陳 光 李 勇 朱功良 張 俊 馮 偉 陳 婧彭金山 鄭和松 楊國祥*

(1.湖北省野生動物救護(hù)研究開發(fā)中心，武漢，430075；2.湖北龍感湖國家級自然保護(hù)區(qū)管理局，黃岡，435500；3.黃石市網(wǎng)湖濕地自然保護(hù)區(qū)管理局，黃石，435200)

疫病不僅影響野生動物的個體健康，嚴(yán)重時還可威脅野生動物種群安全。野生動物疫病的應(yīng)急檢測和日常監(jiān)測是野生動物疫源疫病應(yīng)急防控和預(yù)警預(yù)報的重要和基礎(chǔ)性工作，也是生物安全防御關(guān)口前移的關(guān)鍵。

疫病檢測結(jié)果直接影響野生動物異常事件的應(yīng)急處置，而在野生動物異常情況出現(xiàn)的早期能夠進(jìn)行快速鑒定診斷則是預(yù)防疫病傳播及防止疫情擴(kuò)散的關(guān)鍵。由于受到實驗室條件、人員技術(shù)能力等的限制，國內(nèi)野生動物樣品檢測幾乎全部依托科研院校，導(dǎo)致檢測結(jié)果獲取和運用的時效性、即時性受到一定影響。

自1955年以來，禽流感(avian influenza，AI)在禽類中呈不同規(guī)模的流行[1]，已導(dǎo)致不計其數(shù)的家禽、野禽死亡[2-13]，造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)宿主廣泛，可感染家禽、野禽及多種哺乳動物[1]，給野生動物，尤其是鳥類的種群和生態(tài)安全帶來了巨大威脅。同時，禽流感病毒跨宿主傳播事件頻發(fā)，如2009年甲型H1N1流感[14]、2013年人感染H7N9禽流感[15]，給公共衛(wèi)生安全帶來了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

多年來，鳥類禽流感一直是野生動物疫源疫病監(jiān)測的主要對象之一。實驗室一般將采集的野生動物糞便、拭子等樣品通過SPF雞胚擴(kuò)增病毒、逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)，或直接使用實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qPCR)來檢測禽流感病毒。我國現(xiàn)有監(jiān)測站大都依托當(dāng)?shù)刈匀槐Ｗo(hù)區(qū)、鳥類環(huán)志或森林有害生物防治部門，未建立專門的監(jiān)測預(yù)警機(jī)構(gòu)，也缺乏專業(yè)技術(shù)人員[16]，同時，普遍缺少相應(yīng)級別的生物安全實驗室、qPCR儀等病原分離鑒定的條件和技術(shù)。與病毒分離及qPCR相比，二次PCR方法無須高級別生物安全實驗室或?qū)嶒炘O(shè)備，另外，由于鳥類樣品獲取困難、病毒含量低微，對檢測方法的敏感性要求較高。與一次PCR相比，二次PCR陽性檢出率明顯高于一次PCR[17-19]，因此，二次PCR方法符合我國野生動物疫源疫病監(jiān)測實際。本研究針對采集的鳥類拭子樣品，不經(jīng)過病毒擴(kuò)增，使用二次PCR檢測，建立禽流感病毒直接鑒定方法，為野生動物異常情況處置提供快速、即時和敏感的技術(shù)支持。

1 樣品簡介

2020年11—12月，在湖北省長江沿線2個湖區(qū)進(jìn)行野生動物異常情況調(diào)查時，采集鳥類及周邊散居禽類咽拭樣品21份。經(jīng)中科院武漢病毒所流感病毒學(xué)科組和東北林業(yè)大學(xué)野生動物與自然保護(hù)地學(xué)院的qPCR鑒定，有12份樣品的流感病毒核酸呈陽性，9份呈陰性(使用引物或探針不做區(qū)分)，咽拭未經(jīng)過SPF雞胚擴(kuò)增病毒。采用的樣品為21份咽拭樣品的備份樣，為便于描述，將21份咽拭樣品分別編號為1～21，其中，樣品1～4、6～10、16～18的流感病毒核酸呈陽性(18為弱陽性)，5、11～15、19～21呈陰性。

2 研究方法

2.1 cDNA制備

根據(jù)柱式病毒RNA抽提純化試劑盒(購自上海生工，以下簡稱生工試劑盒)說明書將拭子進(jìn)行前處理及RNA提取，最后加入40 μL DEPC-treated ddH2O，得到RNA產(chǎn)物溶液。取10 μL RNA產(chǎn)物溶液，加入反轉(zhuǎn)錄引物U12(5′-AGCAAAAGCAGG-3′)2 μL，將混合液70 ℃水浴5 min后，冰浴5 min以上。

配制反轉(zhuǎn)錄體系，將13 μL體系加入混合液后，42 ℃水浴1 h，之后95 ℃水浴5 min。反轉(zhuǎn)錄總體系為13.0 μL，其中DEPC水2.0 μL，5×Buffer 5.0 μL，dNTPs(2 mmol/L)5.0 μL，M-MLV 0.5 μL，RNA酶抑制劑0.5 μL。

2.2 一次RT-PCR

以制備的cDNA為模板，使用名稱為NP、M、HA的3對引物(由東北林業(yè)大學(xué)野生動物與自然保護(hù)地學(xué)院提供)，分別擴(kuò)增病毒NP、M、HA基因部分片段，根據(jù)PremixTaqTM(plus dye)(購自北京TakaRa)說明書的PCR反應(yīng)體系及條件，配制25 μL體系進(jìn)行PCR。

取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下觀察結(jié)果，若出現(xiàn)目的條帶，判定為陽性，反之為陰性。

2.3 二次PCR

以一次RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，使用對應(yīng)引物及利用相關(guān)擴(kuò)增條件，再次進(jìn)行PCR及瓊脂糖凝膠電泳，若出現(xiàn)目的條帶，判定陽性，反之陰性。

2.4 測序

選取一次RT-PCR、二次PCR均出現(xiàn)目的條帶的樣品，送至華大科技(武漢)單向測序，對獲得的序列進(jìn)行BLAST比對，使用Megalign分析序列間核苷酸同源性。

為測試二次PCR方法的穩(wěn)定性，了解不同核酸提取試劑盒的效率，將生工試劑盒更換為病毒RNA提取試劑盒(離心柱型)(購自北京天根，以下簡稱天根試劑盒)，在RNA溶解時根據(jù)說明書加入60 μL RNase-Free ddH2O，得到的cDNA溶液重復(fù)后續(xù)步驟，對所有拭子重復(fù)鑒定，觀察結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 一次RT-PCR鑒定結(jié)果

NP、M、HA擴(kuò)增的目的片段長度分別為329、1 080、640 bp。鑒定發(fā)現(xiàn)，12份預(yù)期陽性樣品僅有個別樣品(1、2、16)出現(xiàn)明顯目的條帶，部分樣品(6～9、17)偶爾出現(xiàn)極弱目的條帶(圖1)。

圖1 一次RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification results of the primary RT-PCR 注：M.DL2000 DNA Marker.1～21分別為樣品1～21的一次RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中，1～4、6～10、16～18為預(yù)期陽性樣品；5、11～15、19～21為預(yù)期陰性樣品；22～24分別為核酸提取陰性對照、RT-PCR陽性對照和RT-PCR陰性對照 Note：M，DL2000 DNA Marker.1-21 are the primary RT-PCR amplification results of sample 1-21.1-4，6-10 and 16-18 are expected positive samples，while 5，11-15 and 19-21 are expected negative.22-24 are negative control of nucleic acid extraction，positive control of RT-PCR，and negative control of RT-PCR，respectively

3.2 二次PCR鑒定結(jié)果

為便于觀察，將圖2二次PCR鑒定結(jié)果轉(zhuǎn)換為表1色塊模式。由圖2和表1可知：14份樣品(1、2、5、7、9、11～17、20、21)的6次結(jié)果均一致，與qPCR結(jié)果相符；4份樣品(3、4、6、8)至少2對引物、不少于4次結(jié)果重復(fù)為陽性，可判定為陽性，與qPCR結(jié)果相符；1份樣品(18)使用1對引物(NP)，經(jīng)2次試驗(核酸提取試劑盒不同)結(jié)果均為陽性，與qPCR結(jié)果相符，可能由引物特異性差異引起；2份樣品(10、19)使用生工試劑盒，結(jié)果與qPCR結(jié)果不符；但使用天根試劑盒，1對引物(10NP-2、19NP-2)鑒定結(jié)果與qPCR結(jié)果相符。

表1 二次PCR擴(kuò)增結(jié)果(色塊模式)

圖2 二次PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 Amplification results of the secondary PCR 注：M.DL2000 DAN Marker.1～21分別為樣品1～21的二次RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中，1～4、6～10、16～18為預(yù)期陽性樣品；5、11～15、19～21為預(yù)期陰性樣品；22～24分別為核酸提取陰性對照、RT-PCR陽性對照和RT-PCR陰性對照 Note：M，DL2000 DNA Marker.1-21 are the secondary RT-PCR amplification results of sample 1-21.1-4、6-10 and 16-18 are expected positive samples，while 5、11-15 and 19-21 are expected negative.22-24 are negative control of nucleic acid extraction，positive control of RT-PCR，and negative control of RT-PCR，respectively

RT-PCR方法靈敏度遠(yuǎn)低于qPCR，不考慮引物特異性，如1對引物出現(xiàn)陽性，暫判定為陽性?；诖?，使用天根試劑盒的21份樣品鑒定結(jié)果與qPCR結(jié)果符合率為100%(21/21)，使用生工試劑盒，樣品10、19鑒定結(jié)果與預(yù)期不符，符合率為90.48%(19/21)。

3.3 測序結(jié)果

單向測序得到6條NP基因部分片段序列，編號分別為016-1、16-1、02-2、016-2、2-2、16-2(一次RT-PCR產(chǎn)物編號為“01～021”，二次PCR產(chǎn)物編號為“1～21”，后綴“-1”表示樣品RNA使用生工試劑盒提取，后綴“-2”表示使用天根試劑盒提取，下同)，長度276～284 bp，經(jīng)BLAST比對，6條序列均為禽流感病毒內(nèi)部基因NP片段，與它們同源性最高(96.38%～97.40%)的毒株均為A/duck/Egypt/N13736E/2017(H5N8)。樣品2的2條(02-2、2-2)序列同源性為97.8%(圖3)，樣品16的4條序列(016-1、016-2、16-1、16-2)的同源性為96.4%～98.9%(圖3)。

圖3 NP基因部分片段序列同源性Fig.3 Sequence homologies of part NP gene fragments

單向測序得到15條M基因部分片段，編號分別為01-1、02-1、07-1、09-1、016-1、02-2、016-2、1-1、2-1、7-1、9-1、16-1、2-2、16-2和17-2，長度854～992 bp，經(jīng)BLAST比對，15條序列均為禽流感病毒內(nèi)部基因M片段，與其中13條序列同源性最高(98.05%～98.92%)的毒株為A/goose/Xinjiang/8.23_WLMQXL003-O/2017(mixed)，與其他2條(02-2、16-2)同源性最高(98.75%、98.34%)的毒株為A/goose/Xinjiang/12.18_WLMQXL 004-C/2016(H5N8)。

由圖4可知，樣品1、7、9的2條M序列的同源性分別為99.3%、98.5%、99.6%，樣品2和樣品16的4條M序列的同源性分別為99.3%～99.8%、99.0%～99.9%，可見二次PCR對內(nèi)部基因M測序影響較小。

圖4 M基因部分片段序列同源性Fig.4 Sequence homologies of part M gene fragments

單向測序得到13條HA基因部分片段，長度280～913 bp，與預(yù)期擴(kuò)增片段長度差別較大，但經(jīng)BLAST比對后，同源性最高的序列全部為禽流感病毒外部基因HA片段(表2)。

樣品1、2、16的4條序列的同源性分別為95.7%～98.9%、79.8%～98.8%、95.0%～99.8%(圖5)。同一份樣品，由于使用的RNA提取試劑盒和PCR次數(shù)不同，同源性最高的序列與同源性產(chǎn)生了較大區(qū)別(表2、圖5)。

表2 HA基因BLAST比對結(jié)果

圖5 HA基因部分片段序列同源性Fig.5 Sequence homologies of part HA gene fragments

4 分析與討論

在各種病原鑒定方法中，常規(guī)病原分離鑒定和血清學(xué)鑒別方法雖較準(zhǔn)確，但消耗時間長、對實驗室生物安全級別要求高；qPCR方法靈敏度高、鑒定時間短，但設(shè)備昂貴，對操作人員的專業(yè)和實驗技能要求高。本研究針對鳥類樣品禽流感病毒核酸檢測建立了二次PCR方法，即以一次RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行二次PCR檢測的方法。試驗中，一次擴(kuò)增未出現(xiàn)或疑似出現(xiàn)目的條帶的樣品，經(jīng)二次擴(kuò)增后部分樣品仍可出現(xiàn)明顯的目的條帶，依據(jù)二次擴(kuò)增出現(xiàn)目的條帶情況判定最終結(jié)果。

試驗證明，12份預(yù)期陽性樣品經(jīng)二次PCR后均可成功鑒定，而一次RT-PCR最多成功鑒定出8份(其中5份條帶均較弱，具有偶然性)，僅3份結(jié)果較為穩(wěn)定，與二次PCR陽性判定結(jié)果(10～11份)差別較大，為提高檢測的準(zhǔn)確度，應(yīng)進(jìn)行二次PCR擴(kuò)增。二次PCR與qPCR檢測結(jié)果比較，符合率為90.48%～100.00%，可以認(rèn)為二者在特異性和敏感性上并無明顯差異。因此，采用二次PCR方法進(jìn)行鳥類禽流感疫情應(yīng)急檢測，可以較好地滿足對檢測方法特異性和敏感性的要求，同時，能避免因?qū)嶒炇摇x器設(shè)備和人員配置等條件不足的限制，具有應(yīng)用價值及可操作性。鑒于我國野生動物疫病檢測實際情況，該方法的建立有助于在鳥類出現(xiàn)異常情況時和疫情應(yīng)急處置中，初步、快速鑒定禽流感，為鳥類流感監(jiān)測預(yù)警提供有效的技術(shù)支持，這對于提升我國野生動物疫源疫病的監(jiān)測和防控能力具有重要的現(xiàn)實意義。

對HA引物擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，可初步鑒定病毒HA亞型。測序情況表明，二次PCR方法對內(nèi)部基因(M)測序結(jié)果影響較小，但對外部基因(HA)影響較大。本研究采用的樣品均是在鳥類出現(xiàn)異常情況時采集的咽拭，樣品帶毒率較高，檢測效果良好，可進(jìn)一步將該方法用于主動監(jiān)測中，探索在健康個體拭子、日常糞便或組織樣品檢測中的使用效果。

致謝：感謝東北林業(yè)大學(xué)野生動物與自然保護(hù)地學(xué)院提供技術(shù)支持，感謝中國科學(xué)院武漢病毒研究所流感病毒學(xué)科組陳全姣研究員團(tuán)隊提供樣品檢測報告。