于江輝　李焱瑤　秦冠男　翁綠水　蔣顯斌　鄧力華

摘要：為了對(duì)水稻低鎘積累基因進(jìn)行精準(zhǔn)檢測(cè)和世代跟蹤，提高低鎘積累水稻品種的分子標(biāo)記輔助育種（MAS）選育效率，基于秈稻品種9311及其低鎘積累突變體lcd1材料7號(hào)染色體上OsNRAMP5基因第7外顯子單核苷酸的突變，參照四引物擴(kuò)增受阻突變PCR（Tetra-primer amplification refractory mutation system-PCR，Tetra-primer ARMS-PCR）原理設(shè)計(jì)了共顯性功能標(biāo)記nra5fun，且采用PCR方法分別對(duì)18份秈稻、18份粳稻及金23B/lcd1雜交F1代材料進(jìn)行分子標(biāo)記特異性驗(yàn)證。電泳結(jié)果表明，含OsNRAMP5基因SNP突變材料lcd1可擴(kuò)增出大小為723 bp、210 bp的條帶，含野生型OsNRAMP5基因的材料9311可擴(kuò)增出大小為723 bp、557 bp的條帶，金23B/lcd1 F1代雜合型材料可擴(kuò)增出大小為723 bp、557 bp、210 bp的條帶，共顯性標(biāo)記nra5fun得到的電泳條帶與引物設(shè)計(jì)時(shí)預(yù)測(cè)的目標(biāo)片段完全吻合;Sanger測(cè)序結(jié)果表明，電泳擴(kuò)增條帶片段的序列與目的基因的DNA序列和SNP突變位點(diǎn)的序列一致;18份秈稻和18份粳稻種質(zhì)資源均能擴(kuò)出大小為723 bp、557 bp 2個(gè)目的條帶，說明這些材料均不含有OsNRAMP5基因的單個(gè)SNP突變，表明該標(biāo)記特異性較高。因此，開發(fā)的功能標(biāo)記nra5fun能夠準(zhǔn)確、高效地識(shí)別水稻低鎘積累基因的純合突變型、純合野生型和雜合型，可在水稻低鎘積累分子育種中推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：水稻;低鎘;分子標(biāo)記;分子育種;OsNRAMP5基因

中圖分類號(hào)：S511.035.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2022）02-0289-07

Development and validation of functional markers of low-cadmium accumulation mutation sites in rice OsNRAMP5 gene

YU Jiang-hui LI Yan-yao QIN Guan-nan WENG Lü-shui JIANG Xian-bin DENG Li-hua

Abstract：The purpose of this study is to achieve accurate detection and generation tracking of low cadmium accumulation genes in rice， and improve the efficiency of molecular marker assisted selection （MAS）. There was a single nucleotide mutation in exon 7 of OsNRAMP5 gene on chromosome 7 between the indica rice 9311 and the mutation lcd1， and the co-dominance functional marker nra5fun was developed according to tetra-primer amplification refractory mutation system-PCR. PCR was used to verify the molecular marker specificity of 18 indica rice， 18 japonica rice and Jin23B/lcd1 hybrid F1 materials. Electrophoretic detection results showed that the mutant material lcd1 containing OsNRAMP5 gene could be amplified 723 bp and 210 bp bands， the 9311 containing wild-type OsNRAMP5 gene could be amplified 723 bp and 557 bp bands， and the heterozygote Jin23B/lcd1 could be amplified 723 bp， 557 bp and 210 bp bands. The electrophoresis bands obtained by co-dominant marker nra5fun were consistent with those of the predicted target fragments. Sanger sequencing results showed that the sequence of amplified fragment was consistent with the DNA sequence of the target gene and the sequence of single nucleotide polymorphism（SNP） sites. Two target bands with lengths of 723 bp and 557 bp were amplified from 18 indica and 18 japonica germplasm resources， indicating that these cultivars did not contain single SNP mutation of OsNRAMP5 gene. So， the marker had high specificity. In conclusion， the functional marker nra5fun can accurately and efficiently identify homozygous mutant， homozygous wild type and heterozygous type of low cadmium accumulation genes in rice， and it can be widely used in the breeding of low cadmium rice cultivars.

Key words：rice;low-cadmium;molecular marker;molecular breeding;OsNRAMP5 gene

水稻（Oryza sativa L.）是全球近半數(shù)人口的主要糧食作物，是中國(guó)僅次于玉米的主要糧食作物，廣泛分布于中國(guó)六大稻區(qū)。隨著工農(nóng)業(yè)的高速發(fā)展和城市化進(jìn)程的推進(jìn)，土壤重金屬污染已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)的一個(gè)重要環(huán)境問題，中國(guó)面臨的形勢(shì)更加嚴(yán)峻[1]。同時(shí)，由于工業(yè)“三廢”的不合理排放、污水的大量灌溉、污泥的大量利用、農(nóng)藥及化肥的過量使用等原因，使得土壤中的重金屬鎘（Cd）含量持續(xù)增加，Cd污染日益嚴(yán)重[2]。研究發(fā)現(xiàn)，水稻比其他谷類作物更容易積累Cd，且Cd可以通過根系在植株中運(yùn)輸和積累，尤其是在可食用的稻米部分，而Cd在稻米中的積累威脅到了糧食安全[3-4]。特別是近年來，中國(guó)南方出現(xiàn)的“鎘大米”引起了人們對(duì)大米等農(nóng)產(chǎn)品Cd污染的極大關(guān)注[5]。此外，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的土壤Cd污染會(huì)導(dǎo)致水稻減產(chǎn)[6]。2005年的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)受Cd污染的耕地面積近1.33×104 hm2，由此每年造成糧食減產(chǎn)在1×107 t以上，受Cd污染的稻谷近2×106 t，直接經(jīng)濟(jì)損失超過2×1010元[7]。為了避免水稻中Cd積累過量，近年來科學(xué)家們提出并研究了一些降低水稻籽粒中Cd積累量的技術(shù)措施，主要包括使用物理、化學(xué)和生物方法阻礙稻田Cd經(jīng)根系進(jìn)入植株體內(nèi)、適當(dāng)配施有機(jī)肥和化肥、采用間作或作物輪作、適當(dāng)采用田間淹水管理等農(nóng)藝調(diào)控措施， 以及利用分子生物學(xué)和遺傳學(xué)方法培育低Cd積累水稻品種的育種調(diào)控措施等[8]。其中，培育低Cd積累水稻品種被認(rèn)為是減少稻米Cd含量效果最好和最經(jīng)濟(jì)的方法[9]?？梢钥闯觯虲d積累水稻品種的選育，對(duì)人體健康、食品安全、糧食穩(wěn)產(chǎn)和環(huán)境保護(hù)等具有重大意義。

近年來，研究人員在探索植物吸收Cd的生理、生化及分子生物學(xué)的過程中，相繼挖掘、研究了許多調(diào)控或參與調(diào)控水稻Cd吸收、運(yùn)輸和積累的相關(guān)蛋白質(zhì)。目前，研究者至少已經(jīng)克隆了34個(gè)相關(guān)基因，其中一些關(guān)鍵基因的發(fā)現(xiàn)對(duì)水稻低Cd積累育種具有重要的應(yīng)用價(jià)值[5， 10]。OsHMA3是一個(gè)位于7號(hào)染色體上的控制水稻Cd積累的基因，是P1B類型的重金屬ATP酶（HMA）基因家族成員，該基因的表達(dá)主要在根部，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，水稻中有9個(gè)HMA基因，過表達(dá)OsHMA3會(huì)抑制Cd從水稻根系向植株的運(yùn)輸，因此過表達(dá)OsHMA3基因能顯著降低稻米Cd含量，而不影響其他微量元素含量[11-13]。OsCd1是位于水稻3號(hào)染色體上的一個(gè)與谷粒Cd積累相關(guān)的基因，它屬于膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的主要協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族（Major facilitator superfamily， MFS）基因，主要在根細(xì)胞的質(zhì)膜中表達(dá)。粳稻的主要基因?yàn)镺sCd1V449，秈稻的主要基因?yàn)镺sCd1D44，在秈稻中導(dǎo)入粳稻OsCd1V449基因可顯著降低谷粒Cd含量，且對(duì)植株生殖生長(zhǎng)和產(chǎn)量等性狀無顯著影響[14]。水稻自然抗性相關(guān)巨噬細(xì)胞蛋白（Natural resistance-associated macrophage protein，NRAMP）基因是一種高度保守的二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)家族基因成員，目前在水稻基因組中發(fā)現(xiàn)的NRAMP基因有7個(gè)，其中OsNRAMP5位于其根、外皮層的遠(yuǎn)端，因此在根內(nèi)具有較高表達(dá)量，其編碼的蛋白質(zhì)位于細(xì)胞質(zhì)膜上，主要參與根系對(duì)錳（Mn）和Cd的吸收[15]。研究發(fā)現(xiàn)，OsNRAMP5基因敲除或表達(dá)量的減少會(huì)顯著降低水稻對(duì)Cd、Mn的吸收量，從而導(dǎo)致其對(duì)Cd的積累量減少，但在低Mn環(huán)境下會(huì)影響植株的生長(zhǎng)，同時(shí)也會(huì)影響植株產(chǎn)量[16-20]。而Chang等[21]研究發(fā)現(xiàn)，雖然過量表達(dá)OsNRAMP5基因促進(jìn)了根系對(duì)Cd和Mn的吸收，但是由于Cd在木質(zhì)部徑向運(yùn)輸?shù)闹袛?，使得Cd從根到莖的運(yùn)輸量減少，導(dǎo)致稻米中的Cd含量降低了49%～94%。有研究發(fā)現(xiàn)，通過水稻OsNRAMP5基因的突變亦可顯著降低稻谷中Cd含量[22-23]。Ishikawa等[22]利用碳離子束輻射日本水稻品種越光獲得了3個(gè)低Cd突變體，研究發(fā)現(xiàn)，由于OsNRAMP5基因突變，導(dǎo)致Cd的積累量顯著減少。Cao等[23]利用甲磺酸乙酯（Ethyl methanesulfonate， EMS）對(duì)秈稻品種9311進(jìn)行誘變，獲得低Cd積累突變體lcd1，進(jìn)一步鑒定發(fā)現(xiàn)，在不同Cd污染試驗(yàn)田，突變體lcd1稻谷Cd含量?jī)H為0.02～0.13 mg/kg，而野生型9311稻谷Cd含量達(dá)1.02～4.44 mg/kg，可能由于OsNRAMP5基因的1個(gè)堿基的突變，導(dǎo)致稻谷Cd積累量的大幅度降低。本研究基于突變材料lcd1中OsNRAMP5基因1個(gè)堿基的單核苷酸突變，參照四引物擴(kuò)增受阻突變PCR（Tetra-primer amplification refractory mutation system-PCR，Tetra-primer ARMS-PCR）原理，設(shè)計(jì)出含4條引物、與OsNRAMP5基因突變位點(diǎn)共分離的共顯性功能標(biāo)記，進(jìn)一步利用該標(biāo)記對(duì)不同水稻種質(zhì)資源和金23B/lcd1的雜種F1代植株通過PCR擴(kuò)增進(jìn)行驗(yàn)證，以期開發(fā)出功能標(biāo)記為低Cd積累水稻材料的分子育種研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1參試材料

供試水稻材料：含有OsNRAMP5基因SNP突變的材料lcd1[23]，由湖南省水稻研究所提供;18份來自不同地區(qū)的秈稻品種（R1044、R43-02、R1269、華占、荃9311B、野香B、金23B、農(nóng)香42、R106、R299、R900、廣恢390、農(nóng)香39、岳恢9113、珞紅5B、望恢006、黃華占、湘早秈45），包括常規(guī)秈稻、野生型保持系、紅蓮型保持系;18份來自不同地區(qū)常規(guī)粳稻品種（長(zhǎng)粒香、吉粳1、吉粳88、遼粳287、龍粳5號(hào)、寧粳4號(hào)、千重浪2號(hào)、中花11、東稻2號(hào)、東稻3號(hào)、東稻4號(hào)、綏粳4號(hào)、越光、長(zhǎng)白10號(hào)、長(zhǎng)選10、東農(nóng)416、龍粳21、長(zhǎng)白9號(hào)）;金23B/lcd1（雜交F1代材料）、對(duì)照秈稻品種9311。上述秈稻、粳稻、雜交F1代材料由筆者所在課題組保存或改造。

1.2OsNRAMP5基因SNP突變功能標(biāo)記的設(shè)計(jì)與合成

突變材料lcd1 7號(hào)染色體上OsNRAMP5基因的第7外顯子的8 887 787位單核苷酸的隱性突變，會(huì)導(dǎo)致lcd1籽粒Cd含量急劇降低。研究發(fā)現(xiàn)，突變體lcd1中該位點(diǎn)的堿基為T，而野生型秈稻9311中該位點(diǎn)的核苷酸為C[23]。因此，筆者針對(duì)OsNRAMP5（基因位點(diǎn)：BGIOSGA024510、Os07g0257200）基因編碼區(qū)8 887 787位點(diǎn)存在的單個(gè)SNP，參照ARMS-PCR的分子標(biāo)記原理，設(shè)計(jì)了由4引物（表1）組成的功能標(biāo)記nra5fun，在引物nra5fun-af、nra5fun-ar、nra5fun-bf中各設(shè)計(jì)了1個(gè)錯(cuò)配堿基，在引物nra5fun-br中分別設(shè)計(jì)了2個(gè)錯(cuò)配堿基（表1中的小寫字母）。使用在線工具Primer3web（http：//primer3.ut.ee/）、Primer BLAST進(jìn)行引物設(shè)計(jì)、引物Tm值（指在模板DNA過量的情況下，有50%的引物與模板精確配對(duì)，50%的引物處于解離狀態(tài)時(shí)的溫度）篩選及引物特異性評(píng)估等。由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成nra5fun功能標(biāo)記引物的合成和目的DNA片段的測(cè)序。

1.3DNA提取與分子標(biāo)記檢測(cè)

水稻移栽14 d后取供試材料的葉片，用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取DNA。用10 μl PCR擴(kuò)增體系對(duì)供試材料的目的片段進(jìn)行擴(kuò)增，體系組分：5 μl 2×Rapid Taq Master Mix（由南京諾唯贊生物科技有限公司合成），1 μl 10 μmol/L表1中的4種引物等量混合物（經(jīng)驗(yàn)證調(diào)整后，4種引物按1∶1∶1∶2的比例進(jìn)行混合PCR效果較好），1 μl DNA模板，3 μl ddH2O。在55.0～62.0 ℃進(jìn)行最適退火溫度探索，最后確定最佳退火溫度為61 ℃。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)本試驗(yàn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

2結(jié)果與分析

2.1nra5fun功能標(biāo)記的開發(fā)

根據(jù)OsNRAMP5基因單個(gè)SNP的突變（C→T），本研究開發(fā)了4條引物的突變功能標(biāo)記nra5fun（圖1）。首先設(shè)計(jì)1對(duì)外引物nra5fun-af和nra5fun-ar作為對(duì)照，并各引入1個(gè)錯(cuò)配堿基， 野生型和突變型水稻材料均可以擴(kuò)增出大小為723 bp的條帶，且擴(kuò)增產(chǎn)物都包含功能性SNP位點(diǎn)，然后根據(jù)SNP突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)2條反向內(nèi)引物nra5fun-br和nra5fun-bf，其中引物nra5fun-br與突變型基因匹配，其3′端對(duì)應(yīng)突變堿基T，引物nra5fun-bf與野生型基因匹配，其3′端對(duì)應(yīng)堿基C。同時(shí)為了進(jìn)一步增強(qiáng)PCR目的條帶的特異性擴(kuò)增，在引物nra5fun-br 5′端第6、10位分別設(shè)計(jì)錯(cuò)配堿基G，在引物nra5fun-ar 5′端第6位設(shè)計(jì)錯(cuò)配堿基T。參照4條引物設(shè)計(jì)策略進(jìn)行預(yù)測(cè)：引物nra5fun-br/nra5fun-af可擴(kuò)增出大小為210 bp的條帶，為突變型材料lcd1特有條帶;引物nra5fun-bf/nra5fun-ar可擴(kuò)增出大小為557 bp的條帶，為野生型秈稻9311特有條帶。由此可見，突變型純合體可擴(kuò)增出2個(gè)條帶，大小分別為723 bp和210 bp;而野生型純合體亦可擴(kuò)增出2個(gè)條帶，大小分別為723 bp和557 bp;雜合型材料可擴(kuò)增出3個(gè)條帶，大小分別為723 bp、557 bp、210 bp。

2.2nra5fun功能標(biāo)記的驗(yàn)證和退火溫度對(duì)標(biāo)記檢測(cè)效果的影響

相關(guān)研究結(jié)果表明，退火溫度對(duì)PCR反應(yīng)的影響較大，提高目的條帶的特異性需要較高的退火溫度，但會(huì)降低其擴(kuò)增量，而退火溫度較低會(huì)因PCR反應(yīng)目的片段的特異性不夠高而導(dǎo)致假陽性[24]。為了驗(yàn)證nra5fun分子標(biāo)記的準(zhǔn)確性及確定最佳退火溫度，本研究將4條引物按相同組成比例進(jìn)行PCR擴(kuò)增，且在不同退火溫度下擴(kuò)增特異性條帶。由圖2可以看出，當(dāng)退火溫度為55～62 ℃時(shí)，引物nra5fun-af/nra5fun-ar均能擴(kuò)增出大小為723 bp的條帶，引物nra5fun-bf/nra5fun-ar均可擴(kuò)增出大小為557 bp的條帶，可見外引物nra5fun-af、nra5fun-ar和內(nèi)引物nra5fun-bf對(duì)退火溫度不敏感。由于內(nèi)引物nra5fun-br中設(shè)計(jì)了2個(gè)錯(cuò)配堿基，因此PCR反應(yīng)目的條帶的特異性擴(kuò)增需要較高的退火溫度。結(jié)果表明，當(dāng)退火溫度為55～60 ℃時(shí)，突變型、野生型、雜合型水稻均可擴(kuò)增出大小為210 bp左右的條帶，當(dāng)退火溫度達(dá)到61 ℃或62 ℃時(shí)，突變型（lcd1）和雜合型（金23B/lcd1）水稻均擴(kuò)增出了大小為210 bp左右的條帶，而野生型水稻（9311）未擴(kuò)增出條帶，表明nra5fun功能標(biāo)記最適的退火溫度約為61 ℃。綜上所述，當(dāng)退火溫度為61 ℃時(shí)，含OsNRAMP5基因SNP突變材料lcd1擴(kuò)增出了大小為723 bp、210 bp的條帶，含野生型OsNRAMP5基因的9311水稻材料擴(kuò)增出了大小為723 bp、557 bp的條帶，雜合型金23B/lcd1水稻材料擴(kuò)增出了大小為723 bp、557 bp、210 bp的條帶。由此可見，共顯性標(biāo)記大小與預(yù)測(cè)的目標(biāo)片段大小一致。

為了進(jìn)一步確認(rèn)nra5fun功能標(biāo)記物在61 ℃或62 ℃退火條件下PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)確性，對(duì)退火溫度為61 ℃時(shí)突變型、野生型材料PCR產(chǎn)物中的最大片段（723 bp）分別進(jìn)行切膠回收，并進(jìn)行Sanger測(cè)序，由圖3可以看出，lcd1突變型、9311野生型水稻材料7號(hào)染色體上的8 887 787位核苷酸分別對(duì)應(yīng)A和G（互補(bǔ)鏈為T、C），DNA序列其他堿基無差異，與圖1的結(jié)果一致。

2.3nra5fun功能標(biāo)記對(duì)不同水稻種質(zhì)資源的驗(yàn)證

由于本研究在設(shè)計(jì)內(nèi)部引物時(shí)，與突變型基因匹配的nra5fun-br引物內(nèi)部引入了2個(gè)錯(cuò)配堿基，導(dǎo)致目標(biāo)條帶擴(kuò)增效率降低，條帶較淺（210 bp大小，圖2）。因此為了提高內(nèi)引物nra5fun-br的擴(kuò)增效率，在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，將4條引物nra5fun-af、nra5fun-ar、nra5fun-bf、nra5fun-br的用量配比調(diào)節(jié)為1∶1∶1∶2。電泳結(jié)果顯示，引物nra5fun-br/nra5fun-af擴(kuò)增210 bp條帶的效率明顯提高，且另2種條帶的擴(kuò)增效率未受影響（圖4）。為進(jìn)一步驗(yàn)證nra5fun功能標(biāo)記在不同水稻品種（品系）基因分型中的準(zhǔn)確性，利用該標(biāo)記對(duì)不同來源的18份秈稻、18份粳稻種質(zhì)資源進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)。由圖4可知，18份秈稻或粳稻種質(zhì)資源中均能擴(kuò)增出大小為723 bp、557 bp的目標(biāo)條帶，且擴(kuò)增不出大小為210 bp的條帶類型，說明這些材料均不含有OsNRAMP5基因單個(gè)SNP（C→T）的突變。綜上所述，利用功能標(biāo)記nra5fun可以準(zhǔn)確、快速地判斷對(duì)應(yīng)水稻材料中是否含有低Cd積累基因OsNRAMPS單個(gè)SNP突變位點(diǎn)，可為低Cd積累水稻品種的選育提供新的分子標(biāo)記輔助選擇。

3討論

分子標(biāo)記輔助育種（Molecular marker-assisted selection，MAS）利用與目的基因共分離的連鎖標(biāo)記或目的基因自身的功能標(biāo)記來鑒定雜交改良后代的基因型，因其操作快速且準(zhǔn)確，可提高育種效率和縮短品種穩(wěn)定的年限，目前已成為水稻等農(nóng)作物重要性狀改良的有效方法。但是，連鎖標(biāo)記與目的基因之間可能發(fā)生重組交換，因假陽性導(dǎo)致目的基因丟失，而目的基因自身的功能標(biāo)記與其完全耦合，避免了連鎖標(biāo)記存在的遺傳冗余和重組問題，提高了MAS選擇的效率和準(zhǔn)確性[25]。目前，針對(duì)基因內(nèi)堿基突變差異設(shè)計(jì)分子標(biāo)記的方法主要有2種，分別為限制性內(nèi)切酶酶切（CAPS或者dCAPS）和擴(kuò)增受阻突變PCR（Amplification refractory mutation system PCR，ARMS-PCR），其中ARMS-PCR是最經(jīng)濟(jì)且應(yīng)用最廣泛的方法[26]，且在此基礎(chǔ)上開發(fā)的四引物擴(kuò)增受阻突變PCR（Tetra-primer amplification refractory polymorphism system-PCR，Tetra-primer ARMS-PCR），通過單次PCR擴(kuò)增就可將野生純合型、突變純合型、雜合型進(jìn)行有效區(qū)分[27-28]。本研究利用來自秈稻9311的突變體材料lcd1的7號(hào)染色體上OsNRAMP5基因第7外顯子的8 887 787位單個(gè)SNP突變[23]，參照Tetra-primer ARMS-PCR原理，利用四引物擴(kuò)增受阻法設(shè)計(jì)了功能標(biāo)記nra5fun，可以將突變型、野生型、雜合型水稻材料有效區(qū)分，并且對(duì)來自不同地區(qū)的秈稻、粳稻各18份種質(zhì)資源進(jìn)行PCR驗(yàn)證。電泳結(jié)果表明，擴(kuò)增出與野生型9311同樣的條帶類型，證明該標(biāo)記的準(zhǔn)確性和特異性，且該標(biāo)記方法操作簡(jiǎn)單、擴(kuò)增快速準(zhǔn)確，在實(shí)際應(yīng)用中優(yōu)勢(shì)明顯，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)OsNRAMP5基因材料的準(zhǔn)確檢測(cè)，從而可以廣泛應(yīng)用于水稻低Cd積累資源的鑒定和MAS育種中。此外，參照前人的引物設(shè)計(jì)策略[26， 29]，本研究在設(shè)計(jì)外引物時(shí)，分別引入單個(gè)錯(cuò)配堿基，結(jié)果沒有影響引物與模板DNA的特異性結(jié)合和目的片段的PCR擴(kuò)增效果。據(jù)報(bào)道，由于Tetra-primer ARMS-PCR引物在同一個(gè)擴(kuò)增體系中，導(dǎo)致目的片段擴(kuò)增效率和特異性受引物用量比、酶濃度和退火溫度的影響[27]。由于本研究在設(shè)計(jì)與突變基因匹配的內(nèi)引物nra5fun-br時(shí)引入了2個(gè)錯(cuò)配堿基，導(dǎo)致目的條帶擴(kuò)增效率降低，條帶較淺。基于前人的研究結(jié)果[25-27]，本試驗(yàn)將引物nra5fun-br摩爾質(zhì)量比提高了1倍后再次進(jìn)行PCR，結(jié)果表明，目的條帶擴(kuò)增效率明顯提高，達(dá)到了基因檢測(cè)的預(yù)期效果。同時(shí)，nra5fun功能標(biāo)記對(duì)退火溫度的特異性較高，在退火溫度達(dá)到61 ℃或62 ℃時(shí)才可避免假陽性，為此，對(duì)61 ℃退火溫度的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序的結(jié)果證實(shí)了所擴(kuò)增目的片段的準(zhǔn)確性。前人對(duì)SNP突變基因分子標(biāo)記的開發(fā)也有相同的試驗(yàn)結(jié)果[27]。

近年來，研究者關(guān)于水稻根系對(duì)Mn、Cd吸收的OsNRAMP5基因進(jìn)行了大量研究，旨在剖析該基因的作用機(jī)制和培育低Cd積累水稻品種[15-23]。Tang等[30]利用CRISPR/Cas9對(duì)隆兩優(yōu)華占親本OsNRAMP5基因進(jìn)行編輯，敲除該基因后培育出的兩優(yōu)低鎘1號(hào)稻米的Cd積累量比野生型隆兩優(yōu)華占降低了98%以上，而且產(chǎn)量間無顯著差異。此外，研究者通過靶向編輯不同遺傳背景水稻材料的OsNRAMP5基因，亦獲得了一些低Cd積累的水稻品系[17-18]。但是上述通過基因編輯手段改變OsNRAMP5基因表達(dá)量培育的“去鎘”水稻屬轉(zhuǎn)基因材料，目前無法商業(yè)化應(yīng)用， 因此需要在誘變等育種技術(shù)的應(yīng)用上進(jìn)行創(chuàng)新，加快培育非轉(zhuǎn)基因“去鎘”水稻種質(zhì)或品種[5]。Ishikawa等[22]采用碳離子束輻射日本優(yōu)質(zhì)品種越光得到3個(gè)低Cd積累突變體，其中突變體lcd-kmt1與lcd-kmt2不僅稻米Cd含量顯著下降，而且農(nóng)藝性狀和品質(zhì)與越光相比無明顯差異，同時(shí)lcd-kmt2獲得新品種登記并命名為Kan1[31]。Cao等[23]用化學(xué)試劑甲磺酸乙酯（Ethyl methanesulfonate， EMS）誘變秈稻材料9311得到低Cd積累突變體lcd1，種植于不同稻田lcd1材料谷粒中Cd含量?jī)H為0.02～0.13 mg/kg，且產(chǎn)量等重要農(nóng)藝性狀與9311無差異。由此可見，突變體lcd1具有極大的育種價(jià)值。本研究就突變材料lcd1 OsNRAMP5基因的單個(gè)SNP突變堿基設(shè)計(jì)了功能標(biāo)記nra5fun，在低Cd積累品種MAS的選育中具有重大應(yīng)用前景。筆者認(rèn)為，可以將目前各稻區(qū)的主推品種、當(dāng)家品種或具有較大應(yīng)用潛力的育種品系作為受體材料，將突變體lcd1作為供體材料，通過雜交滲入低Cd積累基因，通過回交利用功能標(biāo)記nra5fun進(jìn)行世代檢測(cè)直至材料穩(wěn)定，即可創(chuàng)制出農(nóng)藝性狀與受體材料無差異的低Cd積累新品系。而且本研究利用四引物法設(shè)計(jì)的共顯性功能標(biāo)記nra5fun可以區(qū)別雜交改造后代材料的純合型或雜合型，在回交選育中材料更容易穩(wěn)定，可以有效縮短育種年限，提高低鎘積累水稻品種的選育效率。

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（責(zé)任編輯：徐艷）

收稿日期：2021-09-05

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金聯(lián)合基金項(xiàng)目（U19A2025）

作者簡(jiǎn)介：于江輝（1986-），男，內(nèi)蒙古烏蘭察布人，碩士，助理研究員，主要從事水稻分子育種研究。（E-mail）yujianghui@isa.ac.cn。李焱瑤為共同第一作者。

通訊作者：蔣顯斌，（E-mail）350139343@qq.com;鄧力華，（E-mail）denglihua@isa.ac.cn