李 波，劉 暢，馮成龍, 李?yuàn)檴櫍?金姍姍，趙金諾，劉家佑，張君輝, 姜思琦, 石婉瑩

(齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

溫度是影響植物生長(zhǎng)的重要因素，高溫導(dǎo)致植物葉片及根系生長(zhǎng)受阻，使植物抗病蟲(chóng)能力下降，產(chǎn)量降低[1]。紫花苜蓿是世界上種植范圍最廣、經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高的優(yōu)質(zhì)豆科牧草，但高溫限制了苜蓿(MedicagoSativaL.)種植范圍并影響其鮮草的產(chǎn)量及質(zhì)量[2]，因此應(yīng)加快對(duì)耐高溫苜蓿新品種或品系的選育。輻射育種是利用物理誘變因子引起作物染色體、基因和細(xì)胞質(zhì)異變，從而獲得性狀改善的方法。輻射育種中60Co-γ輻射是最為有效的方法之一[3]，利用60Co-γ射線能選育出性狀優(yōu)良的牧草新品種，謝新春等[4]研究60Co-γ射線誘導(dǎo)結(jié)縷草(ZoysiaJaponicaS.)性狀變異，獲得綜合性狀良好突變株‘80-1’和‘10-1’。輻射處理可以誘發(fā)植物遺傳物質(zhì)改變，組織培養(yǎng)過(guò)程中也能夠產(chǎn)生一些變異，將兩者結(jié)合起來(lái)進(jìn)行雙重變異，可以在有限的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行大群體篩選，從而提高輻射誘變的效率[5-6]，但關(guān)于此方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。由于體細(xì)胞無(wú)性系變異的發(fā)生往往沒(méi)有方向性, 變異類(lèi)型繁多, 且劣變機(jī)率大于優(yōu)變, 而用于植物育種目標(biāo)的變異則必須是優(yōu)良性狀[7-8], 因此對(duì)變異進(jìn)行有效的篩選至關(guān)重要。采用高溫等環(huán)境處理，獲得抗性愈傷組織或抗性細(xì)胞系，然后再生獲得抗性突變株，該方法主要用于抗逆性選育，篩選得到的突變體一般要進(jìn)行生理生化和分子生物學(xué)的鑒定[9-10]，為進(jìn)一步育種應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。楊曦[11]通過(guò)對(duì)愈傷組織進(jìn)行高溫脅迫處理，獲得了茶用菊花(Chrysanthemum) 耐熱變異體，潘林等[12]研究輻射苜蓿愈傷組織對(duì)高溫脅迫的生理響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)一定輻射劑量可以提高苜蓿愈傷組織耐高溫能力。

畜牧業(yè)的發(fā)展長(zhǎng)期受到飼料供應(yīng)短缺和對(duì)國(guó)外依賴(lài)度高的制約，因而選育適合高溫地區(qū)生長(zhǎng)的優(yōu)質(zhì)牧草具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本研究探究60Co-γ輻射處理和高溫環(huán)境下紫花苜蓿分化苗生理特征，以期為探討苜蓿耐高溫馴化的途徑及運(yùn)用輻射處理來(lái)提高苜蓿耐高溫能力提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 苜蓿種子培養(yǎng)

60Co-γ 射線輻射的龍牧 806 苜蓿(MedicagoSativaL.)種子于 2017 年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院原子能利用研究所進(jìn)行輻射處理，將同批次的輻射(輻射劑量為600 Gy和800 Gy，劑量率為15 Gy·min-1)和未輻射苜蓿種子種植在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院試驗(yàn)基地，收獲后獲得輻射第二代(M2)和未輻射的苜蓿種子。將以上苜蓿種子用35℃溫水浸泡2 h，播種于育苗盆中(營(yíng)養(yǎng)土∶珍珠巖=2∶1)，每盆播30粒種子，每個(gè)劑量10盆，置于溫室內(nèi)培養(yǎng)75 d后篩選變異植株，將獲得的高株G3(800 Gy)和G4(600 Gy)的葉片愈傷組織分化組培苗[13]，對(duì)照為未輻射苜蓿植株葉片愈傷組織分化組培苗,分別記為G3、G4、CK，見(jiàn)圖1。

圖1 苜蓿分化苗

1.2 高溫脅迫溫度及時(shí)間的選擇

將CK分化苗接種于MS基本培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)瓶接種6個(gè)單芽莖段，待培養(yǎng)至帶有4～5個(gè)莖節(jié)和根系時(shí)，將相同數(shù)量的分化苗培養(yǎng)瓶分別置入25、30、35、40、45℃光照周期為12 h/12 h的光照培養(yǎng)箱中，各培養(yǎng)1、2、3、4、5、6 d，高溫脅迫結(jié)束后統(tǒng)計(jì)存活率，確定有效的高溫脅迫溫度和天數(shù)。

將CK、G3和G4分化苗分別在篩選的溫度和天數(shù)下進(jìn)行高溫脅迫，以未高溫處理的CK、G3和G4分化苗為對(duì)照。

1.3 生理生化指標(biāo)的測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定可溶性蛋白(Soluble protein，SP)含量；可溶性糖(Soluble sugar，SS)含量采用蒽酮比色法測(cè)定；Pro 含量采用酸性茚三酮法(Proline，Pro)測(cè)定；相對(duì)電導(dǎo)率(Relative conductivity，RC) 采用電導(dǎo)法測(cè)定; MDA ( Malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定；過(guò)氧化物酶(Peroxidase，POD) 活性采用愈創(chuàng)木酚比色法測(cè)定；過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT)活性采用分光光度法測(cè)定；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD) 活性采用 NBT 光化還原法[14]測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行顯著性分析和相關(guān)性分析。對(duì)測(cè)得數(shù)據(jù)用模糊數(shù)學(xué)隸屬度公式進(jìn)行轉(zhuǎn)換,隸屬函數(shù)公式為:

U(Xij)=(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)

反隸屬函數(shù)公式為：

U′(Xij)=1-(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)

式中,U(Xij),U′(Xij)分別為第i個(gè)脅迫處理的j項(xiàng)指標(biāo)的隸屬值和反隸屬值,Xmin和Xmax分別為j項(xiàng)指標(biāo)的最小值和最大值。

耐高溫系數(shù)=(不同脅迫處理下平均測(cè)定值/對(duì)照平均測(cè)定值)×100%

權(quán)重系數(shù)Wi=Ri/∑R，Wi為i指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，Ri為某一指標(biāo)的權(quán)重，∑R為各指標(biāo)的總權(quán)重。

綜合評(píng)價(jià)(D)=隸屬函數(shù)值×權(quán)重系數(shù)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0和Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析法(ANOVA)比較不同處理間的差異顯著性，P<0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫溫度及時(shí)間的確定

CK分化苗在不同溫度處理下，對(duì)苜蓿分化苗存活率產(chǎn)生一定的影響。25～35℃分化苗處理1、2、3、4、5 d和6 d的存活率均為100%，40℃高溫脅迫下分化苗處理1、2、3、4 d和5 d的存活率分別為100%、100%、80%、64%和22%，時(shí)間再延長(zhǎng)分化苗無(wú)法存活；在45℃高溫處理1 d存活率極低，2～6 d存活率均為0。根據(jù)40℃處理1～6 d分化苗存活率，繪制存活率與處理時(shí)間關(guān)系圖(圖2)，依據(jù)回歸方程(y=-25.8x+155.6，R2=0.9854)可知40℃下半致死脅迫天數(shù)為4.09 d，致死脅迫天數(shù)為6.03 d，因此選擇40℃高溫處理1～4 d的分化苗進(jìn)行生理生化指標(biāo)測(cè)定分析。

圖2 苜蓿分化苗在40℃高溫脅迫下存活率的變化

2.2 輻射和高溫脅迫對(duì)苜蓿分化苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

SP，SS和Pro在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)積累，作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可調(diào)控植物抗逆能力。高溫對(duì)苜蓿分化苗SP、SS和Pro含量影響見(jiàn)圖3，在40℃高溫脅迫下，3組苜蓿分化苗(CK，G3，G4)SP含量均隨高溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈先增后降的變化趨勢(shì)，SP和SS含量分別在高溫脅迫2 d和3 d達(dá)最大值，CK分化苗Pro含量在高溫脅迫2 d達(dá)最大值，G3、G4分化苗在高溫脅迫3 d達(dá)最大值。G3和G4分化苗在未高溫脅迫下，SP含量分別為CK的2.49倍和7.32倍，SS含量分別為CK的1.44倍和2.12倍，Pro含量分別為CK的1.55倍和1.32倍，輻射苜蓿分化苗的SP、SS和Pro均高于未輻射苗。

注：圖中不同小寫(xiě)字母表示各處理在不同脅迫時(shí)間下差異顯著(P<0.05), 下同。

在40℃高溫脅迫下，G3和G4分化苗SP含量均高于CK，脅迫3 d分化苗SP含量最高，CK、G3、G4分化苗SP含量較其未脅迫組分別增加了530.78%、235.74%和21.32%(P<0.05)；在高溫脅迫的不同持續(xù)天數(shù)，3組分化苗SS和Pro含量變化無(wú)明顯規(guī)律，CK、G3和G4分化苗在高溫脅迫3 d時(shí)，SS含量較其未脅迫組分別增加了157.16%、79.21%和61.52%(P<0.05), Pro含量較其未脅迫組分別增加了438.55%、323.64%和356.36%(P<0.05)，SP和SS含量為G4>G3>CK，Pro含量為G3>G4>CK，此脅迫時(shí)間下的G3和G4的3種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)均高于CK，說(shuō)明一定高溫脅迫可增加苜蓿分化苗的SP、SS和Pro。

2.3 輻射和高溫脅迫對(duì)苜蓿分化苗膜脂透性的影響

MDA含量和RC高低可以反映植物遭受逆境傷害的程度。高溫對(duì)苜蓿分化苗MDA含量和RC影響見(jiàn)圖4，3組苜蓿分化苗的MDA含量和RC均隨高溫脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈增加的趨勢(shì)，在高溫脅迫4 d達(dá)到最大值。G3和G4分化苗在未高溫脅迫下的MDA含量分別為CK的1.07倍和1.19倍，RC為CK的91%和98%，說(shuō)明一定輻射劑量可增加膜脂氧化和膜透性。

圖4 輻射和高溫脅迫下苜蓿分化苗MDA含量和RC的變化

在40℃高溫脅迫4 d時(shí)，CK、G3和G4分化苗的MDA含量較其未脅迫組分別增加了80.86%，36.53%和61.08%(P<0.05), RC較其未脅迫組分別增加了23.75%、25.66%和21.55%(P<0.05), MDA含量為G4>CK>G3，RC含量為CK>G4>G3，表明一定的輻射劑量可以緩解高溫脅迫對(duì)苜蓿分化苗細(xì)胞膜的損傷。

2.4 輻射和高溫脅迫對(duì)苜蓿分化苗抗氧化酶活性的影響

逆境脅迫下抗氧化酶活性高低與植物抗逆性密切相關(guān)。高溫對(duì)苜蓿分化苗POD和SOD活性的影響見(jiàn)圖5，3組苜蓿分化苗(CK，G3，G4)POD和SOD活性均隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈先增后降趨勢(shì)，在40℃高溫脅迫下，CK，G3和G4分化苗POD和SOD活性在高溫脅迫2 d或3 d達(dá)最大值。G3和G4分化苗在未高溫脅迫下，POD活性分別為CK的1.19倍和1.68倍，SOD活性分別為CK的56%和82%，輻射苜蓿分化苗的POD和SOD活性均高于未輻射苗。在40℃高溫脅迫3 d時(shí)，CK、G3和G4分化苗的POD活性較其未脅迫組分別增加了59.58%、82.87%和130.52%(P<0.05)，SOD活性較其未脅迫組分別增加了114.28%、350.91%和160.00%(P<0.05), 3組分化苗的各脅迫組POD活性為G4>G3>CK，SOD活性變化不一，但一定的輻射劑量可增加苜蓿分化苗的POD和SOD活性。

輻射和高溫對(duì)苜蓿分化苗CAT活性的影響見(jiàn)圖5，高溫處理3組苜蓿分化苗(CK，G3，G4)CAT活性均隨脅迫時(shí)間的增加呈降低的變化趨勢(shì)，在高溫脅迫4 d達(dá)最小值。G3和G4分化苗在未高溫脅迫下，G3和G4分化苗的CAT活性分別為CK的89%和82%；高溫脅迫4 d時(shí)，CK、G3和G4分化苗的CAT活性較其未脅迫組增降低了81.68%、65.57%和69.58%(P<0.05)，3組分化苗各脅迫組的CAT活性變化不一致，高溫脅迫降低了CAT活性，但一定的輻射劑量可增加苜蓿分化苗CAT活性。

圖5 輻射和高溫脅迫下苜蓿分化苗抗氧化酶活性的變化

2.5 高溫脅迫苜蓿分化苗耐熱系數(shù)

耐熱系數(shù)的變化反映了植物在面對(duì)高溫環(huán)境時(shí)的耐熱能力，3組分化苗耐熱系數(shù)的變化值見(jiàn)表1。與CK相比，高溫脅迫不同時(shí)間后的苜蓿分化苗各指標(biāo)耐熱系數(shù)均發(fā)生不同程度改變，SP、SS、Pro、POD和SOD這5項(xiàng)指標(biāo)呈先升后降現(xiàn)象，CAT指標(biāo)呈下降，而MDA和RC呈升高趨勢(shì)，表明高溫脅迫下苜?？赏ㄟ^(guò)植株自身的生理響應(yīng)來(lái)抵抗逆境。依據(jù)3種苜蓿分化苗各單項(xiàng)指標(biāo)耐熱系數(shù)的變化幅度，得出各單項(xiàng)指標(biāo)對(duì)高溫脅迫的敏感程度，結(jié)果為SP>Pro>SS>POD>SOD>MDA>RC>CAT，表明苜蓿的SP和Pro對(duì)高溫脅迫的敏感性較大，CAT較小。

表1 苜蓿分化苗耐熱系數(shù)

2.6 高溫脅迫苜蓿分化苗抗性綜合分析

采用隸屬函數(shù)法和綜合D值法，對(duì)3組苜蓿分化苗在高溫脅迫下的生理生化指標(biāo)變化進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)(表2)。CK，G3和G4分化苗各項(xiàng)指標(biāo)的隸屬函數(shù)平均值分別為0.168，0.700和0.668，各項(xiàng)指標(biāo)的綜合D值分別為0.219，0.694和0.669，3組分化苗的抗性綜合評(píng)價(jià)由大到小依次為G3>G4>CK，輻射可提高苜蓿分化苗的耐熱能力，其中G3分化苗抗性最高。

表2 苜蓿分化苗8項(xiàng)指標(biāo)的隸屬函數(shù)值

3 討 論

植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中難免遭遇各種逆境脅迫，隨著全球氣候變暖，極端溫度日益增加，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育造成不利影響。培育抗逆境脅迫牧草品種是牧草抗逆育種研究的重要方向。組織培養(yǎng)技術(shù)結(jié)合輻射誘變進(jìn)行育種，可增加后代選擇機(jī)會(huì)，縮短牧草育種周期[15]，從植物細(xì)胞中篩選出抗逆境強(qiáng)的突變體，現(xiàn)已成為植物品種改良和新品種選育的新途徑。對(duì)于輻射后代苜蓿愈傷組織分化苗而言，研究高溫脅迫下分化苗生理生化指標(biāo)的變化，有助于了解輻射和高溫雙重作用后苜蓿分化苗的生理?yè)p傷機(jī)制。

為適應(yīng)復(fù)雜多變的環(huán)境，植物在滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)上發(fā)生與之相應(yīng)的改變來(lái)適應(yīng)環(huán)境，一定輻射劑量和高溫逆境脅迫下植物葉片可積累SP、SS和 Pro等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，通過(guò)提高細(xì)胞滲透壓來(lái)維持細(xì)胞的持水力和水分代謝平衡[16-17]，減輕輻射和高溫脅迫對(duì)植物的傷害。已有研究表明，輻射處理多花野牡丹(MelastomaaffineL.)種子幼苗SP和SS隨著輻射劑量的增加呈先升后降的趨勢(shì)[18]，高溫脅迫導(dǎo)致羊棲菜(SargassumfusiformeO.)細(xì)胞內(nèi)積累了SP、SS和Pro等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[19]，說(shuō)明在適宜輻射劑量和高溫下依然可以維持一定的正常代謝，這與本研究中所篩選的獲得輻射的G3和G4苜蓿分化苗和高溫脅迫苜蓿分化苗積累更多的3種調(diào)節(jié)物質(zhì)的研究結(jié)果一致，且輻射可促進(jìn)高溫脅迫的G3和G4分化苗SS、SP和Pro的積累，與韓亞楠[20]研究60Co-γ輻射對(duì)鹽脅迫下烏拉爾甘草(GlycyrrhizauralensisF.)耐鹽性的影響中合成脯氨酸方式減少離子毒害的研究結(jié)果相似。

輻射和高溫超過(guò)植物的耐受能力后，會(huì)使其膜系統(tǒng)受到傷害，電解質(zhì)從細(xì)胞內(nèi)滲出，引起組織浸出液電解質(zhì)濃度增加，反映在相對(duì)電導(dǎo)率升高、植物膜系統(tǒng)受損，還可造成膜脂過(guò)氧化，MDA是膜脂過(guò)氧化作用的產(chǎn)物[21]，其含量增加是膜脂過(guò)氧化的表現(xiàn)，因此RC和MDA含量高低可衡量細(xì)胞膜損傷程度，與植物的抗逆性呈負(fù)相關(guān)。張秀梅等[22]通過(guò)60Co-γ輻射對(duì)洋竹草(CallisiarepensJacqL.)生理影響的研究表明，輻射提高了各處理MDA含量和RC，MDA含量及RC呈不斷升高的趨勢(shì)，且在 38℃高溫脅迫 15 d 時(shí)達(dá)到最大值，這與本研究中所獲得的輻射G3和G4苜蓿分化苗和高溫脅迫苜蓿分化苗的MDA和 RC的增加研究結(jié)果一致，且輻射和高溫雙重作用下，G3和G4分化苗的MDA和 RC增加。鄭鳳霞[23]研究低劑量60Co-γ輻照對(duì)擬南芥幼苗耐熱性的影響，在40℃ 6 h熱脅迫下，50 Gy60Co-γ輻射的擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)幼苗中MDA明顯低于CK，進(jìn)一步證明低劑量的60Co-γ輻射能夠減輕熱脅迫對(duì)植物造成的損傷，與本研究中800 Gy輻射劑量下的高溫脅迫可降低對(duì)苜蓿分化苗的細(xì)胞膜氧化損傷研究結(jié)果一致。

POD、SOD和CAT是植物細(xì)胞內(nèi)清除活性氧的重要保護(hù)酶，在輻射和高溫一定限度內(nèi)，保護(hù)酶可誘導(dǎo)生理反應(yīng)，使植物避免活性氧自由基對(duì)自身的傷害[23-24]。已有研究表明，60Co-γ射線對(duì)露地菊(Dendranthema×grandifloraGround-growChrysanthemum)品種輻射誘變效應(yīng)[25]中，SOD和CAT活性呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，POD活性隨輻射劑量增加呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，高溫脅迫對(duì)絲瓜(LuffacylindricaR.)幼苗抗氧化酶活性研究中[26]，隨高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD、POD和CAT活性均呈先升后降的趨勢(shì)，SOD和POD活性均在脅迫3 d時(shí)達(dá)到峰值，CAT活性在脅迫1 d時(shí)達(dá)到峰值，本試驗(yàn)中高溫使苜蓿分化苗正常的氧代謝受到干擾，逆境初期POD 和SOD活性升高，表現(xiàn)為保護(hù)效應(yīng)CAT 降低，隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，POD、CAT和SOD活性逐漸降低，使自由基積累和MDA 含量顯著增加，細(xì)胞膜系統(tǒng)損傷，加重了苜蓿分化苗傷害。鄭鳳霞[23]研究低劑量60Co-γ輻照對(duì)擬南芥幼苗耐熱性的影響，在40℃、6 d熱脅迫下50 Gy60Co-γ輻射的擬南芥幼苗中SOD、POD和CAT的活性明顯高于CK，表明了低劑量的60Co-γ輻射能夠增強(qiáng)植物的抗氧化酶活性，與本研究中一定輻射劑量苜蓿分化苗在40℃、4 d熱脅迫下SOD和POD的活性變化結(jié)果一致，而與CAT的活性變化存在差異。

4 結(jié) 論

對(duì)苜蓿分化苗進(jìn)行高溫脅迫和分化苗存活率及生理生化指標(biāo)變化分析，綜合評(píng)價(jià)輻射分化苗對(duì)高溫脅迫抗性。依據(jù)高溫對(duì)苜蓿分化苗存活率影響，確定模擬高溫脅迫進(jìn)程為40℃、4 d；高溫脅迫對(duì)CK、G3和G4分化苗的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、膜脂透性和抗氧化酶活性產(chǎn)生不同影響。對(duì)8項(xiàng)生理生化指標(biāo)的綜合分析表明，G4平均隸屬函數(shù)值和綜合D值最高，分別為0.793和0.852，3組分化苗耐高溫能力排序?yàn)镚4>G3>CK，說(shuō)明一定輻射劑量可以提高苜蓿分化苗的抗性。