蔣寒宇，顧文文，王健，2

(1.復旦大學藥學院，上海 201203；2.上海市生物醫(yī)藥技術研究院，上海 200032)

泛素是一種由76個氨基酸殘基組成的蛋白質，具有緊湊的β-折疊結構和松散的羧基端尾部，最重要的特征是位于其氨基端的甲硫氨酸殘基和7個賴氨酸殘基(K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63)，這些氨基酸殘基均可在不同泛素分子間進行連接，從而行使功能。泛素化過程由泛素激活酶E1、泛素結合酶E2和泛素連接酶E3組成的三級酶聯反應催化完成。首先，泛素激活酶E1通過其自身活性位點上的半胱氨酸殘基與泛素羧基端甘氨酸殘基以硫酯鍵結合；之后，與泛素連接的泛素激活酶E1可招募泛素結合酶E2，并經泛素結合酶E2催化后，泛素由泛素激活酶E1轉移到泛素結合酶E2的半胱氨酸殘基上，同樣以硫酯鍵結合；再后，在具有蛋白質識別功能的泛素連接酶E3催化下，結合了泛素結合酶E2的泛素甘氨酸殘基與靶蛋白的賴氨酸殘基以異肽鍵共價連接，靶蛋白被泛素化修飾。泛素、泛素激活酶E1、泛素結合酶E2、泛素連接酶E3、26S蛋白酶體和去泛素化酶，共同構成了真核細胞內泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)的主體[1-2]。泛素化作為一種重要的蛋白質翻譯后修飾方式，可通過影響細胞內蛋白水平或活性而廣泛參與細胞功能的調控(圖1)。UPS在妊娠建立和維持過程涉及母胎界面胚胎滋養(yǎng)層細胞、蛻膜基質細胞、蛻膜免疫細胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲、分化等生理活動中，以及分泌和吞噬等功能的精細調控過程中都發(fā)揮著重要的作用。以下就蛋白質泛素化修飾在母胎界面的調控作用及其與病理妊娠的相關性進行綜述，以期為生殖基礎醫(yī)學研究提供參考。

圖1 UPS對底物蛋白的作用過程及其對細胞功能的調控

一、蛋白質泛素化修飾對滋養(yǎng)層細胞生理活性的調控作用

1.蛋白質泛素化修飾調控滋養(yǎng)層細胞的增殖與分化：胎盤是母體和胚胎間獨特的交換器官，它的形成對人類成功妊娠和胎兒健康至關重要。滋養(yǎng)層細胞是胎盤的實質細胞，其增殖與分化是胎盤發(fā)育過程中的重要環(huán)節(jié)[3]。胚胎植入后，其最外層細胞高度增殖，產生大量的滋養(yǎng)層細胞[4]，這是胎盤形成的基石。研究發(fā)現，有兩大類泛素連接酶E3復合物參與調控滋養(yǎng)層細胞的增殖與分化，其中一類泛素連接酶E3復合物是Skp1-Cullin-F-box蛋白復合物(SCF)，其參與調控細胞周期調節(jié)因子，進而影響細胞周期。有研究發(fā)現，缺乏Cullin 1(簡稱Cul1)會導致小鼠滋養(yǎng)層巨細胞中的細胞周期蛋白E水平異常升高，滋養(yǎng)層巨細胞體積異常增大[5]。結合有F盒(F-box)和富含亮氨酸重復結構域的蛋白12(簡稱Fbxl12)是胎盤特異性的泛素連接酶E3，其可在滋養(yǎng)細胞干細胞中通過對乙醛脫氫酶3(ALDH3)泛素化，降低ALDH3的活性，從而在胎盤發(fā)育中啟動滋養(yǎng)層細胞的分化[6]。結合有F-box和WD重復結構域的蛋白8(簡稱Fbxw8)可使滋養(yǎng)細胞周期蛋白依賴激酶(CDK)1、CDK2、Cyclin A和Cyclin B1的表達升高，P27蛋白的表達降低，并在有絲分裂G2/M期影響細胞增殖[7]。另一類泛素連接酶E3復合物是細胞周期后期促進復合物(APC/C)，其主要通過調節(jié)細胞雙能蛋白(Geminin)來調控滋養(yǎng)層細胞的增殖或分化。有研究表明，Cdh1(也稱FZR1)是APC/C的重要輔因子，有助于維持滋養(yǎng)細胞基因組穩(wěn)定性以及增殖效率，Cdh1缺陷則會導致胎盤功能障礙[8]。Geminin是一種重要的細胞周期蛋白，對DNA復制具有雙重穩(wěn)定功能。APC/C-Cdh1介導的Geminin泛素化，可調節(jié)多能干細胞周期，誘導其分化為滋養(yǎng)層細胞[9]。此外，在滋養(yǎng)層細胞中，APC/C介導Geminin的泛素化降解，促進核內復制并分化為滋養(yǎng)層巨細胞[10]。Pal等[11]報道，APC/C與SCF也存在相互作用，它們之間的相互調控機制可能有助于細胞周期調控的穩(wěn)定性，這為研究其在滋養(yǎng)層細胞周期調控中的作用提供了新的視角。

2.蛋白質泛素化修飾調控滋養(yǎng)層細胞的侵襲與遷移：絨毛外細胞滋養(yǎng)層細胞在經歷上皮-間質轉化(EMT)后，獲得高度侵襲性，侵入子宮內膜以錨定胎盤，并穿透子宮螺旋動脈內膜以建立胎兒-母體循環(huán)[3，12]。在真核生物中發(fā)現的數百種泛素連接酶E3主要被分為4型：HECT型、U-box型、PHD指型和RING型[13]，其中RING型中的Cul1家族成員是參與調控滋養(yǎng)層細胞侵襲與遷移活性的重要分子，Cul1通過維持基質金屬蛋白酶活性而促進滋養(yǎng)層細胞侵襲與遷移[12]，而Cul7則通過減少Pleckstrin同源樣結構域家族B成員2(也被稱為LL5β)的積累而抑制滋養(yǎng)層細胞的遷移[14]。缺氧是影響胎盤發(fā)育的一個關鍵信號[3]，而缺氧誘導因子-1(HIF-1)是細胞對缺氧反應的關鍵分子，HIF-1α亞基在胎盤發(fā)育早期定位于滋養(yǎng)層細胞，羥基化后可被UPS降解而導致滋養(yǎng)層細胞侵襲能力減弱；在缺氧環(huán)境中，脯氨酸羥化酶被抑制，HIF-1α降解減少，滋養(yǎng)層細胞侵襲性增強[15]。由此可以看出，UPS參與調控滋養(yǎng)層細胞侵襲活性的方式是多樣的，既體現了不同泛素連接酶E3的特有調節(jié)方式，也反映了母胎界面建立過程中局部缺氧的組織特征。

3.蛋白質泛素化修飾調控滋養(yǎng)層細胞的凋亡：作為一個發(fā)育中的器官，胎盤需要經歷不斷的組織重塑，其特征就是作為胎盤主要細胞成分的滋養(yǎng)層細胞在增殖、分化成特定的細胞亞型后，衰老細胞被選擇性去除，以保持微環(huán)境的相對穩(wěn)定。隨著妊娠的進行，正常胎盤中的滋養(yǎng)層細胞凋亡增加[16]。已有研究發(fā)現，髓系細胞白血病因子1(Mcl-1)泛素連接酶E3(MULE)能對Mcl-1和腫瘤抑制因子p53進行蛋白酶體降解。病理妊娠中，MULE對Mcl-1與p53的靶向降解優(yōu)先級不同，導致不同凋亡相關蛋白積累而影響其凋亡活性[17]。早期滋養(yǎng)層細胞高表達的X連鎖凋亡抑制蛋白(XIAP)可以保護細胞免于細胞凋亡信號受體FAS介導的凋亡，而PIK3/AKT通路能通過磷酸化XIAP阻止XIAP的泛素化和降解，進而降低早期滋養(yǎng)層細胞對FAS介導的凋亡敏感性[18]。以上研究說明，UPS對凋亡相關蛋白質的處置過程是滋養(yǎng)層細胞凋亡調控的重要方式，不同蛋白質的降解次序，泛素化與磷酸化這兩種蛋白質修飾的內在關系，提示我們UPS調節(jié)滋養(yǎng)層細胞凋亡的多樣性。

二、蛋白質泛素化修飾對蛻膜化過程的調控作用

蛻膜是與胎盤最密切相關的母體組織，并作為內分泌和免疫器官發(fā)揮重要的妊娠調節(jié)作用。蛻膜化是子宮內膜組織經廣泛重塑而形成蛻膜的過程，子宮內膜蛻膜化后會發(fā)生顯著的結構和功能變化，為胚胎發(fā)育奠定基礎。囊胚附著于子宮內膜上皮后，在雌激素、孕激素的誘導下，子宮內膜基質細胞(ESCs)大量增殖和分化，增強子宮內膜容受性，以支持胚胎植入和胎盤發(fā)育[19]。泛素化修飾可通過調節(jié)子宮內膜細胞中雌激素、孕激素受體的水平而參與調控蛻膜化過程。UPS可增強雌激素受體α(ERα)的降解而減弱子宮上皮細胞和基質細胞對雌激素的敏感性，從而促進孕酮的合成及子宮內膜蛻膜化，有利于胚胎植入[20]。在小鼠子宮內膜組織中，泛素特異性蛋白酶(USP)22可調控孕激素受體的水平，USP22的表達也在一定條件下受孕酮調節(jié)，而孕酮介導的蛻膜化又依賴于USP22的調節(jié)[21]，但目前這方面的研究還主要停留在實驗動物層面。

蛻膜化涉及的一些信號通路與泛素化修飾密切相關。Wnt信號通路不僅參與調控囊胚激活與植入，在子宮發(fā)育和蛻膜化過程中也發(fā)揮著重要作用。多種Wnt配體可通過β-catenin依賴性或非依賴性途徑，調控小鼠子宮發(fā)育和腺體形成過程[22]，而β-catenin受到UPS的直接或間接調控[23-24]。TGFβ信號通路影響著小鼠蛻膜組織的完整性[25]，在蛻膜化過程中，通過調控ESCs中TGFβ信號通路受體Endoglin的表達而增強子宮內膜容受性[26]。此外，對血管內皮細胞的研究發(fā)現，內皮糖蛋白可通過干擾Smad泛素化調節(jié)因子2使得TGFβ信號通路中的Smads泛素化，從而減少Smads的降解[27]，但這一分子途徑是否也參與調控蛻膜化過程尚需進一步研究。

三、泛素化修飾對免疫細胞的調控以及對母胎界面免疫微環(huán)境的潛在影響

在妊娠期間母體特殊的生理條件下，母胎界面存在著復雜的免疫反應，相關免疫細胞與細胞因子等形成了獨特的免疫微環(huán)境。泛素化修飾對免疫細胞功能具有調節(jié)作用，但蛻膜免疫細胞中的泛素化修飾與妊娠關系的研究還相對欠缺，下面僅就幾種具有代表性的免疫細胞進行探討。

1.泛素化修飾對蛻膜自然殺傷細胞(dNK)的調控：dNK是數量最多的蛻膜免疫細胞，約占70%，主要參與血管重鑄和免疫調節(jié)。dNK分泌的干擾素-γ(IFN-γ)是螺旋動脈重鑄中的重要細胞因子[28]，而UPS參與調控小鼠dNK中IFN-γ的生成[29]，提示UPS可能通過調控dNK中IFN-γ的分泌而參與調控血管重鑄。母胎界面胎兒內皮細胞和侵襲性滋養(yǎng)層細胞表達的主要組織相容性復合體(MHC)-I類分子人白細胞抗原-G(HLA-G)可通過阻斷Syk/MEK/ERK信號通路的激活而抑制自然殺傷細胞(NK)毒性[30]。而Syk是NK中一種重要的蛋白酪氨酸激酶，可在CD16刺激NK后被UPS降解[31]。因此，NK中Syk的泛素化很可能影響dNK細胞毒性而介導母胎界面免疫耐受狀態(tài)的形成。目前，在泛素化對外周NK的調控、dNK對母胎界面的調控方面都有不少研究報道，但外周NK與dNK在這些機制上是否一致還缺少直接的實驗證據。

2.泛素化修飾對蛻膜巨噬細胞(dMφ)的調控：巨噬細胞(Mφ)屬于固有免疫系統(tǒng)，由單核細胞進入組織器官分化而來。其極化后又可分為促炎性的M1型和抗炎性的M2型[32]。dMφ是人類蛻膜組織中數量第2多的免疫細胞，約占20%[33]。dMφ的極化特性關系到母胎界面免疫環(huán)境的平衡，而這一過程可能涉及多種蛋白質的泛素化修飾。對Mφ的研究表明，泛素連接酶E3中的Myc結合蛋白2可通過刺激調節(jié)M2型Mφ標志物CD206的表達[34]；而泛素連接酶E3中的Praja2介導惡性纖維組織細胞瘤擴增序列-1的泛素化，正向調節(jié)TLR2介導的JNK/p38通路并促進Mφ向M1型極化[35]。USP19可抑制NOD樣受體家族蛋白NLRP3的降解，而NLRP3通過與干擾素調節(jié)因子-4相互作用促進Mφ極化為M2型，將NLRP3的促炎功能轉變?yōu)榭寡坠δ躘36]。需要說明的是，由于Mφ的多樣極化與復雜表型，并不適合直接將Mφ的某種泛素化調控機制套用在dMφ上。此外，在螺旋動脈重鑄過程中，需要及時清理已凋亡的細胞，dMφ的吞噬活性就顯得尤為重要[33]。自然殺傷溶酶相關分子是Mφ中表達的泛素連接酶E3，通過參與吞噬小體蛋白的泛素化修飾而促進吞噬小體成熟[37]，這可能是UPS對母胎界面dMφ功能調控的另一種方式。

3.泛素化修飾對蛻膜樹突細胞(dDC)與T細胞的調控：樹突細胞(DC)是功能強大的抗原遞呈細胞，但在母胎界面處，其最明顯的特征是稀缺性(人類妊娠早期蛻膜切片中往往只有數個dDC/mm2)，這有助于母體降低對母胎界面處的免疫檢測，增強子宮容受性，以便胚胎順利著床并維持妊娠[28]。另外，dDC的共刺激分子CD86和MHCⅡ類分子表達相對較低，這也有利于妊娠免疫耐受的建立[38]。膜相關環(huán)CH型指1(MARCH1)是一種膜結合的泛素連接酶E3，可介導DC表面MHCⅡ類分子和CD86的泛素依賴性受體內化以及溶酶體降解，從而負調控DC在T細胞激活中的功能[39]。T細胞也是母胎界面免疫調節(jié)的重要成分，包括調節(jié)性T細胞(Treg)、CD4+輔助性T細胞和CD8+細胞毒性T細胞(Tc)等[40]。一種名為Ubc13的泛素結合酶E2在母體的精子特異性Treg細胞表達下降會促進Treg向效應T細胞轉化，使得母胎界面免疫失衡并導致妊娠疾病發(fā)生[41]。另外，有研究表明，UPS對Tc細胞毒性物質的產生不可或缺[42]，而在母胎界面處，雌激素和孕激素分別通過直接和間接的方式下調Tc細胞中穿孔素和顆粒酶的表達，減弱其細胞毒活性以利于胚胎植入與妊娠[43]。Tc細胞內雌激素、孕激素對UPS的相關調控值得進一步探究。

四、蛋白質泛素化修飾在妊娠疾病中的作用

1.蛋白質泛素化修飾與復發(fā)性自然流產(RSA)：RSA病因復雜，涉及滋養(yǎng)層細胞、蛻膜基質細胞、免疫細胞等多方面，但已有研究表明，RSA與UPS功能異常有關?，F已發(fā)現，USP25在RSA患者胎盤絨毛組織中表達顯著降低，且體外研究表明，下調USP25后抑制了滋養(yǎng)細胞EMT，從而引起滋養(yǎng)層細胞侵襲能力不足[44]。肺腺癌轉移相關轉錄因子1(MALAT1)可以通過招募泛素連接酶E3來影響隱花色素2蛋白的穩(wěn)定性，促進滋養(yǎng)層細胞遷移和侵襲。RSA患者胎盤絨毛組織中MALAT1的表達水平顯著降低，這可能是引起RSA患者滋養(yǎng)層細胞侵襲能力不足的原因之一[45]。SCF復合物關鍵成分Skp2的表達下調會導致蛻膜化受損，使個體更易發(fā)生RSA[46]。泛素結合酶E2中的Ubc13負調控Treg細胞向效應T細胞轉化，該酶在RSA患者的精子特異性Treg細胞中表達下降，引起RSA發(fā)生[41]。

2.蛋白質泛素化修飾與先兆子癇(PE)：PE病理特征主要表現為蛻膜和肌層螺旋動脈的滋養(yǎng)層細胞被異常侵犯，導致其不能向胎盤供給足夠的血流量[47]。與PE相關的泛素化研究較多關注其對滋養(yǎng)層細胞生物學功能的調控。例如，過表達的MULE優(yōu)先降解p53蛋白而使Mcl-1的促凋亡亞型在滋養(yǎng)層細胞積累[17]；低水平的Cul1使得滋養(yǎng)層細胞前體細胞在向高侵襲性滋養(yǎng)層細胞分化過程出現障礙[12]。滋養(yǎng)層細胞侵襲不足、螺旋動脈重鑄不足以及胎盤缺氧等問題的出現又常常與UPS對HIF-1的調節(jié)有關[3]。母胎界面微環(huán)境失調也是PE的致病因素，PE患者胎盤組織中的USP14顯著過表達，這使得NF-κB通路被過度激活，導致了大量促炎細胞因子的產生[47]。此外，26S蛋白酶體活性也值得關注。有研究發(fā)現，與正常胎盤組織相比，PE患者胎盤組織中蛋白酶體活性顯著降低，這使組織產生以大分子量泛素化蛋白聚集為特征的PE胎盤早衰現象[48]。上述研究結果說明，泛素化、去泛素化修飾以及蛋白酶體自身活性等分子水平異常與組織病變之間的緊密關系，開發(fā)這些UPS相關分子的靶向藥物，可能有助于PE防治技術的提高。

3.蛋白質泛素化修飾與胎兒宮內生長受限(IUGR)：IUGR病因較多，可由感染、母體疾病和染色體疾病等引起，但更常見的原因是妊娠早期的胎盤發(fā)育缺陷，其與PE的發(fā)生具有一定相似性，也與UPS異常存在關聯[17]。然而，IUGR和PE的泛素化修飾的分子機制不同，PE和IUGR患者胎盤中的UPS成分MULE均過表達，在PE中MULE優(yōu)先靶向降解p53蛋白，積累促凋亡的Mcl-1亞型；然而，在IUGR中MULE靶向降解Mcl-1促存活亞型，積累p53蛋白并發(fā)揮其凋亡功能[17]。簡單地根據細胞、組織特征進行歸因往往會忽視此類差異，也說明泛素化修飾差異很可能是我們進一步認識妊娠相關疾病的突破點。此外，胎兒營養(yǎng)物質供應不足也會引起IUGR，在IUGR患者中胎盤的一些氨基酸轉運體出現異常。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路可通過調節(jié)鈉偶聯中性氨基酸轉運載體2(SNAT-2)的泛素化和質膜轉運，調控系統(tǒng)A型氨基酸轉運體的活性。mTOR活性降低會降低系統(tǒng)A型氨基酸轉運體活性，阻礙胎兒氨基酸攝取[49]。神經前體細胞表達發(fā)育抑制蛋白4-2(NEDD4-2)是一種泛素連接酶E3，其介導的泛素化作用可降低SNAT-2和系統(tǒng)L型氨基酸轉運體-1的質膜表達，導致滋養(yǎng)層細胞氨基酸攝取減少，并最終影響胎兒生長發(fā)育[50]，這從母胎之間物質交換的角度解釋了蛋白質泛素化與IUGR的關系。

五、總結與展望

母體與胎兒之間聯系紐帶的建立有賴于母胎界面滋養(yǎng)層細胞、ESCs以及包括dNK、dMφ等在內的免疫細胞功能的正常發(fā)揮。UPS通過調控細胞內蛋白質水平及活性，在滋養(yǎng)層細胞及ESCs的生理活動調節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。此外，本文還從UPS對機體免疫細胞的影響出發(fā)，分析免疫細胞對母胎界面的作用，對UPS、免疫細胞和母胎界面之間一些已有的與潛在的調控關系進行探討發(fā)現，一些妊娠相關疾病的發(fā)生發(fā)展與UPS異常相關。對母胎界面相關泛素化修飾的研究，可能為揭示生命孕育與誕生的奧秘提供更多的線索。