孔俊虹,陳弦,沙晨曦,龔楚橋,宋曉龍

(1.南京中醫(yī)藥大學附屬常州市中醫(yī)醫(yī)院,江蘇 常州 213003;2.鹽城市中醫(yī)院心內科,江蘇 鹽城 224001)

冠心病即冠狀動脈粥樣硬化性心臟病,是由于冠狀動脈粥樣硬化引起的管腔狹窄或閉塞,導致心臟組織缺氧、缺血或壞死而引起的缺血性心臟病。抑郁癥已被認為是冠心病一個重要的獨立危險因素。越來越多的證據(jù)表明冠心病患者的抑郁癥患病率非常高,在冠狀動脈旁路移植術或心肌梗死后,重度抑郁癥的發(fā)生率約為15%,外加較輕度的抑郁癥,發(fā)病率超過了40%[1-2]。合并抑郁癥會導致冠心病患者出現(xiàn)不良結局的風險增加,如較差的運動耐受性、較低的治療依從性、較差的生活質量及認知能力下降等[3-7],死亡的相對風險也會增加。

炎癥在冠心病和抑郁癥的病理學中起著關鍵作用，是冠心病的一個核心特征,在所有動脈粥樣硬化階段(從動脈粥樣硬化斑塊的起始到傳播和激活,最終導致血栓形成)中都起著關鍵作用。研究表明，與健康受試者相比,冠心病患者表現(xiàn)出更高的炎癥標志物及促炎基因表達[8-10]。促炎基因在抑郁癥患者中表達顯著增加[11-12]。GSK3β通過差異影響轉錄因子NF-κB亞基p65和CREB與共激活因子CREB結合蛋白(CBP)的相互作用來調節(jié)炎癥反應[13-14]。研究表明,丹參酮ⅡA對GSK3β活性具有一定的抑制作用,其通過增加GSK3β的磷酸化,抑制了NF-κB的磷酸化,導致促炎因子IL-6和TNF-α表達降低,發(fā)揮了抗炎活性[15]。本研究構建了ApoE-/-小鼠冠心病合并抑郁模型,后給予丹參酮ⅡA,通過檢測炎癥相關蛋白的表達,探討丹參酮ⅡA抗冠心病伴抑郁的可能機制。同時也為丹參酮ⅡA在心血管疾病中的應用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 動物

36只雄性SPF級ApoE-/-小鼠,8周齡,體質量21～25 g,購自常州卡文斯實驗動物有限公司,許可證號:SCXK(蘇)2016-0010。實驗過程經(jīng)南京中醫(yī)藥大學倫理委員會批準,批準文號:201901A055。動物飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心,自由飲食和飲水,恒溫(21.0±2.0)℃,恒濕(55.0±5.0)%,保持12 h光照和黑暗交替循環(huán)。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑 丹參酮ⅡA(上海麥克林生化科技有限公司,批號：S819421);高脂飼料(0.15%膽固醇+21%豬油+78.85%基礎飼料);油紅O染料(上海麥克林生化科技有限公司,批號：S817380);蘇木素-伊紅(HE)染液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA強裂解液、磷酸酶抑制劑(碧云天生物技術公司,批號：C0105S、P0012S、P0013B、P1081);TC、TG含量檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號：BC1980、BC0620);HDL-C、LDL-C、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10 ELISA檢測試劑盒(上海茁彩生物科技有限公司,批號：ZC38176、ZC38098、ZC-37974、ZC-37988、ZC-39024、ZC-37962);NF-κB、p-NF-κB、GSK3β、p-GSK3β(Ser9)、CREB、p-CREB(Ser133)單克隆抗體(CST公司,批號：8242S、3033S、9315S、9331S、9197S、9198S);GAPDH單克隆抗體、二抗、ECL發(fā)光液(Affinity公司,批號：AF7021、S0001、K002)。

1.2.2 主要儀器 精密天平(Shimadzu,型號：AUW-220D);全波長酶標儀(Thermo Fisher,型號：51119570);低溫離心機(Thermo Fisher,型號：Micro CL21R);電泳及轉膜系統(tǒng)(Bio-Rad,型號：041BR121667);Tanon凝膠成像系統(tǒng)(上海天能,型號：Tanon-4600);生物倒置顯微鏡(Olympus,型號：IX3-SVR);曠場實驗設備(上海吉量,型號：JLBehv-LA);強迫游泳實驗設備、懸尾實驗設備(上海然哲,型號：RZ-Forced S、RZ-Tail Suspension);心電圖實驗設備(珠海宏邦,型號：HB1003);高通量組織勻漿機(寧波新芝,型號：Scientz-48);全自動生物組織脫水機、染色機、生物組織冷凍包埋機、生物組織攤片機、生物組織烤片機(金華益迪,型號：YD-12P2、YD-700、YD-6L、YD-A、YD-B);切片機(Leica,型號：RM2235)。

1.3 造模及干預方法

36只ApoE-/-小鼠適應性飼養(yǎng)1周后,隨機分為正常組、模型組、丹參酮ⅡA低劑量(30 mg·kg-1)組、丹參酮ⅡA高劑量(60 mg·kg-1)組[16],每組9只。正常組小鼠給予普通飼料飼喂，其他組小鼠給予高脂飼料飼喂，持續(xù)飼喂12周。第1周開始進行慢性不可預知溫和應激(CUMS)造模[17],持續(xù)4周,構建冠心病伴抑郁小鼠模型。給藥組從第5周開始每日灌胃給藥1次,持續(xù)給藥8周,正常組和模型組灌胃蒸餾水。末次給藥結束1 h后,即進行心電圖測試和行為學實驗。測試完成后,小鼠禁食不禁水12 h,腹腔注射3%巴比妥鈉40 mg·kg-1進行麻醉,摘眼球取血,隨后分離靠近心臟的主動脈竇部,一部分保存在4%多聚甲醛中,一部分進行冰凍切片進行油紅O染色,剩余部分保存于-80 ℃冰箱中,用于提取蛋白質進行Western blot分析?？焖贁囝^取腦，取小鼠右側大腦海馬區(qū)域組織，用于提取蛋白質進行Western blot分析。血液樣本室溫下靜置1 h后,900×g離心15 min,上層血清保存于-80 ℃冰箱中,用于生化指標檢測。

1.4 心電圖檢查

給藥結束后,將小鼠麻醉并仰臥固定在鼠板上,將肢導聯(lián)的電極夾子按照“左上肢黃色、左下肢綠色、右上肢紅色、右下肢黑色”的順序夾住小鼠爪子掌心部位,調節(jié)電壓為心電圖紙10 mm=1 mV,待小鼠心跳穩(wěn)定且肢導聯(lián)穩(wěn)定，不受小鼠呼吸影響后,開始記錄小鼠心電圖變化。

1.5 行為學測試

1.5.1 強迫游泳實驗(FST) 給藥結束后,小鼠被單獨放入一個圓形容器(高=40 cm,直徑=20 cm),水位高度30 cm,水溫保持在25～27 ℃。小鼠被迫游泳6 min,使用ANY-maze行為學分析設備軟件采集并記錄6 min中最后4 min內小鼠的不動時間。測試全程保持環(huán)境安靜,排除聲音對實驗結果的影響。

1.5.2 糖水偏好實驗(SPT) 給藥結束后,將小鼠進行分籠,每籠1只,禁食禁水24 h后,給予1瓶2%蔗糖溶液和1瓶純水。為了減小客觀因素對實驗的影響,實驗在一個安靜的地方進行測試,并于6 h后交換2個瓶子的位置,繼續(xù)測試6 h后,記錄蔗糖溶液和純水的消耗量。蔗糖偏好率=蔗糖溶液消耗體積/(蔗糖溶液消耗體積+純水消耗體積)×100%。

1.5.3 懸尾實驗(TST) 給藥結束后,將小鼠懸掛在離地面50 cm的鋼梁上,并將膠帶放于離尾巴尖端2 cm處。使用ANT-maze行為學分析設備軟件采集并記錄小鼠6 min內的不動行為,計算最后4 min內的總不動時間。當小鼠被動懸掛而沒有任何掙扎動作時,就定義為靜止不動。測試全程保持環(huán)境安靜,排除聲音對實驗結果的影響。

1.6 HE染色

將放于4%多聚甲醛中的主動脈竇部進行脫水和石蠟包埋,使用輪轉式切片機將蠟塊切成4 μm的冠狀切片備用。切片依次用二甲苯脫蠟,不同濃度乙醇脫水,蘇木素核染色,分化液分化,伊紅胞漿染色,不同濃度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片。顯微鏡鏡檢,圖像采集分析。

1.7 油紅O染色

將新鮮主動脈竇部進行冰凍切片,6 μm,自然風干后4%多聚甲醛固定30 min,蒸餾水沖洗,晾干,將切片浸入油紅O染液中染色10 min,鏡下觀察染色程度,后使用60%異丙醇進行分化,蒸餾水沖洗,蘇木素復染,甘油明膠進行封片。顯微鏡鏡檢,圖像采集分析。

1.8 生化指標檢測

按照試劑盒說明書步驟檢測血清中TC和TG的含量;使用ELISA試劑盒測定血清中HDL-C、LDL-C、IL-1β、IL-6、TNF-α及IL-10水平。

1.9 Western blot檢測

將主動脈竇組織用PBS溶液清洗2遍,加入含1%PMSF和2%磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液,使用高通量組織勻漿機進行低溫研磨。勻漿在4 ℃和12 000 r·min-1下離心20 min,然后吸取上清液。根據(jù)生產(chǎn)說明書,使用BCA試劑盒測定上清液的蛋白質濃度。后通過12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離每個樣品中等量的蛋白質,并轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。與一抗和二抗孵育并洗滌后,使用Tanon凝膠成像系統(tǒng)檢測蛋白質條帶,并使用Image J軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.10 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 丹參酮ⅡA對ApoE-/-小鼠心電圖指標的影響

如圖1所示,正常組小鼠心電圖未見明顯異常;與正常組相比,模型組中ST段明顯抬高;與模型組相比,丹參酮ⅡA高、低劑量組小鼠心電圖ST段隨給藥劑量增加逐漸恢復。提示丹參酮ⅡA能夠改善由于冠心病引起的心電圖ST段的抬高。

圖1 丹參酮ⅡA對ApoE-/-小鼠心電圖的影響Fig.1 Effect of tanshinone ⅡA on the electrocardiogram of ApoE-/- mice

2.2 丹參酮ⅡA對ApoE-/-小鼠心臟主動脈竇脂質聚集和斑塊形成的影響

心臟主動脈竇經(jīng)HE染色,結果如圖2所示,正常組小鼠心臟主動脈竇內膜結構完整,光滑無中斷,未見明顯異常;與正常組相比,模型組小鼠心臟主動脈竇內膜下可見明顯粥樣斑塊形成且大面積累及向管腔內凸起,斑塊內存在泡沫細胞;與模型組相比,隨著丹參酮ⅡA給藥劑量的增加,組織內膜粥樣斑塊明顯減少。油紅O染色結果如圖3所示,正常組小鼠心臟主動脈竇內膜下脂質積累較少;與正常組相比,模型組存在大量的脂質積累;與模型組比較，丹參酮ⅡA組隨給藥劑量的增加脂質積累明顯減少。以上結果表明丹參酮ⅡA能有效抑制ApoE-/-小鼠主動脈竇內膜脂質積累和粥樣斑塊的形成。

圖2 丹參酮ⅡA對ApoE-/-小鼠心臟主動脈竇組織結構的影響(HE,×200)Fig.2 Effect of tanshinone ⅡA on the tissue structure of cardiac aortic sinus in ApoE-/- mice (HE,×200)

圖3 丹參酮ⅡA對ApoE-/-小鼠心臟主動脈竇脂質堆積的影響(油紅O,×200)Fig.3 Effect of tanshinone ⅡA on the lipid accumulation of cardiac aortic sinus in ApoE-/- mice (Oil red O,×200)

2.3 丹參酮ⅡA對ApoE-/-小鼠抑郁樣行為的影響

表1結果顯示,與正常組相比,模型組FST和TST的不動時間顯著增加(P<0.01),且SPT蔗糖偏好率顯著降低(P<0.01),表明造模成功;給予丹參酮ⅡA(30、60 mg·kg-1)治療后,CUMS誘導小鼠FST和TST的不動時間顯著減少(P<0.01),小鼠蔗糖偏好率顯著增加(P<0.01),且表現(xiàn)出劑量依賴性。表明丹參酮ⅡA能有效改善ApoE-/-小鼠抑郁樣行為。

表1 丹參酮ⅡA對ApoE-/-小鼠抑郁樣行為的影響Table 1 Effect of tanshinoneⅡA on the depression-like behaviors of ApoE-/- mice

2.4 丹參酮ⅡA對ApoE-/-小鼠血脂及炎癥因子水平的影響

與正常組相比,模型組血清中TC、TG和LDL-C含量顯著增加(P<0.01),而HDL-C含量顯著降低(P<0.01);給予丹參酮ⅡA(30、60 mg·kg-1)治療后,血清中TC、TG及LDL-C含量顯著降低(P<0.01),HDL-C含量顯著增加(P<0.01),且呈劑量依賴性,見表2。如表3所示,模型組血清中促炎因子IL-1β、IL-6及TNF-α的含量顯著增加(P<0.01),而抗炎因子IL-10的含量顯著降低(P<0.01)。丹參酮ⅡA(30、60 mg·kg-1)干預可顯著降低促炎因子的水平,且增加抗炎因子的含量。以上結果表明,丹參酮ⅡA能夠有效抑制ApoE-/-小鼠血清中脂質及促炎因子的增加,促進抗炎因子的釋放,預防動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。

表2 丹參酮ⅡA對ApoE-/-小鼠血脂含量的影響Table 2 Effect of tanshinone ⅡA on the contents of serum lipids in ApoE-/- mice

表3 丹參酮ⅡA對ApoE-/-小鼠血清中炎癥因子含量的影響Table 3 Effect of tanshinone ⅡA on the contents of serum inflammatory factors in ApoE-/- mice

2.5 丹參酮ⅡA對ApoE-/-小鼠心臟主動脈竇組織及海馬組織中炎癥相關蛋白表達的影響

與正常組相比,模型組心臟主動脈竇組織和海馬組織中p-GSK3β(Ser9)/GSK3β和p-CREB(Ser133)/CREB的比值顯著增加(P<0.01),給予丹參酮ⅡA(30、60 mg·kg-1)治療后,p-GSK3β(Ser9)/GSK3β和p-CREB(Ser133)/CREB的比值進一步呈劑量依賴性增加(P<0.05,P<0.01)。在2種組織中,模型組p-NF-κB/NF-κB比值顯著增加(P<0.01),給予丹參酮ⅡA(30、60 mg·kg-1)治療后,p-NF-κB/NF-κB比值呈劑量依賴性降低(P<0.01)。結果見圖4。

注:A.正常組;B.模型組;C.丹參酮ⅡA低劑量組;D.丹參酮ⅡA高劑量組; 與正常組相比,##P<0.01;與模型組相比,*P<0.05，**P<0.01。圖4 丹參酮ⅡA對ApoE-/-小鼠心臟主動脈竇組織和海馬組織炎癥相關蛋白表達的影響Fig.4 Effect of tanshinone ⅡA on the expressions of inflammation related proteins in cardiac aortic sinus and hippocampus in ApoE-/- mice

3 討論

丹參酮ⅡA是丹參酮最主要的成分之一,具有多種心血管方面的調節(jié)活性,如舒張血管、保護缺血再灌注損傷及抗心律失常等[18-20]。此外,也有不少文獻報道了丹參酮ⅡA在抗炎方面的作用。丹參酮ⅡA通過促進GSK3β的磷酸化和抑制NF-κB的磷酸化,降低促炎因子IL-6和TNF-α的表達,發(fā)揮抗炎作用[15]。在糖尿病大鼠心肌缺血再灌注損傷模型中,丹參酮ⅡA預處理可減少大鼠心肌梗死面積,改善心功能障礙,降低心肌細胞凋亡和炎癥水平,其機制可能與PI3K/Akt/NF-κB信號通路有關[21]。丹參酮ⅡA通過抑制NF-κB和HIF-1α的激活可減輕脂多糖(LPS)誘導的膿毒癥肺損傷[22]。此外,丹參酮ⅡA還可通過抑制NLRP3炎癥小體的活化發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用[23]。丹參酮ⅡA在改善心肌細胞損傷及抗炎方面的作用表明其在抗冠心病等疾病中的潛力。研究表明,神經(jīng)炎癥因子通過攻擊神經(jīng)元細胞可能參與應激性抑郁癥的發(fā)生和發(fā)展[24]。GSK3β的活化可使p-NF-κB與CBP結合能力增強,促進IL-1β、IL-6及TNF-α等促炎因子表達增加,發(fā)揮促炎作用;GSK3β活性被抑制，即p-GSK3β(Ser9)水平增加時,p-CREB(Ser133)與CBP結合能力增強,促進抗炎因子IL-10表達增加,發(fā)揮抗炎作用[13-14]。Su等[25]研究發(fā)現(xiàn),在抑郁癥小鼠模型中,NLRP3炎癥小體能夠調節(jié)CUMS誘導的MAPK通路和NF-κB蛋白復合物活性。另外,有研究表明，PI3K/Akt/GSK3β/CRMP-2信號通路介導了抑郁癥中神經(jīng)的可塑性[26],提示GSK3β、NF-κB等在冠心病伴抑郁中的可能作用。

本研究Western blot實驗結果表明,模型組心臟主動脈竇組織和海馬組織p-NF-κB/NF-κB比值較正常組顯著增加,表明造模條件下,小鼠炎癥水平升高;給予丹參酮ⅡA干預后,p-NF-κB/NF-κB比值被顯著降低。此外,模型組p-GSK3β(Ser9)/GSK3β和p-CREB(Ser133)/CREB比值較正常組顯著增加,這可能是因為機體自身的反饋性作用引起的,在外界刺激下,機體抗炎癥機制被反饋性激活[13-14]。給予丹參酮ⅡA干預后,該p-GSK3β(Ser9)/GSK3β和p-CREB(Ser133)/CREB比值繼續(xù)顯著增加,使抗炎機制占主導作用,發(fā)揮其抗炎活性。

綜上所述,本研究表明丹參酮ⅡA能夠有效抑制ApoE-/-小鼠血清中脂質和促炎因子的增加,促進抗炎因子的釋放,抑制ApoE-/-小鼠主動脈竇內膜脂質積累和粥樣斑塊的形成,改善ApoE-/-小鼠抑郁樣行為。其抗冠心病伴抑郁的機制可能是通過調節(jié)GSK3β/NF-κB/CREB信號通路來實現(xiàn)的。