楊舒晗 蔡延芳 王野影 胡燦實(shí) 張明明 粟海軍*

(1.貴州大學(xué)林學(xué)院，貴陽(yáng)，550025；2.貴州大學(xué)生物多樣性與自然保護(hù)研究中心，貴陽(yáng)，550025；3.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng)，550025；4.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng)，550025)

食物是野生動(dòng)物生存的第一要素，生境食物條件與動(dòng)物覓食行為的共同作用，影響著野生動(dòng)物個(gè)體或種群的分布格局與生存適合度[1-2]，覓食生態(tài)學(xué)是動(dòng)物行為生態(tài)學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容。動(dòng)物的食性和覓食行為受遺傳基因、生活史階段、種間及種內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)等因素影響，常形成十分固定的食譜結(jié)構(gòu)和行為模式[3]，因此，掌握物種的食性或覓食行為，是進(jìn)一步開(kāi)展物種生態(tài)學(xué)研究與保護(hù)管理的重要基礎(chǔ)。

隱紋花松鼠(Tamiopsswinhoei)是廣泛分布于我國(guó)南方各省森林、林緣和灌木生境的一種松鼠科(Sciuridae)花松鼠屬物種[4]。它是一種生性靈活機(jī)警、代謝率高、捕食行為頻繁的雜食性動(dòng)物[5]。對(duì)于隱紋花松鼠的研究十分少見(jiàn)，主要集中在亞種層次的分類學(xué)及生物學(xué)描述上[5-7]，生態(tài)學(xué)上僅有對(duì)其棲息環(huán)境、活動(dòng)規(guī)律、生活習(xí)性等一般性描述[8-9]，對(duì)其深入細(xì)致的食性分析尚為空白。對(duì)松鼠科動(dòng)物食性的相關(guān)報(bào)道中，采用的研究方法包括直接觀察法、解剖法、糞便顯微組織分析法和胃容物分析法等，其中胃容物分析法是國(guó)內(nèi)外研究嚙齒動(dòng)物(Rodetia)食性的主要方法[10]，但傳統(tǒng)的胃容物檢測(cè)方法效率低、誤差大[11]。為了準(zhǔn)確揭示隱紋花松鼠的食性，本研究運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定隱紋花松鼠樣本胃容物，以期更為精確地探索喀斯特地區(qū)隱紋花松鼠的食性組成，為今后深入研究這一物種提供基礎(chǔ)資料。

1 研究區(qū)概況

采樣地位于貴州省黔南苗族布依族自治州黔、桂交界處的荔波縣翁昂鄉(xiāng)(圖1)，選擇2個(gè)采樣斑塊(25°13′ N，107°58′ E)，采樣面積約48 hm2，平均海拔780 m，為典型石灰?guī)r地區(qū)。該區(qū)域?qū)儆谥衼啛釒Ъ撅L(fēng)濕潤(rùn)氣候區(qū)，平均氣溫為15.3 ℃，1月和7月平均氣溫分別為5.2、23.5 ℃，生長(zhǎng)期237 d；全年降水量約1 750 mm，集中分布在4—10月。該區(qū)域與荔波世界自然遺產(chǎn)地及茂蘭國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)相鄰，水熱條件好，森林植被組成多為典型的中亞熱帶石灰?guī)r常綠落葉闊葉混交林，區(qū)內(nèi)原生林保存較為完整。茂蘭被譽(yù)為是地球同緯度地區(qū)原生性最強(qiáng)、最具代表性的喀斯特森林生態(tài)系統(tǒng)[12-13]。

圖1 研究地位置圖Fig.1 Location map of the study area 注：A.研究區(qū)域在貴州省的位置；B.研究區(qū)域樣品采集點(diǎn)；C.采樣地實(shí)景 Note：A，The location of study area in Guizhou Province.B，Sampling sites in the study area.C，The overall landscape view of the study site

2 材料與方法

2.1 材料

2017年10—12月，在貴州荔波茂蘭喀斯特林區(qū)通過(guò)籠捕法收集隱紋花松鼠，隨機(jī)布籠共捕獲19只個(gè)體，根據(jù)批準(zhǔn)的獵取限額取8只成年活體作采樣標(biāo)本(編號(hào)WA1～WA4采自斑塊1；編號(hào)WA5～WA8采自斑塊2，均雌雄各半)，其余放歸。樣本經(jīng)CO2氣體處死后，進(jìn)行常規(guī)生物學(xué)測(cè)量(性別、體重、體長(zhǎng)、尾長(zhǎng)、后足長(zhǎng)和耳長(zhǎng))，隨后立即解剖，取胃置于5%的福爾馬林溶液中固定[14]，冰箱中-20 ℃保存。測(cè)定的樣本信息見(jiàn)表1。

表1 隱紋花松鼠樣本信息

2.2 胃容物基因組DNA 的提取

使用OMEGA Soil DNA Kit(D5625-01)提取DNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定隱紋花松鼠樣本A260值，計(jì)算濃度，通過(guò)A260/A280值鑒定DNA和RNA純度，0.8%瓊脂電泳驗(yàn)證完整性。

2.3 目的基因片段的PCR擴(kuò)增與測(cè)序

用引物Z1aF(5′-ATGTCACCACCAACAGAGACTAAAGC-3′)和hp2R(5′-CGTCCTTTGTAACGATCAAG-3′)對(duì)葉綠體rbcL基因進(jìn)行擴(kuò)增。用引物COⅠintF(5′-GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC-3′)和COⅠjgHC02198(5′-TANACYTCNGGRTGNCCRAARAAYCA-3′)對(duì)線粒體COⅠ基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系的總體積為25.00 μL，其中包括5×reaction buffer 5.00 μL，5×GC buffer 5.00 μL，dNTP(10 mmol/L)0.50 μL，正向引物(10 μmol/L)1.00 μL，反向引物(10 μmol/L)1.00 μL，DNA模板1.00 μL，ddH2O 11.25 μL，Q5 high-fidelity DNA polymerase 0.25 μL。擴(kuò)增rbcL和COⅠ基因片段反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min，4 ℃保溫。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用Axygen凝膠回收試劑盒回收目的片段。利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit對(duì)PCR產(chǎn)物在Microplate reader(BioTek，F(xiàn)Lx800)上定量，然后按照每個(gè)樣品所需的數(shù)據(jù)量混樣。之后送至上海派森諾生物科技股份有限公司平臺(tái)測(cè)序。

3 數(shù)據(jù)處理與分析

下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)疑問(wèn)序列的剔除及序列數(shù)統(tǒng)計(jì)后得到有效數(shù)據(jù)。應(yīng)用QIIME軟件對(duì)序列按照97%的序列相似度歸并和操作分類單元聚類分析，產(chǎn)生OTU表并與UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)(Release 5.0，https：//unite.ut.ee)、Silva數(shù)據(jù)庫(kù)(Release115，http：//www.arb-silva.de)、Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)(Release 13.8，http：//greengenes. secondgenome.com)比對(duì)分類分析，所用平臺(tái)為QIIME軟件(Quantitative Insights Into Microbial Ecology，v1.8.0，http：//qiime.org)統(tǒng)計(jì)后得到個(gè)體樣本分類鑒定結(jié)果。

為了檢驗(yàn)試驗(yàn)測(cè)序結(jié)果的深度，基于OTU聚類分析結(jié)果對(duì)貴州荔波茂蘭喀斯特地區(qū)的隱紋花松鼠樣本做稀釋性曲線分析。為了揭示隱紋花松鼠胃容物的組成，首先在滿足正態(tài)分布的前提下，對(duì)隱紋花松鼠外形進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；其次，使用QIIME軟件，獲取各樣本在科屬分類水平上的植物和動(dòng)物群落的組成和相對(duì)豐度分布，揭示隱紋花松鼠的食性組成。

4 結(jié)果與分析

4.1 OTU劃分與分類地位鑒定

分別選取隱紋花松鼠葉綠體rbcL基因片段、線粒體COⅠ基因片段，對(duì)其胃內(nèi)容物的植物組成和動(dòng)物組成進(jìn)行組分分析鑒定。在植物鑒定中，經(jīng)Illumina高通量測(cè)序共從8個(gè)樣品中獲得目的片段539 008條，樣品的序列數(shù)最低為50 153條，最高為93 291條，經(jīng)過(guò)聚類共獲得295個(gè)OTU。在動(dòng)物鑒定中，共從8個(gè)樣品中獲得目的片段264 983條，樣品的序列數(shù)最低為29 819條，最高為37 116條，經(jīng)過(guò)聚類共獲得1 000個(gè)OTU。

4.2 隱紋花松鼠食物的科屬分類多樣性

通過(guò)OTU聚類確定隱紋花松鼠攝食植物有73科109屬，樣品中殼斗科(Fagaceae)、樟科(Lauraceae)、平蘚科(Neckeraceae)、胡桃科(Juglandaceae)、毛茛科(Ranunculaceae)、山茱萸科(Cornaceae)、木犀科(Oleaceae)、扁萼苔科(Radulaceae)、提燈蘚科(Mniaceae)、錦蘚科(Sematophyllaceae)、五加科(Araliaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、衛(wèi)茅科(Celastraceae)、木靈蘚科(Orthotrichaceae)、罌粟科(Papaveraceae)、錦葵科(Malvaceae)、番荔枝科(Annonaceae)、禾本科(Poaceae)、耳葉苔科(Frullaniaceae)和十字花科(Brassicaceae)的總相對(duì)讀長(zhǎng)豐度為0.953 3～0.997 2(圖2)，其中殼斗科相對(duì)讀長(zhǎng)豐度最大(0.030 9～0.964 5)，然后為樟科(0.003 6～0.487 3)、平蘚科(0.001 2～0.277 0)、胡桃科(0.003 7～0.368 8)、毛茛科(0.001 2～0.174 4)、山茱萸科(0.001 9～0.242 2)、木犀科(0.000 9～0.220 9)、扁萼苔科(0.000 5～0.086 1)、提燈蘚科(0.000 2～0.081 1)、錦蘚科(0.000 1～0.045 7)、五加科(0.000 6～0.007 6)、石竹科(0.000 2～0.035 9)、衛(wèi)茅科(0.000 3～0.031 4)、木靈蘚科(0～0.020 6)、罌粟科(0.000 1～0.023 0)、錦葵科(0～0.016 6)、番荔枝科(0.000 1～0.016 5)、禾本科(0～0.013 2)、耳葉苔科(0～0.012 2)和十字花科(0～0.010 6)。

圖2 茂蘭隱紋花松鼠胃容物樣品中平均相對(duì)讀長(zhǎng)豐度最高的20科植物Fig.2 The top 20 plant families with the highest average relative read abundance in the samples of stomach content of Tamiops swinhoei in Maolan

由圖3可見(jiàn)，在屬水平上，樣品中櫟屬(Quercus)、杯托樟屬(Aiouea)、狄氏蘚屬(Dixonia)、煙包樹(shù)屬(Engelhardia)、山茱萸屬(Cornus)、素馨屬(Jasminum)、唐松草屬(Thalictrum)、鐵線蓮屬(Clematis)、扁萼苔屬(Radula)、絲瓜蘚屬(Pohlia)、刺疣蘚屬(Trichosteleum)、南洋參屬(Polyscias)、孩兒參屬(Pseudostellaria)、衛(wèi)矛屬(Euonymus)、木靈蘚屬(Orthotrichum)、荷青花屬(Hylomecon)、棉屬(Gossypium)、瓜馥木屬(Fissistigma)、耳葉苔屬(Frullania)和蕓薹屬(Brassica)的總相對(duì)讀長(zhǎng)豐度為0.952 8～0.995 6，其中櫟屬的相對(duì)讀長(zhǎng)豐度最高(0.028 2～0.963 2)，然后為杯托樟屬(0.003 5～0.482 9)、狄氏蘚屬(0.001 2～0.277 0)、煙包樹(shù)屬(0.003 7～0.368 8)、山茱萸屬(0.001 9～0.242 2)、素馨屬(0.000 9～0.220 9)、唐松草屬(0.000 7～0.172 5)、鐵線蓮屬(0.000 4～0.140 5)、扁萼苔屬(0.000 5～0.086 1)、絲瓜蘚屬(0.000 2～0.081 1)、刺疣蘚屬(0.000 1～0.045 6)、南洋參屬(0.000 6～0.007 6)、孩兒參屬(0.000 2～0.035 9)、衛(wèi)矛屬(0.000 3～0.031 2)、木靈蘚屬(0～0.020 6)、荷青花屬(0.000 1～0.023 0)、棉屬(0～0.016 6)、瓜馥木屬(0.000 1～0.016 1)、耳葉苔屬(0～0.012 2)和蕓薹屬(0～0.010 6)。

圖3 茂蘭隱紋花松鼠胃容物樣品中平均相對(duì)讀長(zhǎng)豐度最高的20屬植物Fig.3 The top 20 genre with the highest average relative read abundance in the samples of stomach content of Tamiops swinhoei in Maolan

通過(guò)OTU聚類確定隱紋花松鼠攝食動(dòng)物有82科120屬，由圖4可見(jiàn)，樣品中刺蛾科(Limacodidae)、蝽科(Pentatomidae)、匍蠊科(Blaberidae)、步行蟲(chóng)科(Carabidae)、葉甲科(Chrysomelidae)、海蛄蝦科(Thalassinidae)、偽瓢蟲(chóng)科(Endomychidae)、蠓科(Ceratopogonidae)、思蒂格諾盲蛛科(Stygnopsidae)、蚊科(Culicidae)、廁蠅科(Fanniidae)、天?？?Cerambycidae)、蝗科(Acrididae)和麗蠅科(Calliphoridae)的總相對(duì)讀長(zhǎng)豐度為0.000 5～0.848 7，其中刺蛾科相對(duì)讀長(zhǎng)豐度最大(0～0.780 0)，然后為蝽科(0～0.186 8)、匍蠊科(0～0.074 8)、步行蟲(chóng)科(0～0.071 6)、葉甲科(0～0.034 5)、海蛄蝦科(0～0.031 6)、偽瓢蟲(chóng)科(0～0.031 7)、蠓科(0～0.026 8)、思蒂格諾盲蛛科(0～0.012 3)、蚊科(0～0.020 9)、廁蠅科(0～0.015 1)、天?？?0～0.005 3)、蝗科(0～0.007 8)和麗蠅科(0～0.003 2)。

圖4 茂蘭隱紋花松鼠胃容物樣品中平均相對(duì)讀長(zhǎng)豐度最高的14科動(dòng)物Fig.4 The top 14 animal families with the highest average relative read abundance in the samples of stomach content of Tamiops swinhoei in Maolan

由圖5可見(jiàn)，在屬水平上，樣品中Natada、茶翅蝽屬(Halyomorpha)、Nebria、Thyant、海蛄蝦屬(Thalassina)、Indalmus、庫(kù)蠓屬(Culicoides)、庫(kù)蚊亞屬(Culex)、廁蠅屬(Fannia)、通緣步甲屬(Pterostichus)和雛蝗屬(Chorthippus)的總相對(duì)讀長(zhǎng)豐度為0.000 3～0.814 2，其中Natada的相對(duì)讀長(zhǎng)豐度最大(0～0.814 2)，然后為茶翅蝽屬(0～0.186 8)、Nebria(0～0.071 6)、Thyanta(0～0.034 5)、海蛄蝦屬(0～0.031 7)、Indalmus(0～0.026 8)、庫(kù)蠓屬(0～0.012 3)、庫(kù)蚊亞屬(0～0.015 1)、廁蠅屬(0～0.005 3)、通緣步甲屬(0～0.007 8)和雛蝗屬(0～0.004 3)。

圖5 茂蘭隱紋花松鼠胃容物樣品中平均相對(duì)讀長(zhǎng)豐度最高的11屬動(dòng)物Fig.5 The top 11 genre with the highest average relative read length and abundance in the samples of stomach content of Tamiops swinhoei in Maolan

5 討論

動(dòng)物食性分析方法的精確性直接關(guān)系到食性相關(guān)理論的研究水平，也關(guān)乎食性結(jié)果應(yīng)用于動(dòng)物保護(hù)的實(shí)踐[15]，所以選擇合適的食性研究方法至關(guān)重要。胃容物分析法是通過(guò)采集的胃樣，分析食物組成，以準(zhǔn)確確定動(dòng)物食性的一種方法[16]。高通量測(cè)序是DNA測(cè)序技術(shù)發(fā)展中的重大突破，可以對(duì)數(shù)百萬(wàn)個(gè)DNA分子同時(shí)測(cè)序[17-19]，避免分離或純化的過(guò)程便可得到豐富的物種信息，只需對(duì)PCR產(chǎn)物直接測(cè)序[20]，從而可忽略動(dòng)物本身序列產(chǎn)生的影響[21]，以獲取信息量大、成效快等特點(diǎn)被廣泛地應(yīng)用于動(dòng)物食性研究中[22-24]。采用胃容物高通量測(cè)序技術(shù)分析嚙齒動(dòng)物食性，相對(duì)于傳統(tǒng)食性分析方法，具有不依賴于研究者的經(jīng)驗(yàn)和主觀判斷，不受食物消化程度和硬質(zhì)殘留比例的局限等優(yōu)點(diǎn)，大幅提高了食物物種辨識(shí)的準(zhǔn)確度和可信度[11，20]，可最大限度地揭示食物種類組成[25]，獲得物種所消耗的不同食物相對(duì)量的定量數(shù)據(jù)[11，20]。但高通量測(cè)序技術(shù)也存在一定的缺陷性和不確定性，擴(kuò)增區(qū)域的選擇、模板DNA的質(zhì)量、PCR、讀長(zhǎng)的清晰度和解析度、數(shù)據(jù)庫(kù)的完善及該技術(shù)本身等均會(huì)對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。

本研究結(jié)果中，攝食植物中的杯托樟屬，通過(guò)查找其分布發(fā)現(xiàn)，該屬物種主要分布在新熱帶界，而古北界及東洋界一帶暫無(wú)分布記錄，分析其首要原因可能是國(guó)內(nèi)對(duì)于該屬物種缺乏研究，相關(guān)報(bào)道非常少；其次可能是物種注釋的問(wèn)題，按照97%的序列相似度歸并的分析標(biāo)準(zhǔn)會(huì)影響到高通量測(cè)序?qū)δ承┪锓N鑒別的精準(zhǔn)度，導(dǎo)致該屬的分辨率不夠清晰，注釋到近緣屬物種的情況。在攝食動(dòng)物中，也存在此現(xiàn)象。對(duì)此，可考慮采取其他方法與之相結(jié)合達(dá)到更優(yōu)的鑒定結(jié)果。劉剛等[11]曾表明，在同一個(gè)研究中，通過(guò)開(kāi)展高通量測(cè)序與另一種食性分析方法的結(jié)合是驗(yàn)證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的有效途徑，已有學(xué)者證實(shí)，通過(guò)與攝像機(jī)結(jié)合等方式可起到互補(bǔ)驗(yàn)證作用[15]，因此，本研究結(jié)果還需結(jié)合其他食性分析方法，做進(jìn)一步地補(bǔ)充和驗(yàn)證。雖然高通量測(cè)序技術(shù)還存在一定的局限，但不斷完善和具備的定量特征，以及各種分析軟件的日漸成熟，目前仍然可被廣泛應(yīng)用于食物組成的評(píng)估研究[15]。

在已有研究報(bào)道中，采取野外觀察和夾日法捕獲花鼠(Eutamiassibiricus)對(duì)其頰囊食物在解剖鏡下分類，對(duì)胃解剖發(fā)現(xiàn)花鼠春季主要取食多年生早春雜草，夏季主要取食漿果和經(jīng)濟(jì)類水果，也取食一些小型動(dòng)物及昆蟲(chóng)，秋季主要取食向日葵(Helianthusannuus)種子和大田作物，冬季進(jìn)入間歇性冬眠[26]。本研究結(jié)果表明，貴州荔波茂蘭喀斯特地區(qū)隱紋花松鼠為雜食性動(dòng)物，攝食植物多達(dá)73科109屬，其中櫟屬、杯托樟屬、狄氏蘚屬、煙包樹(shù)屬、山茱萸屬、素馨屬、唐松草屬、鐵線蓮屬、扁萼苔屬和絲瓜蘚屬為其偏好性植物，且殼斗科櫟屬為最重要的食物來(lái)源；攝食動(dòng)物82科120屬，其中Natada、茶翅蝽屬和Nebria取食量在動(dòng)物食源中占比相對(duì)更大，表明隱紋花松鼠攝食食物類型豐富，是偏植食性雜食動(dòng)物。

荔波茂蘭地區(qū)為典型喀斯特中亞熱帶喀斯特森林生態(tài)系統(tǒng)，林分保存較好，以天然次生林為主，尤其殼斗科植物豐富[27]，果實(shí)熱量高，適口性好，極易被取食，果期10—11月，與本研究采集樣本的時(shí)間耦合，該時(shí)期食物資源豐富，可為接下來(lái)入冬的隱紋花松鼠生存提供保障。本研究在測(cè)量樣本信息時(shí)發(fā)現(xiàn)，2個(gè)采樣斑塊的樣本在體重上有著明顯差異(斑塊1樣本平均體重109.3 g，而斑塊2樣本平均體重僅為66.4 g)，樣本經(jīng)生殖器和妊娠檢驗(yàn)，均為成體(雌性排除妊娠情況)，年齡差異應(yīng)不可能造成如此懸殊的情況，從兩地個(gè)體的食性構(gòu)成(圖3，圖4)來(lái)看，未發(fā)現(xiàn)兩采樣斑塊種群食性有明顯特征差異，這一現(xiàn)象有待進(jìn)一步采樣并探究其原因。

嚙齒動(dòng)物取食食譜受自然環(huán)境中食物資源狀況影響，不同季節(jié)資源狀況可能也不盡相同[28]。本次采集隱紋花松鼠樣本的時(shí)間為10—12月，如果要全面了解各季節(jié)時(shí)段的食性，還需連續(xù)采集不同季節(jié)的樣本，進(jìn)一步研究全年的食性規(guī)律。