何佳璘，楊麗雅，郭一鳴，亓明康，王含必，王慧萍*

(1.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100730；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院婦科內(nèi)分泌與生殖中心，國家婦產(chǎn)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100730；3. 國家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所，國家衛(wèi)健委生殖健康工程技術(shù)研究中心，北京 100081)

早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)是指女性在40歲之前卵巢活動(dòng)衰退的臨床綜合征，以月經(jīng)異常(如閉經(jīng)或稀發(fā)月經(jīng))伴有高促性腺激素(FSH>25 U/L)和低雌激素為特征[1-2]。POI患者較正常女性有更高的心血管疾病發(fā)生率、骨質(zhì)疏松和骨折風(fēng)險(xiǎn)，且更容易出現(xiàn)認(rèn)知功能的下降。隨著現(xiàn)代女性生活工作壓力的增加，近年來POI的發(fā)病率呈逐年增高的趨勢，據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，POI的發(fā)病率已由1986年的1%增長到2014年的3.6%[3-4]。POI的病因主要有遺傳性因素、醫(yī)源性因素、環(huán)境因素、心理因素和免疫因素等[5]。目前最主要的治療方法是激素補(bǔ)充治療，但是因其有增加乳腺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)等副作用應(yīng)用受限。中藥作為一種相對安全有效的藥物，為POI提供了另一種治療選擇。金匱腎氣丸記載于張仲景的《金匱要略方論》，主要組成為：附子、桂枝、熟地黃、山藥、山茱萸、茯苓、牡丹皮、澤瀉。金匱腎氣丸補(bǔ)腎化氣，滋腎陰，溫腎陽，臨床有時(shí)用于治療女性月經(jīng)紊亂。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接技術(shù)[6-7]，探討金匱腎氣丸治療POI的潛在藥物作用機(jī)制，為尋找POI新的治療方法提供參考。

材料與方法

一、金匱腎氣丸活性成分與潛在靶點(diǎn)的收集與篩選

使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)(TCMSP)，以類藥性(DL)≥0.18、口服吸收利用度(OB)≥30%為金匱腎氣丸中各味藥材活性成分的篩選條件，這兩個(gè)條件是評價(jià)ADME特征(吸收、分布、代謝和排泄)最重要的指標(biāo)，通過篩選，得到金匱腎氣丸的活性成分。從pubchem網(wǎng)站中獲取活性成分化合物的簡化分子線性輸入系統(tǒng)號(hào)(SMILES)，并基于化學(xué)相似性原理利用SwissTargetPrediction[8]和SEA數(shù)據(jù)庫[9]預(yù)測藥物靶點(diǎn)。

二、POI靶點(diǎn)篩選

與POI相關(guān)的基因通過關(guān)鍵詞“premature ovarian insufficiency”從公共數(shù)據(jù)庫中檢索下載，包括在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM)、Drugbank數(shù)據(jù)庫和人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards)，并進(jìn)行已有文本挖掘。

三、金匱腎氣丸治療POI關(guān)鍵靶點(diǎn)的分析

將活性成分預(yù)測靶點(diǎn)與POI的靶基因整合并取交集，得到金匱腎氣丸治療POI的潛在靶點(diǎn)，將所有潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，得到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)。將所有潛在靶點(diǎn)上傳到Metascape數(shù)據(jù)庫[10]中，進(jìn)行基因本體論(GO)和京都基因和基因組百科全書(KEGG)富集分析。GO分析包括生物學(xué)功能分析、分子功能分析和細(xì)胞成分分析，KEGG分析可得到金匱腎氣丸治療POI的主要通路；結(jié)果均以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

四、網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建金匱腎氣丸各藥材-活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)；并使用NetworkAnalyzer計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析。

五、分子對接

將篩選后的關(guān)鍵活性成分和核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，從pubchem數(shù)據(jù)庫中查詢篩選出的關(guān)鍵活性成分的3D結(jié)構(gòu)，從PDB數(shù)據(jù)庫中下載篩選出核心靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)，使用Pymol軟件對蛋白去水去配體加氫，導(dǎo)入Autodock軟件中進(jìn)行對接尋找最佳對接位點(diǎn)，并將最佳構(gòu)象導(dǎo)入Pymol進(jìn)行可視化處理。

結(jié) 果

一、金匱腎氣丸活性成分與靶標(biāo)預(yù)測結(jié)果

在TCMSP數(shù)據(jù)庫中共檢索出金匱腎氣丸活性成分102個(gè)，包括茯苓活性成分15個(gè)，附子活性成分21個(gè)，桂枝活性成分7個(gè)，牡丹皮活性成分11個(gè)，山藥活性成分16個(gè)，山茱萸活性成分20個(gè)，熟地黃活性成分2個(gè)，澤瀉活性成分10個(gè)。在SwissTargetPrediction、SEA數(shù)據(jù)庫中共預(yù)測出茯苓活性成分潛在靶點(diǎn)143個(gè)，附子活性成分潛在靶點(diǎn)275個(gè)，桂枝活性成分潛在靶點(diǎn)62個(gè)，牡丹皮活性成分潛在靶點(diǎn)157個(gè)，山藥活性成分潛在靶點(diǎn)208個(gè)，山茱萸活性成分潛在靶點(diǎn)247個(gè)，熟地黃活性成分潛在靶點(diǎn)42個(gè)，澤瀉活性成分潛在靶點(diǎn)191個(gè)，整理后得到金匱腎氣丸潛在靶點(diǎn)432個(gè)。

二、POI靶點(diǎn)和潛在治療靶點(diǎn)篩選

從Drugbank、GeneCards、OMIM中檢索POI，并進(jìn)行相關(guān)文獻(xiàn)文本挖掘，共得到POI相關(guān)靶點(diǎn)4 867個(gè)，將其中以相關(guān)性分?jǐn)?shù)>25分為條件篩選得到的279個(gè)靶點(diǎn)與金匱腎氣丸潛在靶點(diǎn)整理取交集后得到金匱腎氣丸治療POI的潛在靶點(diǎn)82個(gè)(圖1)。

圖1 金匱腎氣丸各味藥材治療POI潛在靶點(diǎn)Upset圖

三、GO和KEGG富集分析結(jié)果

將篩選得到的金匱腎氣丸治療POI的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行GO和KEGG分析，最終得到1 805條GO條目和263條KEGG條目，其中得到1 636條生物過程條目，主要富集在正向調(diào)整激酶活性、腺體發(fā)育、細(xì)胞對激素刺激的反應(yīng)、生殖結(jié)構(gòu)的發(fā)育等方面；62條細(xì)胞組分條目，主要富集在受體復(fù)合物、膜筏、轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物等方面；107條分子功能條目，主要富集在蛋白激酶活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、核受體活性等方面；263條通路條目，主要富集在磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)、腫瘤轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白53(P53)、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)等信號(hào)通路上。按照顯著水平P值從小到大排列，GO分析結(jié)果分別選取生物過程、細(xì)胞組分、分子功能前10條繪制柱狀圖(圖2)，KEGG分析結(jié)果選取前20條繪制氣泡圖(圖3)。

BP：生物過程；CC：細(xì)胞組分；MF：分子功能。圖2 金匱腎氣丸治療POI潛在靶點(diǎn)GO富集分析

圖3 金匱腎氣丸治療POI潛在靶點(diǎn)KEGG富集分析

四、金匱腎氣丸治療POI潛在靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?/h3>

使用cytoscape3.7.2軟件構(gòu)建金匱腎氣丸各藥材-活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(圖4)，其中紅色節(jié)點(diǎn)為金匱腎氣丸藥材成分如茯苓、附子等，黃色節(jié)點(diǎn)為金匱腎氣丸藥材活性成分如胡椒堿、薯蕷皂苷元等，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)為金匱腎氣丸治療POI的潛在活性靶點(diǎn)如雌激素受體等。將獲得的金匱腎氣丸治療POI的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中，并將交互信息繪制蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(PPI圖，圖5)，利用NetworkAnalyzer進(jìn)行兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，計(jì)算得到網(wǎng)絡(luò)中平均最短路徑、介數(shù)和自由度。具有較小平均最短路徑、較大介數(shù)或較大自由度的節(jié)點(diǎn)視為網(wǎng)絡(luò)中的重要靶點(diǎn)，圖5中節(jié)點(diǎn)顏色隨自由度值變化，顏色越紅節(jié)點(diǎn)越重要。為綜合考慮平均最短路徑和介數(shù)，引入R值用于評估靶點(diǎn)的重要性，R值越小靶點(diǎn)越重要(表1)。最終確定PPI網(wǎng)絡(luò)(圖5)中R值越小且自由度為平均自由度2倍以上的蛋白靶點(diǎn)：雌激素受體α(ESR1)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(AKT1)為核心蛋白靶點(diǎn)；藥材-活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)(圖4)中自由度為平均自由度2倍以上的靶點(diǎn)：薯蕷皂苷元、澤瀉醇B、羥基芫花素、去氧穿心蓮內(nèi)酯、胡椒堿、槲皮素為核心活性成分靶點(diǎn)。

圖4 金匱腎氣丸藥材-活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

圖5 金匱腎氣丸治療POI潛在靶點(diǎn)PPI圖

續(xù)表

續(xù)表

五、分子對接結(jié)果

利用分子對接技術(shù)對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，將網(wǎng)絡(luò)中篩選出的金匱腎氣丸治療POI的核心活性成分和核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，結(jié)合能越低則核心活性成分與核心靶點(diǎn)的結(jié)合力越強(qiáng)，一般認(rèn)為結(jié)合能≤-5.0 KJ/mol的核心活性成分與蛋白分子結(jié)合較好。根據(jù)結(jié)合能繪制熱圖(圖6)，顏色越深表示結(jié)合能越低、結(jié)合力越強(qiáng)。將結(jié)合能≤-5.0 KJ/mol的構(gòu)象進(jìn)行可視化(圖7)，結(jié)果顯示薯蕷皂苷元與ESR1、VEGFA、AKT1，澤瀉醇B與ESR1、AKT1，羥基芫花素與ESR1，胡椒堿與ESR1具有較強(qiáng)的結(jié)合力。

圖6 金匱腎氣丸治療POI的核心活性成分和核心靶點(diǎn)結(jié)合能熱圖

圖7 金匱腎氣丸治療POI的核心活性成分與核心靶點(diǎn)的分子對接圖

討 論

目前POI的治療包括激素替代治療、干細(xì)胞移植、中藥治療等多種方式，對于緩解癥狀有一定效果，但仍存在一定的局限性。以激素替代治療為例，該治療方法除了可能增加乳腺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)外，還存在多種應(yīng)用禁忌證和慎用情況，如惡性腫瘤、血栓性疾病、子宮肌瘤、內(nèi)膜增生和糖尿病、高血壓、肝功能障礙等；且目前仍缺乏其對POI患者死亡率影響的長期前瞻性研究。而干細(xì)胞治療、中醫(yī)藥方法則存在療效不確切、沒有規(guī)模性研究數(shù)據(jù)證實(shí)的問題，因此，探索POI更有效的治療方法具有重要的意義。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以系統(tǒng)生物學(xué)理論為基礎(chǔ)對生物系統(tǒng)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，選取特定信號(hào)節(jié)點(diǎn)開展多靶點(diǎn)藥物分子設(shè)計(jì)、系統(tǒng)闡述機(jī)體與藥物相互作用的原理和規(guī)律。它從“一標(biāo)一靶”模式向“多靶點(diǎn)、多組分”模式轉(zhuǎn)變的特點(diǎn)與復(fù)雜疾病涉及到機(jī)體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中多個(gè)基因和信號(hào)通路的特點(diǎn)相吻合，其系統(tǒng)性和廣泛性的視角，在揭示復(fù)雜配方的內(nèi)在機(jī)制方面具有優(yōu)勢。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已經(jīng)從篩選中藥中的有效成分發(fā)展到揭示中藥組分治療疾病的相關(guān)途徑及靶點(diǎn)、剖析方劑配伍規(guī)律以探討更為科學(xué)的方劑可能性，在新藥研發(fā)和現(xiàn)有藥物的再利用中具有極大的價(jià)值[11]。

金匱腎氣丸，最早出自《金匱要略》，有“補(bǔ)腎諸方之祖”之稱，由茯苓、附子、桂枝、牡丹皮、山藥、山茱萸、熟地黃、澤瀉組成，廣泛應(yīng)用于生殖功能減退、弱精子癥等生殖系統(tǒng)疾病[12]。金匱腎氣丸可通過調(diào)節(jié)雌二醇(E2)等激素水平改善腎陽虧虛狀態(tài)[13]，臨床上常用于治療內(nèi)分泌失調(diào)等POI相關(guān)癥狀。受生殖系統(tǒng)和中藥本身特點(diǎn)的限制，生殖相關(guān)疾病的中藥應(yīng)用發(fā)展緩慢，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的引入，有助于探索潛在的藥物新靶點(diǎn)和相關(guān)信號(hào)通路，進(jìn)一步了解藥物作用機(jī)制[11]。目前，有學(xué)者通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對歸腎丸、左歸丸等治療POI的機(jī)制進(jìn)行研究[14-15]，但尚未檢索到應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討金匱腎氣丸治療POI相關(guān)機(jī)制的研究。因此，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，通過數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)結(jié)構(gòu)分析，預(yù)測金匱腎氣丸治療POI的作用機(jī)制，為進(jìn)一步尋找治療POI的新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)篩選后得到金匱腎氣丸治療POI的潛在靶點(diǎn)82個(gè)，選取金匱腎氣丸藥材-活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)自由度為平均自由度2倍以上的活性成分為核心成分，即治療POI的核心活性成分包括薯蕷皂苷元、澤瀉醇B、羥基芫花素、去氧穿心蓮內(nèi)酯、胡椒堿、槲皮素。選取PPI網(wǎng)絡(luò)圖中R值靠前且網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)自由度為平均自由度2倍以上的節(jié)點(diǎn)為核心靶點(diǎn)，即ESR1、VEGFA、AKT1為核心靶點(diǎn)。

薯蕷皂苷元是一種植物甾體皂苷元，與雌激素有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)相似性，可促進(jìn)性激素、皮質(zhì)激素等甾體類激素的生物合成[16]。羥基芫花素具有抗氧化作用[17]，去氧穿心蓮內(nèi)酯和胡椒堿具有抗炎和氧化應(yīng)激作用[18-19]。槲皮素能在一定程度上促進(jìn)各級卵泡發(fā)育，增加雌激素分泌，改善卵巢功能[20]；還可以提高卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量，影響顆粒細(xì)胞的增殖和凋亡，降低氧化應(yīng)激[21]。ESR1主要在卵泡膜上表達(dá)，與雌激素結(jié)合發(fā)揮相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)。VEGFA是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)家族中的一員，卵巢濾泡的發(fā)育依賴血管生成，尤其是VEGF驅(qū)動(dòng)的血管生長。有研究表明，VEGFA亞型的平衡控制著卵泡的進(jìn)展和黃體生成，亞型的表達(dá)還可以調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的生育能力[22]。AKT1是PI3K-Akt通路的重要蛋白分子，有研究表明AKT過度活化后會(huì)導(dǎo)致原始卵泡過度活化和POI[23]。

富集分析結(jié)果表明，金匱腎氣丸治療POI的機(jī)制可能與PI3K-Akt、MAPK、HIF-1、P53、PPAR、TGF-β等信號(hào)通路，正向調(diào)整激酶活性、腺體發(fā)育、細(xì)胞對激素刺激的反應(yīng)、生殖結(jié)構(gòu)的發(fā)育等生物過程相關(guān)。其中，PI3K-Akt信號(hào)通路作為POI相關(guān)信號(hào)通路被廣泛研究，其下游的信號(hào)分子中，叉頭轉(zhuǎn)錄因子O3(FoxO3a)在卵泡生長的初始階段能抑制卵泡活化，F(xiàn)oxO3a基因敲除小鼠因整體卵泡激活導(dǎo)致卵母細(xì)胞死亡、早期功能性卵泡衰竭和繼發(fā)性不孕[24]。哺乳動(dòng)物中雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的活性升高會(huì)激活原始卵泡池，從而導(dǎo)致早期卵泡衰竭，引起POI[25]。還有研究表明，AKT激酶可以調(diào)節(jié)天然免疫細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞)的發(fā)育和功能[26]。MAPK通路可能參與調(diào)控卵巢顆粒細(xì)胞的細(xì)胞周期、增殖和凋亡等過程[27]。HIF-1α的表達(dá)量能反應(yīng)卵巢儲(chǔ)備功能，是POI的預(yù)測指標(biāo)之一[28]。P53信號(hào)通路的激活可能誘導(dǎo)卵巢組織的凋亡，最終導(dǎo)致POI[29]。PPAR信號(hào)通路可能與卵泡發(fā)育和調(diào)節(jié)雌激素分泌有關(guān)[30]。TGF-β信號(hào)通路能增強(qiáng)FSH刺激的孕酮生成和黃體生成素受體表達(dá)，從而促進(jìn)卵泡存活[31]。正常卵巢功能的維持是一個(gè)復(fù)雜的過程，上述信號(hào)通路在其中均發(fā)揮重要作用，然而通路與通路之間的關(guān)聯(lián)、核心的啟動(dòng)因子尚未研究明確。

我們將篩選出的金匱腎氣丸中的核心活性成分和POI發(fā)病的核心靶點(diǎn)分別進(jìn)行分子對接，進(jìn)一步驗(yàn)證兩者的結(jié)合活性，結(jié)果顯示，薯蕷皂苷元與ESR1、VEGFA、AKT1，澤瀉醇B與ESR1、AKT1，羥基芫花素與ESR1，胡椒堿和ESR1具有較強(qiáng)的結(jié)合力。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)預(yù)測金匱腎氣丸治療POI的作用機(jī)制，結(jié)果顯示金匱腎氣丸中的薯蕷皂苷元、澤瀉醇B、羥基芫花素、去氧穿心蓮內(nèi)酯、胡椒堿、槲皮素等核心活性成分可能作用于ESR1、VEGFA、AKT1等核心靶點(diǎn)，通過PI3K-Akt、MAPK、HIF-1等信號(hào)通路介導(dǎo)細(xì)胞生長、增殖、分化、衰老和凋亡，通過抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)激素合成與分泌等作用發(fā)揮治療作用。但是本研究目前還處在理論層面的預(yù)測階段，接下來還需進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以期為POI的中藥治療提供更多參考。