劉洋,鄭秀芹,楊葛俊,趙涵,陸茵,王愛(ài)云,陳文星

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210023;2.江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210023)

皮膚惡性黑色素瘤(Cutaneous malignant melanoma,CMM)是一種源于表皮正常黑色素細(xì)胞或原有痣細(xì)胞的惡性腫瘤,致病原因包括紫外線輻射、遺傳因素、外傷刺激、病毒感染、免疫反應(yīng)等[1]。其惡性程度高,易局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移,致死率高,預(yù)后極差,近幾十年來(lái),黑色素瘤的全球發(fā)病率逐年增加且呈年輕化趨勢(shì)[2]。目前黑色素瘤的主流治療方法包括放射療法、藥物靶向治療和免疫療法等,但往往療效不佳,存在明顯的不良反應(yīng)和易耐藥性[3],因此亟需開(kāi)發(fā)新的治療手段。

代謝重編程是惡性腫瘤的一個(gè)標(biāo)志[4],表現(xiàn)為在氧氣足以支持線粒體氧化磷酸的情況下,腫瘤細(xì)胞仍采用糖酵解的方式進(jìn)行代謝,即Warburg效應(yīng)。這種低效但快速的代謝方式消耗了腫瘤微環(huán)境中大量的葡萄糖,合成了腫瘤快速增殖所需要的前體物質(zhì),同時(shí)分泌的乳酸形成了免疫抑制微環(huán)境[5],因此靶向腫瘤細(xì)胞的代謝方式是目前抗腫瘤治療富有前景的重點(diǎn)策略。

化瘀散結(jié)法是中醫(yī)臨床抗腫瘤的重要法則之一[6],中藥三棱作為破血化瘀代表藥,具有抗血小板聚集、降低全血黏度、鎮(zhèn)痛、抗癌等藥理作用。目前關(guān)于三棱抗腫瘤的報(bào)道眾多,如三棱水提物能夠提高H22肝癌荷瘤小鼠血清中TNF-α、IL-2水平,增強(qiáng)免疫力,從而抑制腫瘤生長(zhǎng)[7];三棱散水提物對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞有抑制增殖和促凋亡作用[8];三棱總黃酮通過(guò)誘導(dǎo)S/G2細(xì)胞周期停滯來(lái)抑制雌激素受體陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞A549、MCF-7的增殖活性[9]。惡性黑色素瘤作為人類(lèi)皮膚腫瘤中惡性程度最高的一種疾病，治療和預(yù)防黑色素瘤的藥物開(kāi)發(fā)是目前研究的熱點(diǎn)，三棱中活性成分芒柄花黃素(又名刺芒柄花素)可抑制人黑色素瘤細(xì)胞A375的活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與啟動(dòng)Caspase-3介導(dǎo)的凋亡途徑相關(guān)[10]；三棱成分山柰酚通過(guò)作用于Akt/GSK-3β信號(hào)通路抑制HK2-VDAC1在線粒體的結(jié)合，影響了黑色素瘤細(xì)胞A375和B16F10的糖酵解代謝活動(dòng)，進(jìn)而抑制了黑色素瘤的轉(zhuǎn)移[11]。這些研究提示了三棱在治療皮膚惡性黑色素瘤中存在潛在的臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

人源黑色素瘤A375細(xì)胞由上海細(xì)胞所提供。采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃,5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher Scientific公司,型號(hào):Veriti96);生物安全柜(ESCO公司,型號(hào):ESCO AC2);全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Countstar公司,型號(hào):IC1000);離心機(jī)(湘儀公司,型號(hào):L420);倒置顯微鏡(ZEISS公司,型號(hào):AX10);海馬能量代謝實(shí)時(shí)測(cè)定儀(Agilent公司,型號(hào):XF24);酶標(biāo)儀(BioTek公司,型號(hào):Synergy2)。

1.3 藥物與試劑

三棱提取物(SLTQW)凍干粉(南通飛宇生物科技有限公司,批號(hào):FY20S0413,經(jīng)鑒定本品為棕黃色粉末,過(guò)80目篩,干燥失質(zhì)量≤5.0%)，經(jīng)HPLC定性檢測(cè)，鑒定出三棱提取物中含有刺芒柄花素、常春藤皂苷元、豆甾醇、β-谷甾醇等成分;DMEM高糖培養(yǎng)基(江蘇凱基生物公司,貨號(hào):KGM12800NH-500);胎牛血清(Cellmax公司,貨號(hào):SA301.02);青霉素(Biosharp公司,貨號(hào):Amresco0242);鏈霉素(Biofroxx公司,貨號(hào):3810-74-0);胰蛋白酶(Amersco公司,貨號(hào):3112);CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物公司,貨號(hào):KGA317);BeyoClickTMEdU-555細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(碧云天公司,貨號(hào)C0075S);葡萄糖測(cè)試盒(貨號(hào):F006-1-1)、乳酸測(cè)定試劑盒(貨號(hào):A019-2-1)、丙酮酸測(cè)定試劑盒(貨號(hào):A081-1-1)、己糖激酶試劑盒(貨號(hào):A077-3)、果糖磷酸激酶活性測(cè)定試劑盒(貨號(hào):A129-1-1)、丙酮酸激酶測(cè)試盒(貨號(hào):A076-1-1)購(gòu)自南京建成公司；PKM2(貨號(hào):15822-1-AP)、LDHA(貨號(hào):19987-1-AP)、MCT4(貨號(hào):22787-1-AP)、β-actin抗體(貨號(hào):66009-1-Ig)購(gòu)自Proteintech公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 三棱相關(guān)靶點(diǎn)篩選 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)尋找中藥三棱所含有的化合物,根據(jù)ADME屬性進(jìn)行篩選,設(shè)定口服利用度(Oral bioavailability,OB)≥30%,類(lèi)藥性(Drug likeness,DL)≥0.18,得到三棱有效活性成分。并利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取三棱有效成分的作用靶點(diǎn),導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org)進(jìn)行基因名規(guī)范化處理。

1.4.2 三棱-黑色素瘤靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 以“melanoma”“cutaneous melanoma”“malignant melanoma”為關(guān)鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/Guide/GeneCard)中挖掘黑色素瘤的潛在靶點(diǎn)。為了探究靶點(diǎn)蛋白在系統(tǒng)水平上的作用,利用Cytoscape3.7.2軟件中的Bisogenet插件,分別構(gòu)建成分靶點(diǎn)PPI和疾病靶點(diǎn)PPI,對(duì)兩者進(jìn)行拓?fù)浞治霾⒑Y選核心靶點(diǎn)。

1.4.3 三棱-黑色素瘤靶點(diǎn)功能與通路的富集分析 采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析,探究靶點(diǎn)蛋白在信號(hào)通路中的作用,得到三棱在黑色素瘤治療中的主要作用通路,并通過(guò)Omicshare軟件(https://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/seniorbubble)對(duì)富集結(jié)果進(jìn)行可視化處理。分析所得到的結(jié)果,隨后設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)以確定三棱提取物的抗黑色素瘤藥效,并根據(jù)富集到的通路開(kāi)展相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.4.4 CCK-8法檢測(cè)三棱提取物對(duì)A375細(xì)胞活力的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A375細(xì)胞,用胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液,以每孔5×103的密度接種于96孔板,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜,使細(xì)胞貼壁。實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照組、空白組以及三棱提取物不同濃度組(0、50、100、200、400、800 μg·mL-1),每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48 h后,每孔加入10 μL CCK-8試劑,置于培養(yǎng)箱中孵育2 h,用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)定吸光度A。根據(jù)公式計(jì)算:細(xì)胞存活率=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%。

1.4.5 EdU法檢測(cè)三棱提取物對(duì)A375細(xì)胞增殖能力的影響 將A375細(xì)胞以每孔2×10密度接種于6孔板,待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的三棱提取物(0、200、400 μg·mL-1)培養(yǎng)24 h,吸除培養(yǎng)基,加入終濃度為10 μmol·L-1的EdU工作液,標(biāo)記完成后進(jìn)行固定透化處理。每孔加入0.5 mL Click反應(yīng)液,室溫避光孵育30 min,洗滌液洗滌3次后,置于熒光顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)EdU陽(yáng)性細(xì)胞率。EdU陽(yáng)性細(xì)胞率=EdU染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)目×100%。

婆婆緩和了半天情緒后，對(duì)錢(qián)海燕說(shuō)：“燕燕，這段時(shí)間你受苦了，媽還老是不理解你。對(duì)不起啊?！比缓笥謱?duì)周啟明說(shuō)：“兒子，沒(méi)事的。你不用擔(dān)心錢(qián)，還有我和你爸呢?！蹦翘焱砩?，一家人哭成一團(tuán)。

1.4.6 胞外酸化率(ECAR)和耗氧率(OCR)測(cè)定 將A375細(xì)胞按每孔1×104的密度進(jìn)行鋪板,第2天各孔分別加入相應(yīng)的藥物(對(duì)照組與SLTQW 400 μg·mL-1組)干預(yù)24 h。Agilent Seahorse XF Cell Mito Test Kit的檢測(cè)步驟包括:①上機(jī)前一天,在XF96 Extracellular Flux Assay Kits下層加入200 μL水化液;放入37 ℃無(wú)CO2的培養(yǎng)箱中水化過(guò)夜。②配制所需加入的藥物和海馬XF base medium,并調(diào)節(jié)pH值至7.4±0.1,在使用時(shí)將其放入37 ℃水浴鍋水浴1 h。③第2天,用水浴好的海馬XF base medium清洗細(xì)胞2次,最終每孔加入175 μL海馬XF base medium,置于37 ℃無(wú)CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h。④將藥物按所需濃度進(jìn)行稀釋,并加入XF96 Extracellular Flux Assay Kits上層中,每個(gè)孔加入25 μL,上機(jī)。⑤30 min后取出,XF96 Extracellular Flux Assay Kits下層換成已經(jīng)在37 ℃無(wú)CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h的細(xì)胞板,上機(jī)檢測(cè)[12]。

1.4.7 糖酵解相關(guān)代謝產(chǎn)物含量檢測(cè) 將A375細(xì)胞以每孔3×105的密度接種于6孔板內(nèi),待細(xì)胞匯合度長(zhǎng)至60%～70%,換液加入含有不同濃度三棱提取物(0、6.25、25、100、400 μg·mL-1)的培養(yǎng)基,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待給藥24 h后,收集細(xì)胞或上清,根據(jù)相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,到達(dá)反應(yīng)時(shí)間后利用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值。同時(shí),提取各組細(xì)胞蛋白,測(cè)定蛋白濃度,進(jìn)行歸一化處理,以排除細(xì)胞數(shù)差異的影響。

1.4.8 糖酵解激酶活性檢測(cè) 鋪板及給藥操作同1.4.7,給藥24 h后,吸去培養(yǎng)基,將細(xì)胞用1×PBS清洗3遍,之后每孔加入100 μL提取液,使用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞至離心管,置于組織研磨儀中進(jìn)行機(jī)械研磨,研磨完成后,12 000 r·min-1離心10 min,取上清按相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作,到達(dá)反應(yīng)時(shí)間后利用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值,根據(jù)說(shuō)明書(shū)計(jì)算激酶活性,并除以相應(yīng)的蛋白濃度進(jìn)行歸一化處理。

1.4.9 Western blot 收集不同濃度三棱提取物處理24 h后的A375細(xì)胞,加入含PMSF的RIPA裂解液提取蛋白,冰上裂解30 min,收集細(xì)胞于離心管中,4 ℃下12 000 r·min-1離心10 min,加入上樣緩沖液,95 ℃金屬浴變性10 min。SDS-PAGE電泳后,轉(zhuǎn)至PVDF膜,封閉1 h,加一抗孵育過(guò)夜。TBST洗滌4次,每次5 min,加二抗孵育2 h,TBST洗滌后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光。

2 結(jié)果

2.1 三棱有效成分及其可能的作用靶點(diǎn)

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取中藥三棱中所含有的化合物,以ADME屬性進(jìn)行篩選,最終獲得5個(gè)活性成分(表1),包括常春藤皂苷元(Hederagenin)、β-谷甾醇(β-Sitosterol)、刺芒柄花素(Formononetin)、豆甾醇(Stigmasterol)、反式-11-二十碳烯酸(trans-Gondoic acid),將三棱有效成分的蛋白靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)中,轉(zhuǎn)化為基因名稱,刪除重復(fù)值,最終得到70個(gè)藥物作用靶點(diǎn)(圖1)。

圖1 三棱活性成分潛在靶點(diǎn)圖Fig.1 Potential targets map of active ingredients in Sparganii Rhizome

表1 中藥三棱主要活性成分Table 1 Main active ingredients in Sparganii Rhizome

2.2 三棱-黑色素瘤靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中以“melanoma”為關(guān)鍵詞共檢索出6 385個(gè)黑色素瘤相關(guān)靶點(diǎn),Score值越高則代表該靶點(diǎn)與疾病聯(lián)系越密切,在靶點(diǎn)過(guò)多的情況下,根據(jù)經(jīng)驗(yàn),選擇卡4次中位數(shù),得到399個(gè)與黑色素瘤相關(guān)最高的靶點(diǎn)。通過(guò)Cytoscape3.7.2軟件中的Bisogenet插件,分別構(gòu)建三棱活性化合物靶點(diǎn)PPI和黑色素瘤靶點(diǎn)PPI。將2個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)相交得到Merge網(wǎng)絡(luò)圖。使用CytoNCA插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)中所有點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行分析,選擇度值≥68作為篩選核心靶點(diǎn)的條件,得到605個(gè)節(jié)點(diǎn)、24 732條邊組成的PPI網(wǎng)絡(luò),進(jìn)一步采用中位數(shù)法進(jìn)行篩選,設(shè)置DC>109,BC>0.000 789 09,CC>0.472,NC>122.688,LAC>20.882,得到由86個(gè)節(jié)點(diǎn)、828條邊組成的核心PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2),涉及到的核心節(jié)點(diǎn)包括RPL6、PARP1、KDM1A、HIF1A、MAP3K1等基因,提示三棱可能通過(guò)作用于這些蛋白發(fā)揮治療黑色素瘤的作用。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)篩選圖Fig.2 Core targets of PPI network

2.3 三棱-黑色素瘤靶點(diǎn)功能與通路的富集分析

將核心PPI網(wǎng)絡(luò)中的基因輸入DAVID平臺(tái)進(jìn)行KEGG通路富集分析,選取P<0.05且基因富集度較高的20條信號(hào)通路(圖3),主要包括代謝相關(guān)通路、p53信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路、凋亡、HIF-1信號(hào)通路、細(xì)胞周期、mTOR信號(hào)通路,表明三棱中活性成分通過(guò)多種途徑發(fā)揮抗黑色素瘤的作用,隨后圍繞預(yù)測(cè)結(jié)果中的代謝相關(guān)通路設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

注：與對(duì)照組相比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。圖3 KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.3 KEGG pathway enrichment analysis

2.4 三棱提取物對(duì)A375細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

CCK8結(jié)果顯示,不同濃度的三棱提取物分別作用A375細(xì)胞24 h后,給藥濃度達(dá)到400 μg·mL-1時(shí)對(duì)細(xì)胞的活力產(chǎn)生了顯著抑制作用(圖4),在給藥48h后,三棱提取物濃度在200 μg·mL-1時(shí)便顯著抑制了細(xì)胞的增殖。EdU增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖5),與對(duì)照組(71.77±3.56)%相比,給藥組200、400 μg·mL-1處理A375細(xì)胞24 h后,EdU陽(yáng)性細(xì)胞率顯著降低,分別為(56.93±7.65)%、(39.23±6.47)%,表明三棱提取物可劑量依賴性抑制A375細(xì)胞的增殖。

注：與對(duì)照組相比,圖4 不同濃度三棱提取物分別在24、48 h對(duì)A375細(xì)胞活力的影響Fig.4 Effects of different concentrations of Sparganii Rhizome extract on A375 cell viability at 24 h and 48 h

注：與對(duì)照組相比,圖5 三棱提取物對(duì)A375細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Effect of Sparganii Rhizome extract on proliferation of A375 cells

2.5 三棱提取物對(duì)A375細(xì)胞能量代謝的影響

利用Seahorse XF儀器,程序性加入糖酵解抑制劑以及線粒體氧化磷酸化抑制劑,實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞外氫離子濃度,以胞外酸化率(ECAR)表示A375細(xì)胞的糖酵解能力,同時(shí)測(cè)定細(xì)胞的氧氣消耗速率,以細(xì)胞耗氧量(OCR)表示細(xì)胞的線粒體呼吸能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示,三棱提取物能夠顯著降低A375細(xì)胞的ECAR,降低了細(xì)胞的糖酵解能力和糖酵解儲(chǔ)備。同時(shí)三棱提取物還降低了A375細(xì)胞的OCR,降低了細(xì)胞的基礎(chǔ)耗氧量和最大耗氧量,影響了其線粒體氧化磷酸化過(guò)程。

圖6 三棱提取物對(duì)A375細(xì)胞ECAR、OCR的影響Fig.6 Effect of Sparganii Rhizome extract on ECAR and OCR of A375 cells

2.6 三棱提取物對(duì)A375細(xì)胞糖酵解代謝產(chǎn)物的影響

腫瘤細(xì)胞大量攝入葡萄糖,通過(guò)糖酵解途徑生成丙酮酸,最終在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)化為乳酸,過(guò)程中伴有ATP的生成。因此,本研究通過(guò)試劑盒檢測(cè)黑色素瘤細(xì)胞A375的葡萄糖消耗量以及丙酮酸、乳酸、ATP生成量來(lái)考察三棱提取物對(duì)黑色素瘤細(xì)胞有氧糖酵解的影響。結(jié)果如圖7所示,三棱提取物劑量依賴性降低了A375細(xì)胞的葡萄糖消耗量和丙酮酸、乳酸、ATP的生成,表明給予三棱提取物后,降低了A375細(xì)胞的糖酵解活動(dòng)。

注：與對(duì)照組相比,圖7 三棱提取物對(duì)A375細(xì)胞葡萄糖攝取、乳酸、丙酮酸、ATP生成的影響Fig.7 Effects of Sparganii Rhizome extract on glucose uptake, lactic acid, pyruvate and ATP production in A375 cells

2.7 三棱提取物抑制A375細(xì)胞糖酵解的內(nèi)在機(jī)制

糖酵解過(guò)程中存在3個(gè)關(guān)鍵激酶,分別調(diào)控著3個(gè)不可逆步驟,包括己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK),酶活性檢測(cè)試劑盒結(jié)果表明(圖8),不同濃度三棱提取物對(duì)A375細(xì)胞的HK和PFK活性沒(méi)有影響,但對(duì)PK活性具有顯著抑制作用,且呈劑量依賴性。Western blot結(jié)果表明(圖9),三棱提取物劑量依賴性地抑制了A375細(xì)胞中PKM2蛋白表達(dá)水平,同時(shí)降低了下游乳酸脫氫酶(LDHA)和單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MCT4)的表達(dá)。

注：與對(duì)照組相比,圖8 三棱提取物對(duì)A375細(xì)胞糖酵解關(guān)鍵激酶活性的影響Fig.8 Effect of Sparganii Rhizome extract on glycolytic key kinase activity in A375 cells

注：與對(duì)照組相比,圖9 三棱提取物對(duì)A375細(xì)胞糖酵解關(guān)鍵激酶表達(dá)的影響Fig.9 Effect of Sparganii Rhizome extract on expression of glycolytic key kinases in A375 cells

3 討論

惡性黑色素瘤在中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)上并無(wú)統(tǒng)一稱謂,一般歸屬于“脫癰”“厲癰”“翻花”“黑子”等范疇,中醫(yī)對(duì)于黑色素瘤的認(rèn)知源遠(yuǎn)流長(zhǎng),早在兩千多年前的《黃帝內(nèi)經(jīng)》中就有關(guān)于“厲癰”和“脫癰”的記載。中醫(yī)在治療黑色素瘤上具有不易產(chǎn)生耐藥性、副作用小、個(gè)體化靶向治療等優(yōu)點(diǎn),近年來(lái),中藥提取物成為中醫(yī)治療黑色素瘤的新途徑[13]。因此,從數(shù)目眾多的中藥中篩選出符合臨床要求的抗黑色素瘤藥物具有重要的臨床價(jià)值。

三棱對(duì)黑色素瘤具有潛在的治療作用,但其主要活性成分和可能的抗癌機(jī)制尚不清楚。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,獲取三棱中5個(gè)主要活性化合物,包括常春藤皂苷元、β-谷甾醇、刺芒柄花素、豆甾醇、反式-11-二十碳烯酸,這5種成分可能是三棱發(fā)揮治療黑色素瘤療效的物質(zhì)基礎(chǔ)。Cheng等[14]研究發(fā)現(xiàn),常春藤皂苷元通過(guò)降低乳腺癌細(xì)胞線粒體中Apaf-1和Cyto-C蛋白水平,并增加caspase-3和caspase-9的活性,從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。β-谷甾醇通過(guò)干擾多種信號(hào)通路,包括細(xì)胞周期、凋亡、增殖、侵襲、血管生成、轉(zhuǎn)移和炎癥,發(fā)揮抗腫瘤作用,且因?yàn)槠涠靖弊饔幂^低,在抗癌營(yíng)養(yǎng)品領(lǐng)域具有較高研究?jī)r(jià)值[15]。刺芒柄花素通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平[16]、調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路[17]、誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯[18]等多環(huán)節(jié)抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展。張碩等[19]發(fā)現(xiàn)豆甾醇能夠顯著上調(diào)抑癌基因NF-2及磷酸激酶Map2k6的表達(dá),同時(shí)降低fos、myc、ras等癌基因的表達(dá),在體內(nèi)外對(duì)肝細(xì)胞均有一定的抑制效果。而反式-11-二十碳烯酸在抗腫瘤方面目前尚無(wú)明確的報(bào)道,值得進(jìn)一步研究其潛在的作用機(jī)制。

本研究對(duì)三棱-黑色素瘤PPI網(wǎng)絡(luò)的核心靶點(diǎn)進(jìn)行了KEGG通路富集分析,結(jié)果表明,三棱防治黑色素瘤的作用靶點(diǎn)包括RPL6、PARP1、KDM1A、HIF1A、MAP3K1等基因,作用途徑涉及糖酵解/糖異生相關(guān)代謝通路、p53信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、mTOR信號(hào)通路等。同時(shí),現(xiàn)代研究報(bào)道,黑色素瘤表現(xiàn)出高糖酵解活性的代謝表型[20],針對(duì)這種代謝特點(diǎn)采取相應(yīng)的治療手段或許是未來(lái)治療黑色素瘤的重點(diǎn)策略[21]。因此,本研究進(jìn)一步考察了三棱對(duì)黑色素瘤代謝的影響,結(jié)果表明,三棱提取物劑量依賴性的減少了A375細(xì)胞葡萄糖攝取,降低了糖酵解代謝關(guān)鍵產(chǎn)物丙酮酸、乳酸、ATP的生成量,且對(duì)糖酵解過(guò)程中的丙酮酸激酶有顯著的抑制作用。同時(shí),三棱提取物還抑制了丙酮酸向乳酸的轉(zhuǎn)化及乳酸的外排功能,降低了胞外酸化率,最終抑制了細(xì)胞的增殖。

綜上所述,本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法獲取了中藥三棱治療黑色素瘤的主要活性成分、作用靶點(diǎn)及相關(guān)通路,體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn),并通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了三棱提取物對(duì)A375細(xì)胞糖酵解代謝的抑制作用,證實(shí)了三棱治療黑色素瘤可能與改變腫瘤細(xì)胞的代謝方式有關(guān),為進(jìn)一步研究破血藥三棱在治療黑色素瘤方面的應(yīng)用提供了思路和理論依據(jù)。