余 欣，童 飛，詹 妮，葉 婷，王 琴，葉 輝，武立權(quán)，李 娟

(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽 合肥 230036；2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，安徽 合肥 230036；3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物技術(shù)中心，安徽 合肥 230036)

水稻(OryzasativaL.)是我國最重要的糧食作物之一，各項(xiàng)統(tǒng)計(jì)表明，我國水稻種植規(guī)模和產(chǎn)量長期位居全國主要農(nóng)作物前兩位；中國既是世界上最大的水稻生產(chǎn)大國，也是最大的消費(fèi)大國，水稻對(duì)我國糧食安全具有重要的戰(zhàn)略地位[1]。非生物逆境影響是制約水稻糧食生產(chǎn)的主要限制因子之一。近年來，高溫、干旱、洪澇等全球自然災(zāi)害頻發(fā)且規(guī)模大，包括中國在內(nèi)的亞洲國家，水稻種植面積和單產(chǎn)量受極端天氣影響而下降的現(xiàn)象普遍存在[2]。雙季晚稻秧苗移栽以后正值夏秋高溫季節(jié)，此時(shí)往往高溫和干旱交替或同時(shí)發(fā)生，是晚稻生產(chǎn)的主要限制因子。在水稻栽培生產(chǎn)上，如何將不可抗逆的環(huán)境因子加以利用已成為水稻抗逆研究的新方向。關(guān)于干旱和高溫對(duì)水稻生長影響的研究多集中于單一逆境[3-6]或復(fù)合逆境[7-9]。越來越多的研究證明，植物受輕度主脅迫影響后可獲得對(duì)另一種或多種強(qiáng)脅迫的抗性，這種現(xiàn)象被稱為交叉耐受性或交叉適應(yīng)性[10]。如熱激處理加強(qiáng)了玉米幼苗對(duì)高溫、低溫、干旱及鹽等脅迫的抗性[11-12]；營養(yǎng)期干旱誘導(dǎo)顯著提高了小麥孕穗期的抗寒能力[13]；干旱或高溫預(yù)處理可以增強(qiáng)水稻幼苗對(duì)高溫或干旱的交叉抗性[14]。有關(guān)幼苗期水稻干旱-高溫交叉適應(yīng)性的研究，主要集中在滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與活性氧含量、活性氧清除系統(tǒng)相關(guān)酶活等生理指標(biāo)的測定[14]，在水稻葉片光合作用和葉綠體超顯微結(jié)構(gòu)方面少有報(bào)道。本試驗(yàn)選用水稻品種‘N22’，分析干旱-高溫交叉脅迫處理水稻幼苗葉片葉綠素總量、光合生理參數(shù)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)以及葉綠體超微結(jié)構(gòu)的變化，探討干旱-高溫交叉脅迫下水稻幼苗光合作用與葉綠體顯微結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的關(guān)系，為水稻耐旱耐熱品種的選育和逆境栽培提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2019年5—7月在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科技樓人工氣候箱中進(jìn)行。以水稻品種‘N22’(OryzastivaL. spp.Aus. CV., ‘Nagina 22’)為試材，挑選籽粒均勻、飽滿的水稻種子，經(jīng)表面消毒、浸種后置于培養(yǎng)皿中催芽，選取發(fā)芽均勻一致的種粒播種于帶網(wǎng)格的塑料盆(高30 cm，直徑25 cm)中，一盆5粒，一共60盆。置于人工氣候箱中(晝/夜溫度25℃/20℃，晝/夜光周期12 h·h-1，光照強(qiáng)度3 000 Lux，相對(duì)濕度75%)，盆內(nèi)盛有1/2 Hoagland營養(yǎng)液，營養(yǎng)液每3 d更換1次，待水稻長至三葉一心期時(shí)，選取長勢基本一致的水稻幼苗進(jìn)行脅迫處理。

1.2 處理方法

本試驗(yàn)設(shè)置正常生長(CK)、單一高溫脅迫(Heat stress，H)及干旱-高溫交叉脅迫(Drought-heat cross stress，DH)3個(gè)處理組，處理中除溫度和模擬干旱外，水稻幼苗生長條件均一致。(1)正常生長：人工氣候箱晝/夜溫度為25℃/20℃，不添加PEG-6000 1/2 Hoagland營養(yǎng)液；(2)單一高溫脅迫處理：將人工氣候箱晝/夜溫度調(diào)至38℃/30℃，不添加PEG-6000 1/2 Hoagland營養(yǎng)液，高溫脅迫培養(yǎng)3 d；(3)干旱-高溫交叉脅迫處理：用含10% PEG-6000 1/2 Hoagland營養(yǎng)液模擬干旱脅迫，溶液水勢保持在-0.2 MPa左右，連續(xù)干旱脅迫培養(yǎng)3 d后，重新用1/2 Hoagland營養(yǎng)液恢復(fù)培育至正常后，轉(zhuǎn)入晝/夜溫度為38℃/30℃的人工氣候箱中，高溫脅迫培養(yǎng)3 d。以上每處理重復(fù)3次，每重復(fù)5盆。

1.3 葉綠素總量測定

采集水稻幼苗的第2～3真葉，剪碎、混勻后稱取0.2 g，加入5 mL 95%乙醇，研磨成勻漿，再加入4 mL 95%的乙醇繼續(xù)研磨至葉片組織變白，靜置3～5 min，將全部勻漿轉(zhuǎn)入10 mL離心管，于室溫下4 000 r·min-1離心10 min后收集上清液，再用95%的乙醇定容至25 mL，以95%的乙醇為對(duì)照。紫外-可見分光光度計(jì)(UV-3600,島津，日本)分別測定665 nm和649 nm處的吸光值，計(jì)算總?cè)~綠素含量(mg·g-1)。

1.4 葉片光合特性測定

選取水稻幼苗第2～3真葉，在上午9∶00—11∶00用便攜式光合儀(LI-6400，LI-COR，美國)在內(nèi)置LED紅藍(lán)光源和1 000 μmol·m-2·s-1光合有效輻射參數(shù)條件下，測定其凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)。

1.5 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定

將水稻幼苗暗適應(yīng)30 min后，選取第2～3真葉，用新型調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)(IMAGING-PAM，WALZ，德國)進(jìn)行葉綠素?zé)晒鉁y定，主要測定指標(biāo)是實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率Y(Ⅱ)。

1.6 掃描電鏡觀察

挑選水稻幼苗的第2～3真葉，取葉片主葉脈兩側(cè)的部分，用刀切成5 mm×5 mm的小方塊，置入1.5 mL離心管中，用戊二醛固定。用PBS緩沖液漂洗，用乙醇梯度脫水后用乙酸異戊酯置換。將樣品干燥、噴金，用掃描電子顯微鏡(S4800，日立，日本)觀察拍照。

1.7 透射電鏡觀察

挑選水稻幼苗的第2～3真葉，取葉片主葉脈兩側(cè)的部分，用刀切成2 mm×5 mm的小方塊，置入1.5 mL離心管中，用戊二醛固定。用PBS漂洗樣品，1%鋨酸固定，再用PBS漂洗，乙醇梯度脫水，用包埋劑與丙酮混合液滲透，再加熱包埋聚合。用超薄切片機(jī)(EM UC7，徠卡，德國)切片，切片經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色。用透射電子顯微鏡(HT-7700，日立，日本)觀察拍照。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均為3個(gè)以上重復(fù)(含3個(gè)重復(fù))的平均值加標(biāo)準(zhǔn)誤，數(shù)據(jù)整理使用WPS Excel 2020和SPSS 25.0軟件做顯著性差異分析，采用單因素方差分析(ANOVA)和Duncan檢驗(yàn)法進(jìn)行處理間的差異顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱-高溫交叉脅迫對(duì)水稻幼苗葉綠素總量和葉綠素a/b比值的影響

高溫脅迫會(huì)抑制葉綠素合成相關(guān)酶的活性，從而降低葉綠素含量。由圖1A可知，在H和DH處理下水稻幼苗的葉綠素總量分別為0.37、1.98 mg·g-1，均低于CK的2.07 mg·g-1，分別下降82.15%和4.44%；而DH處理后的水稻幼苗的葉綠素總量較H處理卻顯著上升(P<0.01)，是H處理下的4.35倍。表明高溫脅迫顯著抑制了水稻幼苗中葉綠素的合成，導(dǎo)致葉綠素的含量顯著下降；而水稻苗期進(jìn)行干旱預(yù)處理，有利于減小后期高溫對(duì)葉綠素合成的抑制，從而提高葉綠素的含量，增強(qiáng)水稻的光合作用能力，提高水稻的耐熱性。由圖1B可知，水稻幼苗葉綠素a/b比值在H、DH以及CK中的差異不顯著，分別為3.01、3.15和3.07，表明單一高溫以及干旱-高溫交叉脅迫對(duì)葉綠素a/b比值的影響不顯著。

注:CK:正常生長；H:單一高溫處理；DH:干旱-高溫交叉處理，**表示1%水平顯著性，下同。

2.2 干旱-高溫交叉脅迫對(duì)水稻幼苗光合參數(shù)的影響

凈光合速率能夠直接反映植物的光合能力。由表1可知，H處理下水稻幼苗凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)均顯著低于CK(P<0.05)，下降幅度分別為66.82%、64.83%、8.23%、66.20%。這說明水稻幼苗對(duì)高溫脅迫十分敏感，高溫脅迫導(dǎo)致水稻葉片氣孔導(dǎo)度顯著減小，從而阻止了CO2的供應(yīng)，使胞間CO2濃度減小，凈光合速率下降。DH處理下，水稻幼苗Pn、Gs、Ci、Tr較H處理顯著上升(P<0.05)，分別是H處理的2.67、3.20、1.17、3.46倍；與CK相比，除Pn略低于CK外，Gs、Ci及Tr較CK有小幅度上升，表明水稻苗期進(jìn)行干旱預(yù)處理可以提高水稻對(duì)高溫脅迫的適應(yīng)性，保證水稻葉片正常光合作用的同時(shí)，增強(qiáng)了水稻幼苗的抗熱性。

表1 干旱-高溫交叉脅迫對(duì)水稻葉片光合參數(shù)的影響

2.3 干旱-高溫交叉脅迫對(duì)水稻幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

高溫會(huì)破壞葉片PSII，通過檢測葉綠素?zé)晒饪梢粤私庵参锏墓夂蠣顩r，其參數(shù)變化可以用來評(píng)價(jià)植株的抗逆性。由圖2可知，H處理下水稻幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)Y(Ⅱ)顯著低于CK(P<0.01)，下降幅度為27.51%。說明高溫逆境顯著影響了水稻幼苗光合作用器官活性，從而使得其實(shí)際光能轉(zhuǎn)換效率受到抑制。而DH處理下水稻幼苗葉片Y(Ⅱ)略低于CK，差異不顯著，但顯著高于H處理(P<0.01)，是H處理的1.23倍。表明水稻苗期進(jìn)行干旱預(yù)處理，提高了高溫脅迫下水稻幼苗光合作用系統(tǒng)活性，干旱-高溫交叉脅迫后的水稻幼苗抗熱性會(huì)更強(qiáng)。

圖2 干旱-高溫交叉脅迫對(duì)水稻葉片實(shí)際光化學(xué)量子效率的影響

2.4 干旱-高溫交叉脅迫對(duì)水稻幼苗葉片超微結(jié)構(gòu)的影響

利用掃描電鏡觀察水稻葉片表皮氣孔形態(tài)(圖3)。H處理使氣孔大小和氣孔開度均明顯減小，氣孔呈近乎閉合狀態(tài)；而DH處理后氣孔大小無顯著變化，氣孔開張度略大于CK，保持正常的氣孔形態(tài)。說明水稻苗期進(jìn)行干旱預(yù)處理，可以通過調(diào)節(jié)氣孔大小和形態(tài)來提高其光合作用能力和蒸騰能力，以抵御后期高溫的脅迫。

注：×6.0 k表示放大倍數(shù)為6 000倍。

利用透射電鏡觀察水稻葉片葉肉細(xì)胞(圖4)。CK組的葉肉細(xì)胞形狀完整飽滿，葉綠體呈扁平的橢圓狀，內(nèi)部基粒片層穩(wěn)定排列；而H處理組的葉肉細(xì)胞壓縮變形，葉綠體膨脹，基粒片層普遍出現(xiàn)斷裂甚至解體；DH處理組的葉肉細(xì)胞形狀保持相對(duì)完整，葉綠體與CK組相似，呈扁平的橢圓狀，基粒片層結(jié)構(gòu)也相對(duì)穩(wěn)定，無明顯斷裂和解體。水稻苗期進(jìn)行干旱預(yù)處理，有利于維持葉肉細(xì)胞及亞細(xì)胞器的正常形態(tài)，免受后期高溫的傷害。

注：MC：葉肉細(xì)胞，Ch：葉綠體，G：葉綠體基粒?！?.0 k、×15 k表示放大倍數(shù)為3 000倍、15 000倍。

3 討 論

光合作用直接影響到水稻產(chǎn)量，而葉片是水稻進(jìn)行光合作用的主要部位，葉片的生長發(fā)育狀態(tài)關(guān)乎水稻光合作用能力的大小，也決定收獲后的生物量和產(chǎn)量。水稻幼苗期以營養(yǎng)生長為主，不利的環(huán)境因子會(huì)左右其發(fā)育狀況。Pandey等[15]和Bunnag等[16]等研究表明，營養(yǎng)生長期的水稻幼苗若長期處于高溫或干旱環(huán)境下則會(huì)影響其分蘗發(fā)生，進(jìn)而導(dǎo)致有效穗數(shù)減少，嚴(yán)重影響水稻的品質(zhì)和產(chǎn)量。楊波等[17]研究也指出水分和高溫復(fù)合脅迫下，水稻幼苗光合生理特性會(huì)受到顯著影響。利用植物的交叉適應(yīng)性可以成為改良水稻抗逆性的有效手段之一。前人的研究已經(jīng)表明，對(duì)幼苗期水稻進(jìn)行干旱或高溫鍛煉，使?jié)B透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累，明顯提高了活性氧的清除能力，增強(qiáng)了水稻的抗熱性或抗旱性[14]，但干旱-高溫交叉脅迫對(duì)水稻光合性能指標(biāo)的影響鮮有報(bào)道。由此可見，進(jìn)一步從水稻光合作用及葉綠體超微結(jié)構(gòu)入手，探究干旱-高溫交叉適應(yīng)性下水稻幼苗的光合生理響應(yīng)機(jī)制具有重要意義。

3.1 干旱-高溫交叉脅迫對(duì)水稻幼苗葉綠素的影響

高等植物細(xì)胞中光合色素以葉綠素a和葉綠素b為主，它們在光合作用中發(fā)揮著吸收和傳遞光能的作用，反映出水稻幼苗的生長狀況和光合作用能力[18]。高溫脅迫主要影響葉綠素中間產(chǎn)物合成，從而導(dǎo)致葉綠素合成減少。在一定范圍內(nèi)，增加葉綠素含量可以增強(qiáng)葉綠體對(duì)光能的吸收與轉(zhuǎn)化，葉綠素a/b比值反映葉綠素a與葉綠素b對(duì)逆境脅迫的敏感性以及逆境脅迫對(duì)二者的傷害程度[19]。本研究中單一高溫脅迫下水稻葉綠素含量顯著降低，但干旱-高溫交叉脅迫下水稻葉綠素含量明顯高于單一高溫脅迫后的水稻，說明單一高溫脅迫下水稻幼苗葉綠素合成被抑制，造成了葉綠素含量顯著下降；而當(dāng)水稻幼苗經(jīng)過適度干旱鍛煉后，后期高溫對(duì)其葉綠素合成的抑制會(huì)顯著減弱，葉綠素含量也明顯上升，增強(qiáng)了光能的吸收和轉(zhuǎn)化能力，從而提高了水稻幼苗對(duì)高溫脅迫的適應(yīng)性。但本研究中各處理間葉綠素a/b比值變化不顯著，說明葉綠素a和葉綠素b對(duì)單一高溫以及干旱-高溫交叉脅迫有相似的敏感性。

3.2 干旱-高溫交叉脅迫對(duì)水稻幼苗光合參數(shù)的影響

光合作用是植物功能中最敏感的部分，熱脅迫降低了植物的光合作用[20]。宋麗莉等[21]研究指出，水稻幼苗在30℃～35℃高溫區(qū)間表現(xiàn)為Pn、Gs、Ci、Tr等主要光合參數(shù)指標(biāo)有下降趨勢，與本研究高溫組試驗(yàn)結(jié)果一致，而干旱-高溫交叉脅迫后水稻幼苗的生理參數(shù)與正常生長組的參數(shù)差異不顯著，表明干旱鍛煉能夠使水稻幼苗在后期高溫脅迫時(shí)通過維持適度的氣孔導(dǎo)度、正常的CO2的供應(yīng)，從而保持適應(yīng)高溫環(huán)境壓力下生存的光合作用強(qiáng)度，進(jìn)一步驗(yàn)證了水稻幼苗的干旱-高溫交叉適應(yīng)性。

3.3 干旱-高溫交叉脅迫對(duì)水稻葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

實(shí)際光能轉(zhuǎn)換效率Y(Ⅱ)指的是原初反應(yīng)中光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)吸收的光能轉(zhuǎn)換為電能的利用率，常作為研究環(huán)境脅迫對(duì)植物光合能力影響的重要指標(biāo)之一[22-24]。正常生長狀態(tài)下，任何植物葉片的熒光參數(shù)是不會(huì)發(fā)生改變的，而當(dāng)遭受外界逆境脅迫時(shí)才會(huì)變化以緩解外界傷害。一般來說，脅迫程度越大，PSⅡ受損傷情況越嚴(yán)重，進(jìn)而導(dǎo)致相應(yīng)的光化學(xué)反應(yīng)效率顯著下降，若植物的抗逆性較強(qiáng)則會(huì)表現(xiàn)出其參數(shù)下降幅度小[25]。楊衛(wèi)麗等[26]研究指出，復(fù)合體PSⅡ受限是造成高溫脅迫后水稻光合速率下降的主要環(huán)節(jié)。本研究同樣表明，高溫脅迫下水稻光系統(tǒng)Ⅱ?qū)饽艿牟东@及轉(zhuǎn)換功能受阻，造成光能利用率的極大損耗，而干旱鍛煉使水稻幼苗在應(yīng)對(duì)高溫時(shí)光能轉(zhuǎn)換的損失降到了最小，為光合作用的維持提供了保障，但關(guān)于PSⅡ組成部分受脅迫影響的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。

3.4 干旱-高溫交叉脅迫對(duì)水稻葉片超微結(jié)構(gòu)的影響

氣孔是水稻等大多數(shù)植物與外界O2、CO2、水蒸氣等氣體進(jìn)行交換的一種特殊結(jié)構(gòu)，用來調(diào)節(jié)植物光合作用、蒸騰作用。本研究中，高溫處理后的水稻氣孔大小和氣孔開度發(fā)生了顯著變化，高溫會(huì)使葉片氣孔發(fā)生關(guān)閉，這一現(xiàn)象在葡萄樹幼苗等其它單子葉植物中也發(fā)生[22]，而干旱-高溫交叉脅迫下氣孔則維持正常的生理狀態(tài)，其中氣孔開度略有增大，一方面可能是水稻氣孔增大有助于對(duì)CO2的吸收，從而補(bǔ)充卡爾文循環(huán)中CO2原料的供應(yīng)，維持光合作用的穩(wěn)定運(yùn)作。另一方面，氣孔開度變大也會(huì)加強(qiáng)葉片的蒸騰作用，降低水稻表面溫度，緩解高溫傷害。

葉綠體超微結(jié)構(gòu)的變化被認(rèn)為與光合器官的生理、生化和功能適應(yīng)性變化密切相關(guān)[27]，找出葉綠體變化與光合作用間聯(lián)系則是說明水稻在干旱-高溫交叉脅迫下表現(xiàn)交叉適應(yīng)性的論證之一。我們觀察到水稻幼苗細(xì)胞在高溫脅迫后出現(xiàn)了明顯的損傷，尤以葉綠體結(jié)構(gòu)變化最為突出，其次為細(xì)胞形態(tài)，基粒片層斷裂是葉綠體受高溫脅迫后的普遍特征，這一變化與水稻受到鹽脅迫后的表現(xiàn)類似，鹽脅迫下的水稻幼苗葉片出現(xiàn)了基粒和基質(zhì)片層瓦解。與高溫組對(duì)比，干旱預(yù)處理組的水稻幼苗葉綠體結(jié)構(gòu)相對(duì)完整、基粒片層較規(guī)整、基粒間連接較穩(wěn)定，表明葉綠體整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定是水稻在高溫脅迫下依然保持合適光合作用的關(guān)鍵。

4 結(jié) 論

本研究通過對(duì)干旱-高溫交叉脅迫處理下水稻幼苗葉片葉綠素總量、光合生理參數(shù)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)以及葉綠體超微結(jié)構(gòu)變化的分析表明：水稻幼苗在響應(yīng)干旱-高溫交叉脅迫過程中，通過維持正常的葉綠素含量、穩(wěn)定的葉肉細(xì)胞及亞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和適度的氣孔開度，緩解后期高溫對(duì)其光合作用能力的破壞，從而減小高溫對(duì)水稻幼苗生長的傷害，提高了水稻幼苗的耐熱性。試驗(yàn)從光合生理響應(yīng)角度初步探討了水稻交叉適應(yīng)性可能的機(jī)制，但水稻交叉適應(yīng)性是一個(gè)涉及到基因、蛋白質(zhì)、代謝物等復(fù)雜的分子生化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其機(jī)制還需要從基因組、蛋白組及代謝組等多組學(xué)角度更加深入地探究。