孫镠佳，陳田，丁慧敏，項雨，葛紅山

(1.南京中醫(yī)藥大學，南京 210000；2.泰州市人民醫(yī)院，泰州 225300)

鄰苯二甲酸(2-乙基己基)二酯[di(2-ethylhexyl)phthalate，DEHP]作為一種常見的增塑劑，能有效提高塑料制品的延展性和柔韌度，因而被廣泛應用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)療、食品、玩具、建筑等各個領域[1-2]。由于它通常以不牢固的氫鍵與范德華力與塑料基底相連接，在高溫或與疏水材料接觸時極易擴散至大氣、土壤和水體等環(huán)境介質(zhì)，因此極易導致人群廣泛暴露，最終經(jīng)多種途徑蓄積在生物體內(nèi)[3-4]。隨著環(huán)境檢出率和人群暴露水平的不斷增高，DEHP帶來的生態(tài)環(huán)境污染和人類健康問題日益受到世界各國的廣泛重視?，F(xiàn)有研究顯示，DEHP及其相關代謝物可引起生殖和發(fā)育毒性[5-6]、神經(jīng)毒性[7]、肝毒性[8]、腎毒性[9]、肺毒性[10]、致癌性[11]等多種機體損傷。其中，DEHP對生殖系統(tǒng)的影響，尤其是對雄性生殖的損傷備受關注。目前，已有大量體內(nèi)外研究對DEHP暴露所致雄性生殖損傷的機制進行探索，主要觀點包括通過干擾下丘腦-垂體-性腺(HPT)軸影響性激素的分泌和調(diào)控[12]，破壞機體氧化和抗氧化系統(tǒng)誘導氧化應激[13]等，但結論尚未明確。有研究表明，鐵過載[14]、氧化應激[15]均為誘導雄性生殖損傷的重要機制，而鐵代謝紊亂、脂質(zhì)過氧化、谷胱甘肽代謝異常又是鐵死亡的主要分子調(diào)控機制[16]?；诖?，本研究通過不同劑量 DEHP對青春期雄性小鼠進行染毒，觀察其對雄性生殖系統(tǒng)的影響，并進一步探究鐵死亡與DEHP誘導的雄性生殖損傷之間是否存在相關性。

材料與方法

一、實驗動物和材料

1.實驗動物：健康普通級4周齡ICR雄性小鼠24只，購自揚州大學動物實驗中心，動物許可證號為SCXK(蘇)2017-0007。動物實驗室保持溫度(25±1)℃，濕度(60±10)%，光照與黑暗時長比為12 h∶12 h，自由飲水和攝食。

2.主要試劑與儀器：DEHP(上海麥克林生化)，組織鐵測定試劑盒(南京建成生物)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物)。β-actin兔單克隆抗體(4970，Cell Signaling Technology，美國)，轉鐵蛋白(Tf)兔單克隆抗體(T55396，上海艾比瑪特)，轉鐵蛋白受體1(TfR1)兔單克隆抗體(T56618，上海艾比瑪特)，鐵蛋白重鏈1(FTH1)兔單克隆抗體(T55648，上海艾比瑪特)，核因子E2相關因子(Nrf2)兔單克隆抗體(ab62352，Abcam，美國)，谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)兔單克隆抗體(ab125066，Abcam，美國)，溶質(zhì)載體家族7成員11(SLC7A11)兔多克隆抗體(ab37185，Abcam，美國)，辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔二抗(武漢愛博泰克)。全波段多功能酶標儀(BioTek，美國)，低溫超速離心機(Thermo，美國)，XD-202倒置生物顯微鏡(南京江南永新光學)，超聲破碎儀(Newtown CT，美國)。

二、實驗方法

1.動物分組及染毒：24只雄性ICR小鼠經(jīng)適應性喂養(yǎng)1周后，按體重隨機分為4組，每組6只。參照之前文獻方法[17]，以玉米油為溶劑，分別對各實驗組小鼠給予0.5、50、500 mg/kg的DEHP灌胃染毒(分別為0.5 mg/kg組、50 mg/kg組和500 mg/kg組)，對照組以同劑量玉米油灌胃，1次/d，連續(xù)35 d。每天觀察小鼠一般狀態(tài)，每周記錄體重1次。于最后一次灌胃24 h后處死小鼠，記錄終體重。

3.精子數(shù)量及活力測定：處死小鼠后解剖得到雙側附睪，快速稱重后置于37℃預熱的1 ml生理鹽水中剪碎，繼續(xù)37℃水浴5 min，吸管吹打30次制成精子懸液，將濾液滴入精子計數(shù)板進行計數(shù)。每個樣本觀察3個視野，評估每只小鼠的附睪精子活力。參照文獻方法[18]將精子活動力分為4級：Ⅰ級呈快速直線向前運動，表示精子活動極好；Ⅱ級直線向前運動，表示精子活動較好；Ⅲ級只向前曲線運動，表示精子活動力一般；Ⅳ級只在原地蠕動，表示精子活動能力差。

4.石蠟組織切片及HE染色：新鮮睪丸組織用4%多聚甲醛固定24 h，經(jīng)常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋后制成組織切片。HE染色后于光鏡下觀察各組睪丸組織形態(tài)學改變。

5.睪丸組織鐵含量測定：準確稱取睪丸組織重量，按重量(g)∶體積(ml)=1∶9的比例加入生理鹽水，冰水浴條件下進行機械勻漿，4℃溫度下2 500 r/min離心10 min后取上清液。按組織鐵測定試劑盒說明書操作后用酶標儀于波長520 nm下測定樣品OD值，計算各組睪丸組織的鐵含量。

6. 蛋白免疫印跡法(WB)測定鐵代謝相關蛋白及鐵死亡相關蛋白的表達水平：取各組睪丸組織，用蛋白裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)裂解后進行超聲勻漿及低溫離心，提取總蛋白。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定各組蛋白濃度，以40 μg蛋白上樣量進行SDS-PAGE電泳(濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%)，將目的蛋白分離并轉至PVDF膜(Millipore，美國)。室溫下用快速封閉液(蘇州新賽美生物)封閉10 min，分別加入一抗(Tf、TfR1、FTH1、Nrf2、GPX4、SLC7A11、β-actin)，4℃搖床孵育過夜。次日回收一抗，洗膜3次后加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗，室溫搖床孵育2 h，洗膜3次后通過特超敏ECL化學發(fā)光試劑盒(上海碧云天生物)曝光顯影。以目的蛋白和內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值與對照組比較表示目的蛋白的相對表達水平。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、DEHP對小鼠體重、睪丸重量及臟器系數(shù)的影響

DEHP 染毒后，各組小鼠一般情況尚可，均未見明顯異常癥狀。隨著染毒劑量增加，小鼠的染毒后體重及增重量均呈下降趨勢，其中50 mg/kg組的增重量、500 mg/kg 組的染毒后體重及增重量均顯著低于對照組(P均<0.01)；睪丸濕重隨著DEHP染毒劑量增加亦呈下降趨勢，其中500 mg/kg組顯著低于對照組(P<0.01)；各組睪丸臟器系數(shù)與對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 DEHP暴露對小鼠體重、睪丸濕重及臟器系數(shù)的影響[(-±s)，% ]

二、DEHP對小鼠精子數(shù)量及質(zhì)量的影響

與對照組比較，0.5 mg/kg組、50 mg/kg組小鼠附睪精子數(shù)量及活力均呈下降趨勢，但尚無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；500 mg/kg組小鼠附睪精子數(shù)量及精子活力等級均顯著下降(P<0.05)(表2)。

三、DEHP對小鼠睪丸組織形態(tài)學的影響

光鏡下可見對照組睪丸精曲小管排列整齊，層次清楚，結構正常，生精上皮基膜外側可見梭形肌樣細胞精原細胞分布，近腔側可見各級生精細胞依次排列，腔內(nèi)可見成熟精子(圖1 A)；0.5 mg/kg組睪丸精曲小管排列規(guī)則，多層生精細胞正常分布，與對照組未見明顯差別(圖1 B)；50 mg/kg組睪丸精曲小管外形尚規(guī)則，但見生精上皮層次減少，排列紊亂，部分生精細胞有脫落現(xiàn)象(圖1 C)；500 mg/kg組睪丸曲精小管形狀不規(guī)則，生精上皮嚴重損傷，層次明顯減少，生精細胞排列疏松紊亂，部分細胞脫落游離于管腔(圖1 D)。提示DEHP導致了小鼠睪丸組織的損傷。

表2 DEHP暴露對小鼠精子數(shù)量及質(zhì)量的影響[(-±s)，n(%)]

A：對照組；B：0.5 mg/kg組；C：50 mg/kg組；D：500 mg/kg組。圖1 各組小鼠睪丸的形態(tài)學觀察(HE染色，×400)

四、DEHP對小鼠睪丸組織鐵含量的影響

與對照組比較，0.5 mg/kg組、50 mg/kg組小鼠睪丸勻漿中鐵含量均未見明顯差異(P均>0.05)，而500 mg/kg組小鼠睪丸組織鐵含量顯著增加(P<0.05)(圖2)。

注：與對照組比較，*P<0.05。圖2 各組小鼠睪丸組織總鐵含量比較

五、DEHP對小鼠睪丸鐵代謝相關蛋白表達水平的影響

與對照組比較，0.5 mg/kg組、50 mg/kg組小鼠睪丸中的Tf、TfR1及FTH1蛋白表達差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，500 mg/kg組小鼠睪丸中Tf、TfR1的蛋白表達水平均顯著上調(diào)，F(xiàn)TH1的表達水平顯著下降(P<0.05)(圖3)。

六、DEHP對小鼠睪丸鐵死亡相關蛋白表達水平的影響

與對照組比較，0.5 mg/kg組、50 mg/kg組小鼠睪丸中的Nrf2、GPX4及SLC7A11蛋白表達水平均無顯著性差異(P均>0.05)；而500 mg/kg組小鼠睪丸中Nrf2、GPX4及SLC7A11蛋白表達水平顯著下降(P<0.05)(圖4)。

A：WB法檢測小鼠睪丸鐵代謝相關蛋白表達；B：Tf蛋白相對表達量；C：TfR1蛋白相對表達量；D：FTH1蛋白相對表達量。與對照組比較，*P<0.05。圖3 小鼠睪丸鐵代謝相關蛋白表達水平

A：WB法檢測鐵死亡相關蛋白的表達；B：Nrf2蛋白相對表達量；C：GPX4蛋白相對表達量；D：SLC7A11蛋白相對表達量。與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖4 小鼠睪丸鐵死亡相關蛋白表達水平

討 論

DEHP是目前使用最廣泛的鄰苯二甲酸酯類增塑劑之一，作為一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，其對雄性生殖系統(tǒng)的毒性作用日益受到人們關注。研究表明，DEHP誘導的睪丸損傷是其雄性生殖毒性的主要病理學基礎[19]。睪丸是雄性生殖系統(tǒng)最重要的器官之一，具有合成雄性激素、產(chǎn)生分泌精子等功能，對維持雄性生殖能力至關重要。有研究顯示，母體妊娠期及哺乳期的DEHP暴露可能造成雄性子代附屬生殖結構的發(fā)育不良、性激素的異常和睪丸質(zhì)量的下降[20-22]，而青春期接觸DEHP則可能直接或間接導致雄性大鼠睪丸形態(tài)學改變，精子濃度和質(zhì)量下降以及血清睪丸激素水平的降低[23]。本研究通過給予實驗組0.5、50或500 mg/kg劑量的DEHP建立染毒模型，對青春期短期暴露于不同劑量DEHP所導致的雄性生殖損傷進行討論。本研究結果顯示，雄性小鼠經(jīng)DEHP染毒后體重和睪丸質(zhì)量出現(xiàn)下降趨勢，尤其是高劑量(500 mg/kg)DEHP暴露造成雄性小鼠體重及睪丸重量的明顯下降。此外，中、高劑量的DEHP可以誘導小鼠睪丸出現(xiàn)精曲小管結構紊亂、生精上皮變薄等組織病理學改變，精子數(shù)量和質(zhì)量的下降也符合上述結果。然而，對于低劑量(0.5 mg/kg)DEHP組，上述改變均不明顯。以上結果表明，DEHP染毒可以造成睪丸結構及功能的損傷，但可能只有當DEHP劑量足夠大時，這一毒性作用才比較明顯。

鐵死亡(Ferroptosis)是一種鐵依賴的非凋亡形式的程序性細胞死亡，以脂質(zhì)過氧化物的鐵依賴性積累為特征，最早由Dixon 等[24]于2012年提出。鐵是體內(nèi)一種具有氧化還原活性的必需微量元素，對維持細胞穩(wěn)態(tài)具有重要作用。循環(huán)中的鐵主要以三價鐵離子形式存在，并通過與Tf結合經(jīng)TfR1進入細胞。進入細胞內(nèi)的鐵離子還原為二價鐵離子后釋放到細胞質(zhì)的鐵池發(fā)揮作用，過量的鐵則儲存在鐵蛋白(FTL、FTH1)中[25]。據(jù)研究表明，鐵積累是鐵死亡發(fā)生的必要條件[26]，鐵死亡過程可能伴隨Tf、TfR的升高和鐵蛋白的異常改變。本研究中，高劑量(500 mg/kg)DEHP染毒誘導睪丸組織鐵含量上升，表明DEHP對睪丸鐵穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生了影響。進一步對鐵代謝相關蛋白進行檢測，發(fā)現(xiàn)500 mg/kg劑量DEHP染毒上調(diào)了睪丸組織中Tf、TfR1的蛋白表達水平，而下調(diào)了FTH1的表達，通過增加鐵攝入、減少鐵儲存使游離Fe2+在細胞內(nèi)蓄積。以上結果說明，DEHP染毒可能通過調(diào)節(jié)睪丸鐵代謝蛋白引起鐵代謝異常。

GPX4途徑是鐵死亡調(diào)控的另一重要途徑。GPX4是細胞內(nèi)最重要的抗脂質(zhì)過氧化酶，已被證實是鐵死亡的一種負調(diào)控因子[27]。GPX4在還原型谷胱甘肽(GSH)的協(xié)同作用下將脂質(zhì)過氧化物轉化為無毒醇類[28]，因此，GSH的耗竭會導致GPX4失活，從而增加細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化作用，導致鐵死亡的發(fā)生。此外，合成GSH的原料胱氨酸和谷氨酸通過以SLC7A11為主要組成的System Xc-從胞外攝取[29-30]，而Nrf2對SLC7A11水平具有調(diào)節(jié)作用[31]。因此，System Xc-系統(tǒng)抑制、GPX4活性抑制，均為細胞鐵死亡的重要條件。本研究結果顯示，500 mg/kg組Nrf2及SLC7A11蛋白表達水平均顯著下降，說明System Xc-系統(tǒng)可能被抑制，GSH合成受阻；同時，GPX4蛋白表達水平亦顯著下降，脂質(zhì)過氧化物清除過程被抑制，可能協(xié)同誘導鐵死亡的發(fā)生。

綜上所述，本研究就DEHP對雄性生殖毒性及其可能機制進行了初步研究及闡述，結果表明，青春期DEHP暴露能夠?qū)е滦∈蟪霈F(xiàn)睪丸組織損傷、生精功能障礙。高劑量染毒小鼠的睪丸組織細胞出現(xiàn)鐵死亡的相關變化：鐵代謝異常及鐵死亡調(diào)控基因的異常表達等，提示鐵死亡可能參與了DEHP暴露誘導雄性生殖損傷的病理過程，為DEHP的生殖毒性機制研究開拓了新思路。但本研究各項指標僅限于睪丸水平，缺乏線粒體水平數(shù)據(jù)；且實驗僅涉及鐵死亡部分相關指標，具有一定局限性，對其研究有待進一步深入和完善。