柴乖強，秦媛媛，康雨欣，黃 凡，段義忠，亢福仁

(1. 榆林學院生命科學學院，陜西 榆林 719000；2. 陜西省陜北礦區(qū)生態(tài)修復重點實驗室，陜西 榆林 719000)

隨著全球氣候逐年變暖，越來越多的植物正遭受著干旱、高熱、高鹽等非生物逆境脅迫[1]。非生物脅迫可引發(fā)植物體多種形態(tài)生理變化，如葉片萎蔫、葉片脫落、相對含水量(RWC)降低、葉綠素含量和膜穩(wěn)定性降低、電解質滲漏增加和活性氧(ROS)的產生等[2-3]。植物在受到逆境脅迫時，從周圍環(huán)境感知信號并適當地通過調節(jié)相關基因的表達，建立相應的防御機制[4]。轉錄因子能夠結合到特定順式作用元件，激活并調節(jié)下游大量基因表達，進而增強了植物對脅迫環(huán)境的耐受性。一般來說，植物的抗旱性是由多個基因調控的復雜性狀，單個抗旱基因在植物抗旱過程中所起的作用比較有限[5]，而利用轉錄因子調控其下游抗旱相關功能基因來提高植物抗旱性已經是目前研究的熱點之一[6-7]。到目前為止，在植物中已經發(fā)現了許多重要的抗旱性基因。其中，干旱響應元件結合蛋白(Dehydration responsive element binding protein，DREB)家族存在于多種植物中，并在增強植物對各種非生物脅迫(包括干旱脅迫)的耐受性方面發(fā)揮著重要作用，DREB可以特異性地與啟動子中的DREB/CRT順式作用元件結合，激活逆境相關基因的表達，提高作物的抗性[8]。

研究發(fā)現，DREB轉錄因子廣泛參與調控生物和非生物脅迫應答以及ABA響應敏感性等各種反應。其中利用DREB2亞家族轉錄因子改良植物抗逆性也取得理想的效果。比如在模式作物水稻中過量表達OsDREB2A和OsDREB2B能顯著增強水稻對干旱、鹽堿和高溫環(huán)境的耐受性[9]。

油莎豆(Cyperusesculentus)又名虎堅果、油莎草、洋地栗和鐵荸薺等[10]，原產地是非洲尼羅河沿岸地區(qū)。油莎豆是一年生的塊莖類植物，屬于莎草科莎草屬[11]。油莎豆營養(yǎng)豐富，是一種優(yōu)質、高產、綜合利用價值高的油、糧、飼、藥多用新型經濟作物，產量遠高于其他油料作物，號稱“油料之王”。油莎豆具有較強的抗旱、耐瘠、耐鹽堿等特性，其對生長條件的要求不嚴格，甚至可以在沙漠荒地、鹽堿地和灘涂地上生長，因此成為研究植物抗逆性的理想材料。當前，國內外關于油莎豆的研究主要集中在栽培技術、營養(yǎng)品質分析、加工工藝、轉錄組測序及生物信息學分析等方面[12-13]。研究挖掘油莎豆耐逆相關基因，可以為今后培育植物抗旱種質提供新的基因資源。

目前油莎豆DREB轉錄因子的調控網絡和潛在的作用機理還不明晰，因此本研究基于課題組前期建立的油莎豆葉片轉錄組數據庫，并在分析DREB轉錄因子結構的基礎上，擬采用PCR擴增、生物信息分析、超表達載體構建和非生物脅迫誘導表達分析等方法，初步探究油莎豆CeDREB2.1的生物學功能，以期為解析CeDREB2.1參與抗逆的分子機制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

油莎豆品種‘榆引-1’(圖1，見15頁)，該品種莖葉叢生，分蘗能力極強，植株高度80～100 cm，生育期為150 d左右，根系發(fā)達，地下可形成塊莖，一般每蔸可結塊莖100～200粒，平均產量500～600 kg·667m-2。由陜西省陜北礦區(qū)生態(tài)修復重點實驗室種植并保存。

圖1 油莎豆材料‘榆引-1’

1.2 研究方法

1.2.1 油莎豆葉片總RNA的提取和cDNA的合成 將生長至有6～8片葉子的油莎豆幼苗進行干旱脅迫處理10 d，干旱脅迫后采取油莎豆幼嫩葉片，放置于液氮中，采用國產君諾德RNA(型號2117A,武漢君諾德生物科技有限公司)提取試劑盒，提取出油莎豆葉片總RNA，并使用反轉錄試劑盒合成cDNA，-20℃保存[14]。

1.2.2 油莎豆CeDREB2.1的克隆 根據課題組前期建立的油莎豆轉錄組數據庫，從中挖掘出在干旱脅迫下表達量高的一條DREB序列，命名為CeDREB2.1，并依據開放閱讀框設計特異引物F1:AATTTTGCGGACATGGGTGCTTA和R1: CAGTCATTCCGTTCTTGCGTTCC。以cDNA為模板，擴增CeDREB2.1基因，擴增體系為25 μL：(2×Pfu Mix 12.5 μL，dNTP 2 μL，引物F、R各1 μL，cDNA 0.5 μL，ddH2O 8 μL)。PCR反應程序為：(預變性94℃ 3 min,94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min，35循環(huán)；72℃ 10 min)，產物經1.0的瓊脂糖凝膠電泳檢測，并切膠回收目的片段。膠回收后的目標片段末端加A后，連接到EZ-T克隆載體上，轉化大腸桿菌DH5α細胞，在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)篩選出陽性克隆，并通過菌落PCR鑒定陽性克隆。最后挑選陽性克隆菌液，送至上海生物工程有限公司進行測序，挑出正確的CeDREB2.1基因序列。

1.2.3 油莎豆CeDREB2.1的生物信息學分析 分別通過ProtScale analysis(https://web.expasy.org/)、NPS-Prabi(https://npsa-prabi.ibcp.fr/)、SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/interactive)在線分析軟件對CeDREB2.1的親疏水性、二級結構和三級結構進行預測。同時分別運用DNAMAN和MEGA7.0分析CeDREB2.1的保守結構域和物種親緣關系。

1.2.4 植物遺傳表達載體的構建和農桿菌介導的遺傳轉化 利用高保真酶從測序成功的質粒上擴增CeDREB2.1目標片段，并對產物進行末端加A處理；同時，使用XcmⅠ對植物表達載體pCXSN進行酶切，回收酶切后的大片段，使用T4連接酶將CeDREB2.1目標片段與酶切回收的pCXSN進行連接[15]，連接產物轉化Top10感受態(tài)細胞，在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)篩選出陽性克隆，并通過菌落PCR篩選陽性克隆。最后挑選陽性克隆菌液，送至上海生物工程有限公司進行測序。農桿菌介導的擬南芥遺傳轉化試驗采用浸花法進行[15]。采用潮霉素平板對轉基因擬南芥T1和T2代種子進行篩選，獲得轉CeDREB2.1的純合株系，在T3代進行干旱脅迫處理，處理方法如下[4]：將T3代種子播于營養(yǎng)基質中，放于光照培養(yǎng)箱中(14 h/10 h光周期，光照強度8 000 Lx，溫度22℃，相對濕度50%～55%)生長約4周，再進行控水10 d處理，待大多數葉片萎蔫并開始變黃時，進行復水處理14 d。最后統(tǒng)計轉基因株系和對照的成活率。每個處理重復3次，每個重復選用16株轉基因植株。

1.2.5 油莎豆CeDREB2.1在轉基因擬南芥中的半定量表達分析 野生型Col-2和轉CeDREB2.1基因擬南芥葉片RNA的抽提采用國產君諾德RNA提取試劑盒進行，提取出擬南芥葉片總RNA后，使用反轉錄試劑盒合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆?。以擬南芥AtACTIN基因為內參，以上述轉基因擬南芥cDNA為模板，用Taq聚合酶進行擴增，反應體系(20 μL)為：Mix-Taq buffer(2×) 10 μL，引物F和R (10 pmol·μL-1)各1 μL，cDNA(10 ng·μL-1) 0.5 μL，ddH2O 7.5 μL。PCR反應程序參數為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃，40 s，循環(huán)數為30；72℃ 10 min，4℃永久保存。根據電泳結果，調整樣品cDNA的濃度，繼續(xù)完成PCR擴增，直至內參AtACTIN的電泳條帶亮暗完全一致時，以調整后的擬南芥cDNA為模板，用引物RT-CeDREB2.1(表1)進行擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測[16]，并照相保存。

1.2.6 油莎豆中CeDREB2.1的表達分析 選取約180粒飽滿的油莎豆種子，采用體積濃度10%的NaClO消毒后，播種于含有營養(yǎng)基質的花盆中，放置于科研溫室，正常澆水。待生長至5葉期后，將油莎豆幼苗從基質土中輕輕取出，清洗掉根上的基質土，進行逆境脅迫處理。對于干旱處理：取30株幼苗，每10株為一個生物學重復，用漂浮板固定好，將其漂浮在含有10%的PEG6000溶液中處理24 h；高溫和低溫處理：分別取30株油莎豆幼苗，將其漂浮在無菌水中，分別放置于42℃培養(yǎng)箱和4℃春化培養(yǎng)箱處理24 h；對于鹽脅迫和ABA處理：分別取30株油莎豆幼苗，用漂浮板固定好，將其漂浮在含有300 mM的NaCl和100 μM的ABA溶液中處理24 h；對照用無菌水處理24 h[17]。處理完成后，剪取葉片，用干凈的鋁箔紙包好，液氮速凍。每個處理取3個生物學重復。樣品RNA的抽提采用國產君諾德RNA提取試劑盒進行，提取出油莎豆葉片總RNA后，使用反轉錄試劑盒合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆肹10]。

選取油莎豆CsACTIN為內參，以相應的cDNA為模板，選用TaKaRa的SYBR? Premix Ex TaqTM II試劑盒，采用CFX96TM Real-Time PCR Detection System，進行qRT-PCR表達量分析(表1)。qPCR反應體系總體積為25.0 μL：cDNA(10 ng·μL-1)0.5 μL，SYBR? Premix Ex Taq(2×) 12.5 μL，引物F和R (10 pmol·μL-1)各1 μL，ddH2O 10 μL。qRT-PCR反應條件：95℃預變性30 s；95℃ 變性15 s，54℃退火30 s，65℃延伸10 s，共40個循環(huán)。每個處理設3個生物學重復。采用2-ΔΔCt法計算相對表達量。

表1 基因表達分析所使用的引物

1.3 數據處理

數據采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，采用SigmaPlot 12.5完成作圖。

2 結果與分析

2.1 油莎豆CeDREB2.1基因克隆

使用Tiagen TrizolRNA提取試劑盒提取油莎豆葉片總RNA，檢測RNA提取結果(圖2A)，3條條帶清晰明亮，說明RNA純度較高，可以進行后續(xù)的實驗。再用反轉錄試劑盒，將總RNA反轉錄成cDNA，并以稀釋6倍的cDNA為模板進行PCR擴增，得到一條長度約為1 200 bp的條帶(圖2 B)，條帶大小與預期相一致。

將擴增產物連接到EZ-T測序載體上，熱激法轉化大腸桿菌DH5α，轉化后取50μL均勻涂布在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)8～12 h，挑取單克隆菌落，利用菌液PCR篩選陽性克隆(圖2C)，選取3個陽性克隆送至上海生物工程有限公司測序檢測。測序成功后，將序列提交到NCBI數據庫中(登錄號為：MZ713253)，并將此基因命名為CeDREB2.1，其開放閱讀框長度為1 191 bp，編碼397個氨基酸。

注：A. 油莎豆葉片總RNA的檢測;B. CeDREB2.1的擴增PCR;C.連接測序載體后篩選陽性克隆。

2.2 油莎豆CeDREB2.1的生物信息學分析

利用ProtScale analysis軟件分析蛋白親疏水性，結果表明，CeDREB2.1編碼的多肽鏈中異亮氨酸(Ile)具有最高的分值4.500，疏水性最強；精氨酸(Arg)具有最低的分值-4.500，賴氨酸(Lys)分值為-3.900，該氨基酸序列內含有較多的親水區(qū)域(圖3 A)，表明油莎豆CeDREB2.1編碼為親水性蛋白。

使用ProtParam在線軟件分析，得出CeDREB2.1蛋白質的分子式為C1872H2873N537O647S17，分子量為43.80 kDa，理論等電點為4.67，編碼20種氨基酸，其中絲氨酸(Ser)含量最高(10.9%)。二級結構中，α螺旋(h)、延伸鏈(e)、β折疊(t)和無規(guī)卷曲(c)分別占26.01%、6.57%、2.78%和64.65%，可見無規(guī)卷曲和α螺旋是CeDREB2.1的大量結構元件(圖3 B)。CeDREB2.1三級結構預測分析表明，其與二級結構預測相似(圖3C)。

圖3 油莎豆CeDREB2.1的結構分析

同時通過在線軟件，對油莎豆CeDREB2.1的結構域進行分析，結果表明此蛋白有一個AP2/ERFBP結構域(圖4A，見17頁)，前人研究表明含有AP2結構域的蛋白廣泛存在于植物中，該結構域通常依賴于ABA、JA、SA和乙烯等激素來調控下游基因的表達，進而增強植物的抗逆能力[18-19]。將CeDREB2.1與已知生物學功能的其他植物如小麥、胡楊、楊樹、大豆、馬鈴薯、玉米、水稻、擬南芥、谷子、高粱、蘋果、向日葵等12個物種的DREB進行比對，發(fā)現莎豆CeDREB2.1與12個其他物種的DREB蛋白序列的相似性較高(圖4B，見17頁)。運用MEGA7.0軟件中的鄰接法(Neibor-Joining)算法構建系統(tǒng)進化樹(圖4C,見17頁)，結果表明，油莎豆CeDREB2.1與胡楊(Populuseuphratica)、楊樹(Populustrichocarpa)和蘋果(Malusdomestica)的DREB蛋白的親緣關系比較近。

圖4 油莎豆CeDREB2.1保守結構域預測和在不同物種間的系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3 油莎豆CeDREB2.1超表達載體的構建及功能驗證

根據CeDREB2.1序列的長度和超表達載體序列，選擇XcmⅠ進行單酶切pCSXN質粒(圖5A)，片段大小為5 kbp，大小與預期相符，并將大片段切膠回收。同時，擴增CeDREB2.1基因并做末端加A處理，再利用T4連接酶將pCSXN與CeDREB2.1連接，轉化大腸桿菌Top10，挑取單克隆并利用PCR篩選陽性克隆(圖5 B)。提取陽性克隆的質粒，將pCXSN-CeDREB2.1重組質粒用XcmⅠ酶做單酶切鑒定，切出的小片段與CeDREB2.1基因大小一致(圖5 C)，表明目的基因的超表達載體構建成功。

圖5 油莎豆pCSXN-CeDREB2.1超表達載體的構建

接著，將超表達載體轉入大腸桿菌GV3101中，利用農桿菌浸花法轉化擬南芥，并采用潮霉素對T1、T2代轉基因擬南芥種子進行篩選，同時結合PCR檢測(圖6B)，最終獲得轉CeDREB2.1基因植株，并在種植的T3代選擇兩個株系Line2和Line5，分別種植48株進行抗旱處理，并通過統(tǒng)計成活率對其表現型進行分析，結果表明，轉CeDREB2.1基因擬南芥株系在干旱10 d后并復水2周后，其成活率極顯著高于野生型(圖6A、6C)，說明CeDREB2.1在植物中具有抗旱的功能。

注：(A)轉CeDREB2.1擬南芥在干旱處理下的表型鑒定；(B)干旱脅迫處理下CeDREB2.1在擬南芥中的表達分析；(C)干旱脅迫處理后，擬南芥成活率統(tǒng)計分析。柱形圖上**表示數據間具有極顯著差異(P<0.01)。

2.4 油莎豆CeDREB2.1在不同逆境脅迫下的表達分析

為了研究CeDREB2.1基因在不同非生物脅迫下的表達差異，分別用10% PEG6000干旱模擬、300 mmol·L-1的NaCl鹽脅迫，100 μmol·L-1的ABA處理，高溫(42℃)和低溫(4℃)5種脅迫處理油莎豆幼苗24 h。分別采集脅迫處理后的油莎豆葉片提取出RNA，并反轉錄成cDNA后應用半定量RT-PCR和熒光定量PCR檢測CeDREB2.1在油莎豆中的表達量。RT-PCR結果表明，CeDREB2.1能夠被不同類型的脅迫誘導表達，誘導表達程度存在一定差異(圖7 A)，在干旱、低溫、高溫和鹽脅迫條件下，CeDREB2.1基因的表達量要高于ABA激素處理。熒光定量PCR結果和RT-PCR結果相似(圖7B)。說明CeDREB2.1基因參與油莎豆對多種非生物脅迫的響應過程。

3 討 論

隨著全球氣候的逐年變化，干旱、熱、冷、高鹽等極端環(huán)境也隨之頻繁發(fā)生，這些極端環(huán)境造成的滲透脅迫直接影響植物生長發(fā)育和作物的產量[20]。為了應對不利的外界環(huán)境，植物在生長發(fā)育過程中逐漸進化出一系列復雜且有序的生理生化機制來感應環(huán)境變化、抵御環(huán)境帶來的不利影響[21]。其中激活植物體內一些功能基因的表達，進而產生耐受性是對極端環(huán)境作出的響應之一[22]。目前為止，已經有很多基因和信號途徑參與了植物對逆境的調控，如NAC[23]、DREB[24]、MYB[25]、WRKY[26]、bZIP[27]等，其中DREB蛋白家族作為AP2/ERF亞家族之一，屬于植物適應逆境的關鍵調節(jié)因子，在調控非生物和生物脅迫反應中的發(fā)揮著重要作用，近年來受到了廣泛的關注和研究[28]。

研究表明，植物界中的DREB蛋白主要分為6個亞家族(A1～A6)，目前已知的大多數DREB均屬于A1和A2亞家族。其中擬南芥AtDREB1A/CBF3，屬于A1亞家族，能夠在冷脅迫下被誘導表達。DREB2A和DREB2B屬于A2亞家族，研究表明，這兩類基因能夠被干旱脅迫、熱脅迫、鹽脅迫、ABA等多種因素誘導表達，因此是比較重要的一類亞家族[4,29]。本實驗中，我們根據課題組前期建立的油莎豆轉錄組數據庫，從中挖掘出在干旱脅迫下表達量高的一條DREB序列，通過PCR擴增，從油莎豆葉片中克隆到一個DREB基因，命名為CeDREB2.1，通過同源序列比對，發(fā)現CeDREB2.1與其他物種中的DREB2具有較高的相似性，因此其屬于DREB家族中的A2亞家族。

植物的耐逆性是多個基因共同作用的結果，為了提高植物的抗旱性，可以選擇將抗旱相關的轉錄因子導入植物體內，獲得過量表達的植株，最終應用于生產。轉基因植物之所以能表現出較好的特性，是因為當植物受到脅迫時，這些應激反應基因表達上調，應激相關蛋白隨后與下游的靶蛋白相互作用，以減緩植物體內活性氧的積累，維持細胞內穩(wěn)態(tài)，最終增強植物對不利環(huán)境的耐受性[30]。其中，在DREB基因的應用方面，已經有許多抗旱基因被克隆出來，并且通過轉基因過表達、轉基因敲除或編輯技術，一部分基因的生物學功能已經明晰。在水稻中分別過表達OsDREB2A和OsDREB2B，轉基因植株在水分極度虧缺和高鹽脅迫下均表現出很高的存活率[31]。Zhou 等[32]將大豆GmDREB1轉入小麥中，不僅提高了小麥的產量，而且在干旱條件下小麥的各種生理狀態(tài)均顯著優(yōu)于對照，說明GmDREB1能增強作物的抗旱性。綜上，筆者推測從油莎豆中克隆的CeDREB2.1基因也可能參與調控油莎豆抵抗干旱、高溫、高鹽等非生物脅迫過程，因此在本試驗中，筆者成功地構建了CeDREB2.1的植物表達載體，并通過農桿菌浸花法將其轉入擬南芥中，獲得了T3代轉CeDREB2.1的純合株系，并通過干旱脅迫處理，發(fā)現轉CeDREB2.1的擬南芥植株具有較好的抗干旱能力，初步驗證了CeDREB2.1的生物學功能。

植物體內一些DREB2對外界不同脅迫會作出迅速的響應，如構樹BpDREB2對干旱和高鹽脅迫能作出較快的響應，在干旱條件下，BpDREB2的表達量在1～24 h間呈現先增高后降低的趨勢，并且在6 h時達到最大值。但是在外源激素ABA處理條件下，其表達量很低，說明構樹BpDREB2是不依賴于ABA的轉錄因子[33]。本研究對油莎豆CeDREB2.1在不同生物脅迫下的表達量進行了分析，結果表明CeDREB2.1對干旱、低溫、高溫、高鹽和ABA均能作出響應，說明CeDREB2.1是一種依賴于激素ABA的轉錄因子，這與Li等[34]的結論相似，而與Cortés等[35]研究的結論不同，這可能是與植物體內的可變剪接所引起的核酸多樣性有關。綜上所述，本研究從油莎豆中克隆出一個CeDREB2.1基因，為進一步研究油莎豆抗旱特性，并且從分子水平上驗證其生物學功能和抗旱新品種培育提供了新的思路。

共同第一作者貢獻說明：柴乖強博士和秦媛媛碩士共同完成了本實驗的實施和論文寫作等過程。其中柴乖強博士主要完成基因的克隆、表達分析、表達載體的構建和擬南芥的遺傳轉化工作；秦媛媛碩士主要完成了轉基因擬南芥后代植株純合株系的篩選與種植、抗旱性鑒定等工作。