愈創(chuàng)木酚具有很好的還原能力和自由基清除能力[16]。同時在調節(jié)植物生長方面，愈創(chuàng)木酚作為植物營養(yǎng)素的主要成分，可以清除活性氧，調節(jié)植物體氧化應激反應[17]，愈創(chuàng)木酚亦作為牙科常用藥物被驗證具有較強的抗氧化作用[18]。在生物體中，谷胱甘肽的代謝途徑與氧化應激反應相關，可以還原細胞內的活性氧自由基，生成氧化型谷胱甘肽來行使抗氧化的功能[19-22]。本研究發(fā)現(xiàn)，愈創(chuàng)木酚處理禾谷鐮刀菌后，差異表達基因的GO功能主要富集在氧化還原相關生物進程上，Pathway 途徑主要富集在谷胱甘肽代謝途徑上，表明愈創(chuàng)木酚能夠顯著影響禾谷鐮刀菌的氧化應激反應途徑。

一般的植物源酚類化合物均具備較強的疏水性，可以通過破壞細胞膜的完整性進而影響細胞的生長[23]，而當真菌受到外來藥物作用時，細胞內的轉運蛋白又可以將有毒有害物質運輸至細胞外，保護真菌細胞的生長[24]。因此，用愈創(chuàng)木酚處理禾谷鐮刀菌后，細胞膜組分及細胞運輸相關的差異表達基因數(shù)量較多，且膜本體基因表達量顯著下調，推測愈創(chuàng)木酚破壞了禾谷鐮刀菌細胞膜的完整性，影響病原菌的生長。差異表達基因GO功能富集分析結果表明，愈創(chuàng)木酚處理禾谷鐮刀菌后離子運輸相關的差異表達基因較多，同時對表達差異基因進行驗證時亦發(fā)現(xiàn)Ca2+-ATPase3基因（FGSG_04919）在藥劑處理后表達量顯著下調。在真菌細胞中，Ca2+作為第二信使影響了真菌的生長、細胞器的定位等一系列過程[25]。細胞內Ca2+濃度不平衡會導致細胞器內環(huán)境紊亂，內質網(wǎng)會出現(xiàn)蛋白質合成問題，而囊泡則會出現(xiàn)蛋白質降解問題，這些問題都會導致細胞凋亡[26]。真菌細胞中影響鈣離子運輸?shù)闹饕槟ど系拟}離子運輸ATP酶（PMCA）相關基因[27]，對不同濃度愈創(chuàng)木酚處理后的禾谷鐮刀菌的4個PMCA基因進行qRT-PCR分析驗證，結果發(fā)現(xiàn)高濃度愈創(chuàng)木酚顯著抑制此類基因的表達，由此推測愈創(chuàng)酚處理后PMCA基因表達量的下調破壞了細胞內Ca2+的平衡，進而引起細胞凋亡，影響病原菌的生長。

本研究中，我們在轉錄組水平上研究了愈創(chuàng)木酚對禾谷鐮刀菌的作用機制，結果表明，愈創(chuàng)木酚能夠通過影響禾谷鐮刀菌的氧化應激反應途徑、破壞細胞膜的完整性以及破壞細胞內Ca2+的穩(wěn)態(tài)等方式來影響病原菌的生長，研究結果為進一步揭示愈創(chuàng)木酚作用的分子機制、挖掘作用靶標提供了參考。

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（責任編輯：陳海霞）

收稿日期：2021-05-26

基金項目：國家重點研發(fā)計劃項目（2018YFE0206000）;國家自然科學基金項目（31901936）

作者簡介：張瑤 （1997-），女，江蘇連云港人，碩士研究生，主要從事食品加工與安全方面的研究。（E-mail）1912682939@qq.com

通訊作者：馬桂珍， （E-mail）guizhenma@sohu.com;史建榮， （Tel）025-84392001，（E-mail）shiji@ jaas.ac.cn