后猛　李臣　宋煒涵　張?jiān)蕜偂±顝?qiáng)

摘要：紫肉甘薯因其塊根中富含紫色花青素而得名。本研究以2組栽培種紫肉甘薯及其淡黃肉突變體為材料，基于甘薯轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。以|log2 FC|≥1且錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）<0.01作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，鑒定差異表達(dá)基因（DEGs），對(duì)DEGs進(jìn)行GO功能分類和KEGG代謝通路分析，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）方法對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。樣品經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后，均獲得超過8 Gb的高質(zhì)量數(shù)據(jù)，拼接組裝共得到164 427條Unigenes。在2組甘薯材料及其突變體中分別檢測(cè)到2 262個(gè)和1 546個(gè)DEGs，其中有244個(gè)DEGs是2組甘薯材料共有的。GO功能分析發(fā)現(xiàn)，DEGs主要富集于苯丙氨酸解氨酶活性、著色、類黃酮生物合成過程、含花青素化合物生物合成過程等。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，DEGs主要分布在苯丙素類生物合成、苯丙氨酸代謝、類黃酮生物合成和花青素生物合成等代謝通路。隨機(jī)選擇27個(gè)與花青素生物代謝相關(guān)的候選基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，表達(dá)模式與測(cè)序結(jié)果一致。將2組材料中候選基因的表達(dá)水平與花青素含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，花青素生物合成相關(guān)的候選基因PAL-1、CHS、ANS、CCoAOMT、GST-2、ABC-1、bHLH和WRKY-2的相對(duì)表達(dá)量與花青素積累量的相關(guān)性達(dá)到顯著或極顯著水平。表明，2個(gè)甘薯突變體材料塊根薯肉紫色的缺失是由花青素的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平的降低共同引起的。通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以從中挖掘一些與花青素代謝相關(guān)的候選基因，為研究其在生物合成途徑中的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：紫肉甘薯;轉(zhuǎn)錄組測(cè)序;花青素代謝;差異表達(dá)基因

中圖分類號(hào)：S531文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2022）02-0313-13

Comparative transcriptome analysis on anthocyanin accumulation differences in purple-fleshed sweetpotatoes and their mutants

KOU Meng LI Chen ，SONG Wei-han ZHANG Yun-gang LI Qiang

Abstract：Purple-fleshed sweetpotato （PESP） is famous for the rich storage of purple anthocyanins in its storage root. In this study， two groups of PFSP cultivated species and their mutants with light yellow flesh were used as materials， and bioinformatics analysis was conducted based on transcriptome sequencing （RNA-seq） data of sweetpotatoes.|log2FC |≥1 and FDR （False discovery rate）<0.01 were used as screening standards to identify differentially expressed genes （DEGs）. Gene ontology （GO） functional classification and KEGG metabolic pathway analysis of DEGs were performed， and real-time quantitative PCR （qRT-PCR） method was used to verify the sequencing results. After transcriptome sequencing of the samples， more than eight Gb data with high quality were obtained for each sample， and a total of 164 427 Unigenes were obtained by splicing and assembling. 2 262 and 1 546 DEGs were detected respectively in two groups of sweetpotato materials and their mutants， among which 244 DEGs were shared between two groups of sweetpotato materials. Results of GO functional analysis showed that， DEGs mainly enriched in phenylalanine ammonia-lyase activity， pigmentation， flavonoid biosynthesis process and anthocyanin-containing compound biosynthesis process. Results of KEGG pathway analysis showed that， DEGs mainly distributed in metabolic pathways such as phenylpropanoid biosynthesis， phenylalanine metabolism， flavonoid biosynthesis and anthocyanin biosynthesis. In addition， 27 candidate genes related to anthocyanin biological metabolism were selected randomly for real-time quantitative PCR verification， and their expression patterns were found to be consistent with the sequencing results. Results of correlation analysis on gene expression level and anthocyanin content revealed that， relative expression levels of anthocyanin biosynthesis related candidate genes such as PAL-1， CHS， ANS， CCoAOMT， GST-2， ABC-1， bHLH and WRKY-2 were in significant or extremely significant correlation with anthocyanin accumulation. The results indicated that， the deficiency of purple color in the storage root flesh of two sweetpotato mutant materials was caused by the decrease of expression level of genes involved in anthocyanin synthesis， transport and related transcription factors. Some candidate genes related to anthocyanin metabolism can be found by transcriptome sequencing， which lays a foundation for study on their regulatory mechanism in biosynthesis pathways.

Key words：purple-fleshed sweetpotato;transcriptome sequencing;anthocyanin metabolism;differentially expressed genes

江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)2022年第38卷第2期

后猛等：紫肉甘薯及其突變體花青素積累差異的比較轉(zhuǎn)錄組分析

紫肉甘薯是一類特異的甘薯類型，除含有多種對(duì)人體有益的微量元素和礦物質(zhì)外，還富含具有抗氧化能力、防癌抗癌等生理保健功效的天然花青素，因而受到越來越多消費(fèi)者的歡迎[1-3]。與其他同類色素相比，從紫肉甘薯中提取出的花青素具有更為穩(wěn)定的理化性質(zhì)[1]，是一種優(yōu)質(zhì)的天然食用色素，具有多種營(yíng)養(yǎng)保健用途和藥理功能[2-3]。因此，探討花青素在紫肉甘薯塊根中代謝相關(guān)基因的差異表達(dá)及調(diào)控機(jī)制具有重要意義。植物體內(nèi)的色素主要包括類黃酮、甜菜堿類色素和類胡蘿卜素等[4]，其中花青素是屬于類黃酮的一類天然水溶性色素，由特有的C6-C3-C6碳骨架結(jié)構(gòu)和不同的取代基團(tuán)構(gòu)成，因其取代基數(shù)目和位置的不同而呈現(xiàn)出紅、橙、粉和藍(lán)等各種顏色[4-5]?；ㄇ嗨氐纳锖铣墒潜粡V泛研究的植物次生代謝途徑之一，花青素的生物合成與代謝過程一般由多種結(jié)構(gòu)基因編碼的關(guān)鍵酶、相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)以及起調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子等多個(gè)成員參與，目前已在擬南芥、金魚草和玉米等植物中被深入研究[4-6]。甘薯是中國(guó)重要的糧食作物，也是一種重要的能源和保健作物。隨著人們保健意識(shí)的增強(qiáng)和消費(fèi)水平的提高，人們對(duì)自身健康問題越來越關(guān)注，日本、美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家已把甘薯視為營(yíng)養(yǎng)全面而平衡的保健食品[7]。盡管已有較多關(guān)于紫肉甘薯花青素合成和積累的研究，但這些研究多集中在合成關(guān)鍵酶編碼基因方面，調(diào)控花青素代謝的分子機(jī)制仍不夠清楚。本研究以2個(gè)紫肉甘薯品系及其淡黃肉自然突變體為材料，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，為進(jìn)一步挖掘花青素代謝相關(guān)基因及功能研究提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料及RNA提取

本課題組在育種過程中發(fā)現(xiàn)2個(gè)甘薯肉色自然突變體，徐1604（紫皮紫肉）的突變體徐1604M（淡紅皮淡黃肉），徐0571（紫皮紫肉）的突變體徐0571M（淡紅皮淡黃肉）。經(jīng)過多年田間鑒定，這2個(gè)突變體薯肉顏色等性狀可以穩(wěn)定遺傳。將這兩組栽培種及其突變體材料栽插在江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗(yàn)田，于栽插后130 d收獲薯塊（圖1）。每個(gè)品種隨機(jī)選取12個(gè)中等大小的薯塊，將其中4個(gè)薯塊作為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共計(jì)3個(gè)重復(fù)，分別為：A1、A2和A3，B1、B2和B3，C1、C2和C3，D1、D2和D3。每個(gè)重復(fù)清洗擦干后去皮，切碎，混勻，錫箔紙包裹后迅速置于液氮中速凍，然后一部分樣品放于超低溫冰箱中-80 ℃保存，用于后續(xù)試驗(yàn)。另一部分樣品提取總RNA后，使用Nanodrop-1000檢測(cè)RNA的純度（OD260/OD280）和濃度，并用Agilent 2100生物分析儀（安捷倫科技有限公司產(chǎn)品）檢測(cè)RNA的完整性。采用高閏飛[8]的方法測(cè)定花青素含量。

1.2cDNA文庫(kù)構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

樣品檢測(cè)合格后，構(gòu)建cDNA文庫(kù)，隨后檢測(cè)文庫(kù)質(zhì)量。檢測(cè)結(jié)果合格后測(cè)序，并對(duì)原始數(shù)據(jù)（Raw data）進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾。獲得高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)后，使用Trinity軟件將Clean Data進(jìn)行序列組裝，最終得到Unigene庫(kù)。

1.3Unigene功能注釋與分類

采用BLAST軟件將本研究獲得的甘薯Unigene序列與NR（Non-redundant protein sequences in NCBI）、GO（Gene ontology）、Swiss-Prot（A manually annotated and reviewed protein sequence database）、KOG（eu Karyotic ortholog groups）、KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比，以獲得Unigene的注釋信息。

1.4花青素代謝途徑差異表達(dá)基因篩選

基因表達(dá)具有一定的時(shí)空特異性，不同條件下表達(dá)水平具有顯著差異的基因或轉(zhuǎn)錄本，被稱為差異表達(dá)基因（DEG），或差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本（DET）。根據(jù)樣品間表達(dá)水平高低，DEG（或DET）可以劃分成上調(diào)基因和下調(diào)基因。通過比對(duì)2個(gè)甘薯材料的Unigene序列，我們篩選出與花青素代謝相關(guān)的DEG（或DET）。

1.5花青素代謝途徑差異表達(dá)基因驗(yàn)證

1.5.1甘薯總RNA提取采用多糖多酚植物RNA提取試劑盒（北京華越洋生物科技有限公司產(chǎn)品）提取徐1604、徐1604M、徐0571、徐0571M的塊根總RNA，具體操作參考試劑盒說明書進(jìn)行。使用1.2%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證提取的RNA的完整性，用NanoDrop-1000微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和OD260/OD280。

1.5.2cDNA第一條鏈合成cDNA合成使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（TOYOBO公司產(chǎn)品）試劑盒，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）驗(yàn)證根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，采用Primer3Plus在線軟件（http：//www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi）設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。參照2×Q3 SYBR qPCR Master Mix（TOLOBIO公司產(chǎn)品）試劑盒說明書，使用QuantStudio 6 Flex熒光定量PCR儀進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系為：2×Q3 SYBR qPCR Master Mix 10 μl，模板2 μl，引物-F（10 mmol/L）和引物-R（10 mmol/L）各1 μl，ddH2O補(bǔ)足至20 μl。

反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 變性3 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s， 40個(gè)循環(huán)。溶解曲線為：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，并檢測(cè)熒光信號(hào)值。以IbARF為內(nèi)參基因[9]，用2-△△Ct法[10]計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，每1個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.6數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)的方差分析和相關(guān)性分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同甘薯材料總花青素含量的差異

由圖2可以看出，每100 g紫肉甘薯材料徐1604和徐0571花青素含量分別為（52.75±0.08） mg和（19.91±0.10） mg，而淡黃肉突變體材料徐1604M和徐0571M未檢測(cè)出花青素。結(jié)果表明，2組自然突變體與其紫肉栽培種薯塊肉色的差異主要表現(xiàn)在花青素含量不同。

2.2轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與組裝

采用Illumina HiSeqTM2000高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)2個(gè)甘薯材料及其突變體塊根進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，從表2中可以看出，經(jīng)過測(cè)序質(zhì)量控制，徐1604、徐1604M、徐0571、徐0571M分別獲得超過8.32 Gb、10.05 Gb、8.67 Gb和9.73 Gb clean data，Q30（堿基識(shí)別出錯(cuò)概率）分別達(dá)到92.77%、90.56%、92.86%和93.27%以上，所有樣品G+C含量均不低于46.42%，說明本研究獲得的甘薯轉(zhuǎn)錄組序列數(shù)據(jù)充足且質(zhì)量較高，能夠滿足后續(xù)試驗(yàn)的需要。

為避免低表達(dá)基因的測(cè)序量對(duì)構(gòu)建完整轉(zhuǎn)錄本的影響，對(duì)低表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行過濾，最終得到可靠的轉(zhuǎn)錄本。利用Trinity軟件對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行拼接（表3），獲得183 440個(gè)轉(zhuǎn)錄本，總長(zhǎng)度達(dá)91 725 016 bp，平均長(zhǎng)度為500 bp，N50為604 bp;進(jìn)一步組裝共得到164 427條Unigenes，總長(zhǎng)度達(dá)77 679 292 bp，平均長(zhǎng)度為472 bp，N50為544 bp，最大長(zhǎng)度為16 835 bp，最小長(zhǎng)度為201 bp，結(jié)果表明，該甘薯轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和組裝結(jié)果良好，可用于后續(xù)生物信息學(xué)研究。

2.3Unigene的功能注釋

通過BLAST程序?qū)⒏适鞺nigene序列與GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot 和NR等公共數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果（表4）顯示，注釋到GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot、NR數(shù)據(jù)庫(kù)中的Unigene分別為56 024個(gè)（占57.83%）、25 101個(gè)（占25.91%）、47 358個(gè)（占48.88%）、48 209個(gè)（占49.76%）、65 598個(gè)（占67.71%）、87 047個(gè)（占89.85%）。因此，在NR數(shù)據(jù)庫(kù)中找到相似序列最多，其中300 bp≤長(zhǎng)度<1 000 bp的Unigene有40 859個(gè)（占46.94%），長(zhǎng)度≥1 000 bp的Unigene有12 874個(gè)（占14.79%）;在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中找到相似序列最少，其中300 bp≤長(zhǎng)度<1 000 bp的Unigene有11 632個(gè)（占46.34%），長(zhǎng)度≥1 000 bp的Unigene有3 915個(gè)（占15.60%）。

2.4差異表達(dá)基因的比較分析

以∣log2FC∣≥1且FDR<0.01作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，我們對(duì)2個(gè)甘薯材料及其突變體間的差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類分析。其中差異倍數(shù)（FC）表示兩樣品（組）間表達(dá)量的比值。錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）是通過對(duì)差異顯著性P值進(jìn)行校正得到的。在徐1604 vs 徐1604M和徐0571 vs 徐0571M 2個(gè)比較組中分別檢測(cè)到2 262個(gè)和1 546個(gè)差異表達(dá)基因。其中，在徐1604 vs 徐1604M對(duì)比組中，上調(diào)表達(dá)基因有836個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因有1 426個(gè);在徐0571 vs徐0571M對(duì)比組中，上調(diào)表達(dá)基因有453個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因有1 093個(gè);在徐1604 vs徐1604M和徐0571 vs 徐0571M 2個(gè)組之間的比較中，共有244個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)基因12個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因232個(gè)（圖3）。

此外，我們還對(duì)2個(gè)對(duì)比組的DEGs進(jìn)行了GO分類和KEGG路徑分析。根據(jù)序列同源性，將DEGs分為生物學(xué)過程、細(xì)胞成分和分子功能3類。苯丙氨酸解氨酶活性是2個(gè)對(duì)比組中富集程度較高的GO項(xiàng)，其中與著色相關(guān)的5個(gè)基因在徐1604 vs 徐1604M中表達(dá)差異尤為明顯;與類黃酮生物合成過程相關(guān)的22個(gè)基因以及與含花青素化合物生物合成過程相關(guān)的8個(gè)基因在徐0571 vs 徐0571M中表達(dá)差異尤為明顯。選取排名前20位的差異表達(dá)基因的KEGG通路，確定了4條與塊根肉色相關(guān)的通路，即苯丙素類生物合成、苯丙氨酸代謝、類黃酮生物合成和花青素生物合成。

2.5花青素代謝途徑差異表達(dá)基因篩選及驗(yàn)證

本研究共篩選出11個(gè)編碼花青素生物合成途徑相關(guān)的10種酶的Unigenes（圖4）。這些假定的結(jié)構(gòu)基因包括PAL（2 Unigenes）、C4H（1 Unigene）、4CL（1 Unigene）、CHS（1 Unigene）、CHI（1 Unigene）、F3H（1 Unigene）、F3′H（1 Unigene）、DFR（1 Unigene）、ANS（1 Unigene）、UFGT（1 Unigene）。這11個(gè)Unigenes在2組甘薯材料及其突變體（徐1604 vs 徐1604M、徐0571 vs 徐0571M）中呈現(xiàn)出相似的表達(dá)模式。在淡黃肉突變體材料徐1604M和徐0571M的塊根中，所有編碼花青素生物合成的DEGs都比其紫肉栽培種甘薯材料（徐1604和徐0571）中的表達(dá)水平明顯降低。尤其是4CL（Unigene編號(hào)：TRINITY_DN137871_c0_g15 ）、CHS（Unigene編號(hào)：TRINITY_DN135554_c0_g6）、CHI（Unigene編號(hào)：TRINITY_DN113691_c2_g1）、F3H（Unigene編號(hào)：TRINITY_DN93879_c8_g1）、F3′H（Unigene編號(hào)：TRINITY_DN136727_c0_g1）、DFR（Unigene編號(hào)：TRINITY_DN129724_c3_g1）、ANS（Unigene編號(hào)：TRINITY_DN133085_c1_g6）和UFGT（Unigene編號(hào)：TRINITY_DN138985_c0_g14），在徐1604 vs 徐1604M和徐0571 vs 徐0571M中的表達(dá)量下降幅度更大。除此之外，在突變體材料徐1604M和徐0571M的塊根中，還發(fā)現(xiàn)1個(gè)與木質(zhì)素生物合成相關(guān)的基因，咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（CCoAOMT）（TRINITY_DN124453_c7_g2）編碼基因的表達(dá)水平顯著降低（圖4）。

為了篩選調(diào)控花青素生物合成的轉(zhuǎn)錄因子，從2組材料共有的244個(gè)DEGs中篩選到104個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子（TFs）的候選DEGs。由圖5可知，篩選得到的轉(zhuǎn)錄因子中以NAC、MYB、C2H2、bHLH家族成員為主，其次是AP2/ERF、B3、LOB等轉(zhuǎn)錄因子家族成員。在104個(gè)TFs中，通過轉(zhuǎn)錄組注釋分析，發(fā)現(xiàn)有11個(gè)TFs被注釋為可能參與花青素生物代謝（圖4）。MYB（Unigene編號(hào)：TRINITY_DN78368_c0_g1）在栽培種徐1604和徐0571中的轉(zhuǎn)錄水平，分別是突變體徐1604M和徐0571M的453.68倍和35.24倍，而bHLH（Unigene編號(hào)：TRINITY_DN140405_c1_g7）在栽培種徐1604和徐0571中的轉(zhuǎn)錄水平，分別是突變體徐1604M和徐0571M的1 682.92倍和33.71倍。此外，注釋為NAC、WRKY、ERF和LOB的TFs在徐1604 vs 徐1604M和徐0571 vs 徐0571M 2個(gè)比較組中的表達(dá)也發(fā)生了顯著下調(diào)。

本研究鑒定到5個(gè)編碼花青素轉(zhuǎn)運(yùn)的基因（圖4），分別為2個(gè)GST、1個(gè)MATE和2個(gè)ABC，在紫肉甘薯材料徐1604和徐0571中的表達(dá)水平都分別高于其淡黃肉突變體徐1604M和徐0571M，尤其是其中的1個(gè)GST（Unigene編號(hào)：TRINITY_DN128107_c8_g3）、1個(gè)MATE（Unigene編號(hào)：TRINITY_DN118813_c0_g1）和1個(gè)ABC（Unigene編號(hào)：TRINITY_DN135734_c2_g2），在徐1604 vs 徐1604M和徐0571 vs 徐0571M中的表達(dá)量下降幅度均較大。

以上結(jié)果表明，2組甘薯材料及其突變體塊根薯肉顏色表型的差異是由花青素的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控共同引起的。為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，本研究選擇了27個(gè)與花青素生物合成相關(guān)的候選DEGs進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，除4CL和MATE外，所選擇的DEGs表達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)基本一致，包括10個(gè)花青素合成相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因（圖6），1個(gè)木質(zhì)素合成相關(guān)基因（圖7），5個(gè)花青素合成轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)編碼基因（圖8），以及11個(gè)花生素生物合成轉(zhuǎn)錄因子編碼基因（圖9）。因此，本研究中的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)是可信的，而qRT-PCR與RNA-seq之間的相關(guān)性也較高（R2=0.624 4）（圖10）。此外，將這27個(gè)候選基因的相對(duì)表達(dá)量與塊根花青素含量進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，除MATE外，其他與花青素生物合成相關(guān)的候選基因的相對(duì)表達(dá)量均與花青素含量呈正相關(guān)，其中PAL-1、CHS、ANS、CCoAOMT、GST-2、ABC-1、bHLH和WRKY-2的相對(duì)表達(dá)量與花青素含量的相關(guān)性達(dá)到顯著或極顯著水平（表5）。本研究結(jié)果證實(shí)了測(cè)序數(shù)據(jù)是可靠的，另一方面還可以從中挖掘一些新的與花青素代謝相關(guān)的候選基因，尤其是與花青素轉(zhuǎn)運(yùn)和積累相關(guān)的基因，如ABC-1和GST-2等。

3討論

3.1甘薯轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及Unigene功能注釋分析

甘薯是世界上最重要的糧食作物之一[11-13]。由于其含有淀粉、膳食纖維、胡蘿卜素等對(duì)人體有益的成分，因此被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織推薦為最健康的食物。隨著保健意識(shí)的增強(qiáng)和消費(fèi)水平的提高，人們對(duì)自身的健康問題越來越關(guān)注，紫肉甘薯因其塊根富含花青素等具有生理保健功效的物質(zhì)[14-16]，受到越來越多消費(fèi)者的喜愛。

近些年來，伴隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷改進(jìn)和運(yùn)用，植物基因組學(xué)研究得到迅猛發(fā)展。而轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)因其測(cè)序準(zhǔn)確度高、通量大、速度快、運(yùn)行成本較低以及不需要任何基因信息等優(yōu)點(diǎn)，已在多種無(wú)參考序列物種中得到廣泛應(yīng)用[17-19]，尤其是在一些植物的顏色變化研究方面[20-22]。本研究采用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同類型甘薯進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，分別獲得超過8 G的原始數(shù)據(jù)，經(jīng)組裝后得到164 427個(gè)Unigenes，數(shù)量高于前人的測(cè)序結(jié)果[23-25]。Q30（>90%）、G+C含量（>46%）、N50（544 bp）等測(cè)序數(shù)據(jù)表明，測(cè)序結(jié)果較為可靠，可以滿足后續(xù)轉(zhuǎn)錄組分析的要求。將本研究獲取的甘薯Unigene與GO、KEGG、KOG、Pfam、Swiss-Prot、NR等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，分析可知共有96 882個(gè)（58.92%）Unigenes能夠獲得注釋信息，但是仍有67 545個(gè)（41.08%）Unigenes未能得到注釋，這可能與相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)基因功能注釋信息匱乏、所得Unigene序列長(zhǎng)度較短、甘薯中存在特有新基因等因素有關(guān)。

通過對(duì)2個(gè)甘薯材料的DEGs進(jìn)行GO分類分析，其功能主要分為生物學(xué)過程、細(xì)胞成分和分子功能3類，尤其是在苯丙氨酸解氨酶活性、類黃酮生物合成過程、與含花青素化合物生物合成過程相關(guān)等方面差異表達(dá)基因富集程度較高。甘薯塊根花青素合成代謝涉及很多生化過程，本研究中244個(gè)差異表達(dá)基因參與多個(gè)KEGG代謝通路，主要包括苯丙素類生物合成、苯丙氨酸代謝、類黃酮生物合成、花青素生物合成、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝、植物-病原互作等。而參與到次生代謝生物合成通路的DEGs主要是與苯丙烷、類黃酮和花青素等生物合成相關(guān)的酶編碼基因，本研究的測(cè)序結(jié)果將為發(fā)掘更多與花青素等黃酮類物質(zhì)代謝相關(guān)的基因提供數(shù)據(jù)支撐。

3.2花青素合成相關(guān)差異表達(dá)基因的篩選及分析

了解塊根花青素生物合成途徑的分子機(jī)制，有助于輔助紫肉甘薯育種。前期研究結(jié)果表明，花青素含量與許多植物中花青素生物合成相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)，如山藥[20]、馬鈴薯[26]、梨[27]和甜櫻桃[28]。比較RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)，與栽培種紫肉甘薯相比，突變體材料中有11個(gè)花青素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因（PAL 2個(gè)，C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、F3′H、DFR、ANS和UFGT各1個(gè)）下調(diào)表達(dá)，這些基因的表達(dá)模式與此前報(bào)道的結(jié)果相似。例如，在5個(gè)不同甘薯品種中，IbANS和IbF3′H的表達(dá)水平與花青素的積累模式高度匹配[29-30];IbCHI和其他花青素生物合成相關(guān)基因（IbCHS、IbF3H和IbDFR）的表達(dá)模式與不同品種甘薯成熟塊根中的花青素積累有關(guān)[31-32]。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)了不止1個(gè)注釋為PAL的Unigenes與花青素生物合成相關(guān)，表明這些Unigenes代表了1個(gè)基因家族的不同成員或單個(gè)轉(zhuǎn)錄本的不同片段[33]。另外，我們還發(fā)現(xiàn)4CL在徐0571 vs 徐0571M中的表達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果不同，這可能是由于4CL是植物類黃酮類化合物等生物合成途徑的一種關(guān)鍵酶，除參與花青素合成外，還可能在木質(zhì)素等多種次生代謝物合成方面發(fā)揮重要作用。在苯丙烷類生物合成途徑中，除花青素合成相關(guān)基因外，還有與木質(zhì)素合成相關(guān)的關(guān)鍵基因。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，本研究鑒定出1個(gè)參與木質(zhì)化的Unigene TRINITY_DN124453_c7_g2（注釋為CCoAOMT），它在突變體塊根中表達(dá)水平較低，其具體功能需要進(jìn)一步研究。

3.3花青素代謝調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子差異表達(dá)基因的篩選及分析

花青素代謝途經(jīng)是由MYB-bHLH-WD40（MBW）轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物控制的[34-35]。本研究中，我們從DEG數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)1個(gè)候選MYB基因，它在非紫肉突變體材料中明顯下調(diào)表達(dá)，與已報(bào)道的R2R3 MYB轉(zhuǎn)錄因子編碼基因IbMYB1最為相似。研究結(jié)果表明，在擬南芥[36]、煙草[37]和甘薯[38]中過表達(dá)IbMYB1，誘導(dǎo)了花青素結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植物的花青素色素沉積。 此外，在紫肉甘薯塊根中，發(fā)現(xiàn)1個(gè)bHLH上調(diào)表達(dá)，此基因表達(dá)量與花青素含量呈極顯著正相關(guān)。然而，本試驗(yàn)中沒有發(fā)現(xiàn)任何WD40的轉(zhuǎn)錄水平在紫肉甘薯品種及其突變體之間存在明顯差異。

除MBW復(fù)合體外，其他TFs也被認(rèn)為在控制花青素積累方面發(fā)揮了重要作用，如獼猴桃的SVP3（一種MADS結(jié)構(gòu)域TF的編碼基因）[39]、桃的BL （一種NAC TF的編碼基因）[40]、蘋果的MdHB1[41] （一種HD-Zip TF的編碼基因）和MdERF1B[42]（一種AP2/ERF TF的編碼基因）、番茄的SlHY5[43]（一種bZip TF的編碼基因）。最后我們從244個(gè)DEGs中選出3個(gè)NACs、2個(gè)WRKYs、3個(gè)ERFs和1個(gè)LOB，這些轉(zhuǎn)錄因子均在突變體材料中相對(duì)于紫肉甘薯下調(diào)表達(dá)，尤其是WRKY-2編碼基因的表達(dá)水平與花青素的積累量呈顯著正相關(guān)。因此，這些TFs可能被認(rèn)為是調(diào)控花青素合成的新的候選基因，其功能值得進(jìn)一步研究。

3.4花青素轉(zhuǎn)運(yùn)差異表達(dá)基因的篩選及分析

花青素轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制已在多種植物中有所報(bào)道。在眾多花青素轉(zhuǎn)運(yùn)體編碼基因中，GSTs在花青素運(yùn)輸和積累過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，如荔枝LcGST4[44]、草莓FvRAP[45]、蘋果MdGSTF6[46]、獼桃AcGST1[47]、桃PpRiant1[48]。前人從葡萄中分離出5個(gè)GST編碼基因（VviGST1～VviGST5）[49]，結(jié)果顯示，VviGST4與花青素和原花青素（PAs）的積累均相關(guān)，而VviGST3僅參與PAs的轉(zhuǎn)運(yùn)[50]。研究結(jié)果表明，與突變體相比，紫肉甘薯徐1604和徐0571中2個(gè)GST編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，相關(guān)性分析結(jié)果也表明花青素含量與其中1個(gè)GST編碼基因（Unigene號(hào)：TRINITY_DN134429_c6_g32）的表達(dá)水平相關(guān)性極顯著。此外，MATE和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體也與花青素的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[51-52]。本研究還從DEGs中鑒定出1個(gè)MATE和2個(gè)ABC，它們?cè)谧先馄贩N中表達(dá)水平顯著上調(diào)，尤其是ABC-1（Unigene號(hào)：TRINITY_DN135734_c2_g2）的表達(dá)量與花青素含量呈極顯著正相關(guān)。我們還發(fā)現(xiàn)MATE編碼基因在徐0571 vs 徐0571M中的表達(dá)模式與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)有所不同，這可能是由于MATE是植物中一個(gè)重要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)，其除了轉(zhuǎn)運(yùn)花青素等類黃酮類化合物外，還在鐵轉(zhuǎn)運(yùn)、鋁脫毒和生物堿等次生代謝物轉(zhuǎn)運(yùn)方面起重要作用[53]。目前僅有1個(gè)花青素相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IbGSTF4被報(bào)道[54]，因此，還需要進(jìn)一步研究來揭示甘薯中花青素轉(zhuǎn)運(yùn)體及其功能。

參考文獻(xiàn)：

[1]王玲，鄧敏姬. 紫甘薯天然紅色素的提取及其穩(wěn)定性研究[J]. 食品科技， 2011， 36（4）： 179-183.

[2]SHAN Q， ZHENG Y L， LU J， et al. Purple sweet potato color ameliorates kidney damage via inhibiting oxidative stress mediated NLRP3 inflammasome activation in high fat diet mice[J]. Food and Chemical Toxicology， 2014， 69：339-346.

[3]SUN H N， MU T H， LIU X L， et al. Purple sweet potato （Ipomoea batatas L.） anthocyanins： preventive effect on acute and subacute alcoholic liver damage and dealcoholic effect[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2014， 62：2364-2373.

[4]TANAKA Y， SASAKI N， OHMIYA A. Biosynthesis of plant pigments： anthocyanins， betalains and carotenoids[J]. The Plant Journal， 2008， 54（4）： 733-749.

[5]PETRUSSA E， BRAIDOT E， ZANCANI M， et al. Plant flavonoids-biosynthesis， transport and involvement in stress responses[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2013， 14（7）：14950-14973.

[6]宮硤，薛靜，張曉東. 植物花青素合成途徑中的調(diào)控基因研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)進(jìn)展， 2011， 1（6）：381-390.

[7]蘭嵐，周嬋媛，唐樂，等. 甘薯營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及綜合開發(fā)利用[J]. 現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)， 2016 （12）： 27-30.

[8]高閏飛. 利用形態(tài)學(xué)和SSR標(biāo)記分析中國(guó)紫心甘薯育成品種遺傳多樣性[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2019： 11-12.

[9]PARK S C， KIM Y H， JI C Y， et al. Stable internal reference genes for the normalization of real-time PCR in different sweetpotato cultivars subjected to abiotic stress conditions[J]. PLoS One， 2012， 7（12）： e51502.

[10]LIVAK K J， SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△Ct-method[J]. Methods， 2001， 25（4）： 402-408.

[11]FU Y F， MA L L， QIU F， et al. A prenyltransferase gene confirmed to be a carotenogenic CRTE gene from sweet potato[J]. Journal of Genetics and Genomics， 2014， 41（11）： 613-616.

[12]李臣，后猛，馬猛，等. 甘薯塊根熟化過程中麥芽糖變化及其影響因素研究進(jìn)展[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2021，37（2）：539-544.

[13]周志林，唐君，曹清河，等. 淀粉專用型甘薯品質(zhì)形成規(guī)律及其與主要農(nóng)藝性狀的相關(guān)性[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2020，36（2）：277-283.

[14]HU Y J， DENG L Q， CHEN J W， et al. An analytical pipeline to compare and characterise the anthocyanin antioxidant activities of purple sweet potato cultivars[J]. Food Chemistry， 2016， 194： 46-54.

[15]吳潔，沈?qū)W善，屈會(huì)娟，等.紫肉食用型甘薯品種川紫薯2號(hào)優(yōu)化栽培技術(shù)[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（16）：120-125.

[16]王輝，牟琴，聶廷，等.基于相關(guān)性與主成分分析法綜合評(píng)價(jià)不同品種甘薯脆片加工適宜性[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（6）：173-179.

[17]GRABHERR M G， HAAS B J， YASSOUR M， et al. Full-length transcriptome assembly from RNA-Seq data without a reference genome[J]. Nature Biotechnology， 2011， 29（7）： 644-652.

[18]韋麗君，俞奔馳，宋恩亮，等. 基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的木薯性別決定相關(guān)基因挖掘[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2020，51（8）：1785-1796.

[19]鞠燁，江建平，尹增芳，等. 孝順竹筍籜全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析[J]. 南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2020，44（6）：175-183.

[20]WU Z G， JIANG W， MANTRI N， et al. Transciptome analysis reveals flavonoid biosynthesis regulation and simple sequence repeats in yam （Dioscorea alata L.） tubers[J]. BMC Genomics， 2015， 16： 346.

[21]GONZLEZ M， SALAZAR E， CASTILLO J， et al. Genetic structure based on EST-SSR： a putative tool for fruit color selection in Japanese plum （Prunus salicina L.） breeding programs[J]. Molecular Breeding， 2016， 36（6）： 68.

[22]SHANGGUAN L F， MU Q， FANG X， et al. RNA-Sequencing reveals biological networks during table grapevine （‘Fujiminori′） fruit development[J]. PLoS One， 2017， 12（1）： e0170571.

[23]WANG Z Y， FANG B P， CHEN J Y， et al. De novo assembly and characterization of root transcriptome using Illumina paired-end sequencing and development of cSSR markers in sweetpotato （Ipomoea batatas） [J]. BMC Genomics， 2010， 11（1）：726-740.

[24]XIE F L， BURKLEW C E， YANG Y F， et al. De novo sequencing and a comprehensive analysis of purple sweet potato （Ipomoea batatas L.） transcriptome[J]. Planta， 2012， 236（1）： 101-113.

[25]LI R J， HONG Z， CHEN K， et al. De novo transcriptome sequencing of the orange-fleshed sweet potato and analysis of differentially expressed genes related to carotenoid biosynthesis[J]. International Journal of Genomics， 2015， 2015（13）： 1-10.

[26]LIU Y H， LIN-WANG K， DENG C， et al. Comparative transcriptome analysis of white and purple potato to identify genes involved in anthocyanin biosynthesis[J]. PLoS One， 2015， 10： e0129148.

[27]YANG Y N， YAO G F， ZHENG D， et al. Expression differences of anthocyanin biosynthesis genes reveal regulation patterns for red pear coloration[J]. Plant Cell Reports， 2015， 34：189-198.

[28]WEI H R， CHEN X， ZONG X J， et al. Comparative transcriptome analysis of genes involved in anthocyanin biosynthesis in the red and yellow fruits of sweet cherry （Prunusavium L.） [J]. PLoS One， 2015， 10： e0121164.

[29]ZHOU W， GONG Y F， LU X， et al. Molecular cloning and characterization of a flavonoid 3′-hydroxylase gene from purple-fleshed sweet potato （Ipomoea batatas） [J]. Molecular Biology Reports， 2012， 39（1）：295-302.

[30]ZHOU W， HUANG C T， GONG Y F， et al. Molecular cloning and expression analysis of an ANS gene encoding anthocyanidin synthase from purple-fleshed sweet potato [Ipomoea batatas （L.） Lam][J]. Plant Molecular Biology Reporter， 2010， 28（1）： 112-121.

[31]GUO J Y， ZHOU W， LU Z L， et al. Isolation and functional analysis of chalcone isomerase gene from purple-fleshed sweet potato[J]. Plant Molecular Biology Reporter， 2015， 33（5）：1451-1463.

[32]WANG H X， FAN W J， LI H， et al. Functional characterization of dihydroflavonol-4-reductase in anthocyanin biosynthesis of purple sweet potato underlies the direct evidence of anthocyanins function against abiotic stresses[J]. PLoS One， 2013， 8（11）： e78484.

[33]SUN C， LI Y， WU Q， et al. De novo sequencing and analysis of the American ginseng root transcriptome using a GS FLX Titanium platform to discover putative genes involved in ginsenoside biosynthesis[J]. BMC Genomic， 2010， 11：262.

[34]FELLER A， MACHEMER K， BRAUN E L， et al. Evolutionary and comparative analysis of MYB and bHLH plant transcription factors[J]. The Plant Journal， 2011， 66：94-116.

[35]ZHAO L， GAO L P， WANG H X， et al. The R2R3-MYB， bHLH， WD40， and related transcription factors in flavonoid biosynthesis[J]. Functional and Integrative Genomics， 2013， 13：75-98.

[36]CHU H， JEONG J C， KIM W J， et al. Expression of the sweetpotato R2R3-type IbMYB1a gene induces anthocyanin accumulation in Arabidopsis[J]. Physiologia Plantarum， 2013， 148： 189-199.

[37]AN C H， LEE K W， LEE S H， et al. Heterologous expression of IbMYB1a by different promoters exhibits different patterns of anthocyanin accumulation in tobacco[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2015， 89： 1-10.

[38]PARK S C， KIM Y H， KIM S H， et al. Overexpression of the IbMYB1 gene in an orange-fleshed sweet potato cultivar produces a dual-pigmented transgenic sweet potato with improved antioxidant activity[J]. Physiologia Plantarum， 2015， 153（4）： 525-537.

[39]WU R M， WANG T C， MCGIE T， et al. Overexpression of the kiwifruit SVP3 gene affects reproductive development and suppresses anthocyanin biosynthesis in petals， but has no effect on vegetative growth， dormancy， or flowering time[J]. Journal of Experimental Botany， 2014， 65：4985-4995.

[40]ZHOU H， LIN-WANG K， WANG H L， et al. Molecular genetics of blood-fleshed peach reveals activation of anthocyanin biosynthesis by NAC transcription factors[J]. The Plant Journal， 2015， 82：105-121.

[41]JIANG Y H， LIU C H， YAN D， et al. MdHB1 down-regulation activates anthocyanin biosynthesis in the white-fleshed apple cultivar ‘Granny Smith[J]. Journal of Experimental Botany， 2017， 68：1055-1069.

[42]ZHANG J， XU H F， WANG N， et al. The ethylene response factor MdERF1B regulates anthocyanin and proanthocyanidin biosynthesis in apple[J]. Plant Molecular Biology， 2018， 98：205-218.

[43]LIU C C， CHI C， JIN L J， et al. The bZip transcription factor HY5 mediates CRY1a-induced anthocyanin biosynthesis in tomato[J]. Plant Cell and Environment， 2018， 41：1762-1775.

[44]HU B， ZHAO J T， LAI B， et al. LcGST4 is an anthocyanin-related glutathione S-transferase gene in Litchi chinensis Sonn[J]. Plant Cell Reports， 2016， 35（4）： 831-843.

[45]LUO H F， DAI C， LI Y P， et al. Reduced anthocyanins in petioles codes for a GST anthocyanin transporter that is essential for the foliage and fruit coloration in strawberry[J]. Journal of Experimental Botany， 2018， 69：2595-2608.

[46]JIANG S H， CHEN M， HE N B， et al. MdGSTF6， activated by MdMYB1， plays an essential role in anthocyanin accumulation in apple[J]. Horticulture Research， 2019， 6：40.

[47]LIU Y F， QI Y W， ZHANG A L， et al. Molecular cloning and functional characterization of AcGST1， an anthocyanin-related glutathione S-transferase gene in kiwifruit （Actinidia chinensis） [J]. Plant Molecular Biology， 2019， 100：451-465.

[48]ZHAO Y， DONG W Q， ZHU Y C， et al. PpGST1， an anthocyanin-related glutathione S-transferase gene， is essential for fruit coloration in peach[J]. Plant Biotechnology Journal， 2020， 18：1-12.

[49]CONN S， CURTIN C， BZIER A， et al. Purification， molecular cloning， and characterization of glutathione S-transferases （GSTs） from pigmented Vitis vinifera L. cell suspension cultures as putative anthocyanin transport proteins[J]. Journal of Experimental Botany， 2008， 59（13）： 3621-3634.

[50]PREZ-DAZ R， MADRID-ESPINOZA J， SALINAS-CORNEJO J， et al. Differential roles for VviGST1， VviGST3， and VviGST4 in proanthocyanidin and anthocyanin transport in Vitis vinifera[J]. Frontiers in Plant Science， 2016， 7：1166.

[51]FRANCISCO R M， REGALADO A， AGEORGES A， et al. ABCC1， an ATP binding cassette protein from grape berry， transports anthocyanidin 3-O-glucosides[J]. The Plant Cell， 2013， 25（5）： 1840-1854.

[52]GOMEZ C， TERRIER N， TORREGROSA L， et al. Grapevine MATE-type proteins act as vacuolar H+-dependent acylated anthocyanin transporters[J]. Plant Physiology， 2009， 150（1）： 402-415.

[53]吳遠(yuǎn)雙，宋毅豪，吳寶堯，等. 植物多藥和有毒化合物排出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白研究進(jìn)展[J]. 廣西植物， 2018， 38（11）：128-138.

[54]KOU MENG， LIU Y J， LI Z Y， et al. A novel glutathione S-transferase gene from sweetpotato， IbGSTF4， is involved in anthocyanin sequestration[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2019， 135： 395-403.

（責(zé)任編輯：陳海霞）

收稿日期：2021-08-03

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2019YFD1001300、2019YFD1001304）;國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-10）

作者簡(jiǎn)介：后猛（1981-），男，山東曹縣人，博士，副研究員，主要從事甘薯遺傳育種研究。（E-mail）koumeng2113@163.com

通訊作者：李強(qiáng)，（E-mail）instrong@ 163.com