石 威，張俊忠，解鵬超，侯 燕，余 昕，李 磊，姜紅江，，△

1 安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥 230000；2 山東中醫(yī)藥大學(xué)；3 濱州市中醫(yī)醫(yī)院；4 山東省文登整骨醫(yī)院

股骨頭壞死（osteonecrosis of femoral head，ONFH）是由于不同因素破壞了股骨頭的血液供給，導(dǎo)致股骨頭發(fā)生局部或完全性缺血，使股骨頭微觀結(jié)構(gòu)如骨細(xì)胞、骨髓造血細(xì)胞及脂肪細(xì)胞壞死，最終導(dǎo)致股骨頭塌陷的病理過(guò)程，是骨科最常見(jiàn)的臨床疑難疾?。?］。常見(jiàn)的類(lèi)型有激素性O(shè)NFH、酒精性O(shè)NFH 和外傷性O(shè)NFH。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，該病多見(jiàn)于30～50 歲的中青年人群，我國(guó)ONFH 患者已有近800 萬(wàn)人，且近年來(lái)本病的發(fā)病率呈逐年升高的趨勢(shì)，每年新增約15～20 萬(wàn)病例［2-3］。該病具有極高的致殘率，已經(jīng)嚴(yán)重危害了患者的生命健康并降低了患者的生活質(zhì)量［4］。

中醫(yī)學(xué)將ONFH 歸屬為“骨蝕”“骨痿”的范疇，認(rèn)為ONFH 與肝腎虧虛、經(jīng)脈瘀阻密切相關(guān)，總體治療原則以補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋健骨、活血化瘀為主［5］。中藥治療ONFH 有療效確切、安全性高的優(yōu)勢(shì)，對(duì)ONFH 的防治具有很好的效果，在ONFH 的保髖治療中起到了至關(guān)重要的作用［6］。淫羊藿是小檗科淫羊藿屬植物，主要功效為補(bǔ)腎壯陽(yáng)、祛風(fēng)除濕、強(qiáng)筋健骨。藥理學(xué)研究［7-8］表明，淫羊藿具有抗炎、舒張血管、免疫抑制、抗氧化以等作用。牛膝屬于莧科牛膝屬植物，主要功效為活血通經(jīng)、補(bǔ)肝腎強(qiáng)筋骨、引火下行。藥理學(xué)研究證明，牛膝具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)成骨細(xì)胞分化、預(yù)防凝血等作用［9-11］。結(jié)合中醫(yī)基礎(chǔ)理論和臨床應(yīng)用，淫羊藿、牛膝相須配對(duì)使用符合臨床防治ONFH 的理念，但對(duì)其作用機(jī)制尚不明確，因此有必要進(jìn)一步研究。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是藥理學(xué)融合醫(yī)學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等多學(xué)科而形成的一門(mén)新學(xué)科，能夠全面地反應(yīng)藥物對(duì)疾病網(wǎng)絡(luò)的分子作用機(jī)制［12］。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法，從淫羊藿、牛膝的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)出發(fā)，深入挖掘淫羊藿-牛膝藥對(duì)調(diào)治ONFH 的關(guān)鍵靶點(diǎn)和潛在的分子作用機(jī)制并進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，以期更好的為治療ONFH 的臨床用藥提供一定的理論參考，同時(shí)為新藥的研發(fā)提供新思路。

1 資料與方法

1.1 淫羊藿-牛膝藥對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)篩選通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)［13］檢索中藥淫羊藿、牛膝化學(xué)成分，根據(jù)藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類(lèi)藥性指數(shù)（drug-likeness，DL）≥0.18［14］兩個(gè)ADME屬性值對(duì)活性成分進(jìn)行初步篩選以獲取活性化合物后查找藥物作用的有效蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。

1.2 淫羊藿-牛膝藥對(duì)“活性成分——靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)篩選完蛋白質(zhì)靶點(diǎn)后，利用Uniprot 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.uniprot.org）為化合物作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)信息進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，使用Cytoscape 3.8.0［15］構(gòu)建淫羊藿-牛膝“活性成分——靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)并探究?jī)烧叩年P(guān)系。

1.3 ONFH 相關(guān)靶點(diǎn)檢索通過(guò)檢索OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)［16］（http：//www.omim.org）、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)［17］（http：//genecards.org）中ONFH 的潛在靶點(diǎn)，結(jié)合DRUGBANK數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//go.drugbank.com/）挖掘治療ONFH的臨床藥物作用靶點(diǎn)［18］。合并3個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)后，刪除重復(fù)值得到ONFH的靶點(diǎn)。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選為明確淫羊藿-牛膝藥對(duì)潛在靶點(diǎn)與ONFH相關(guān)靶點(diǎn)之間的相互作用，運(yùn)用Venny 2.1.0平臺(tái)（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）將淫羊藿-牛膝藥對(duì)成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集并繪制韋恩圖。運(yùn)用Cytoscape 3.8.0中的BisoGenet，將淫羊藿-牛膝藥對(duì)潛在靶點(diǎn)和ONFH的靶點(diǎn)分別導(dǎo)入BisoGenet，各生成1 個(gè)PPI 網(wǎng)絡(luò)，再使用Cytoscape 中Merge取兩者交集網(wǎng)絡(luò)，最后利用CytoNCA［19］分析交集網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)溥M(jìn)一步篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 淫羊藿-牛膝藥對(duì)成分——ONFH 靶點(diǎn)功能與通路的富集分析Metascape 平臺(tái)（https：//metascape.org）每月整合多個(gè)權(quán)威數(shù)據(jù)庫(kù)，更新基因注釋?zhuān)邆涓患治?、?gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)的強(qiáng)大功能［20-21］。將淫羊藿-牛膝調(diào)治股骨頭壞死的共同靶點(diǎn)錄入Metascape 平臺(tái)，獲取其主要的生物學(xué)過(guò)程和信號(hào)通路并進(jìn)行富集分析，將獲得的四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)資料根據(jù)P 值選用TOP20 數(shù)據(jù)采用微生信平臺(tái)（http：//www.bioinformatics.com.cn/）繪制GO富集分析條形圖、KEGG通路富集分析氣泡圖。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證選擇“活性成分——靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中的核心成分與PPI網(wǎng)絡(luò)中治療ONFH相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白運(yùn)用PUB 數(shù)據(jù)庫(kù)、PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合Autodock Tools 軟件、Autodock-vina1.1.2 軟件進(jìn)行分子對(duì)接，預(yù)測(cè)靶點(diǎn)蛋白與小分子之間發(fā)生的交互作用，進(jìn)而評(píng)價(jià)淫羊藿-牛膝藥對(duì)活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的對(duì)接效果。

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿、牛膝活性成分與靶點(diǎn)的獲取初步提取淫羊藿化學(xué)成分130種、牛膝化學(xué)成分176種，經(jīng)ADME篩選后共獲得淫羊藿有效活性成分23種、牛膝有效活性成分16種，包括槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、廣玉蘭內(nèi)酯（magnograndiolide）、漢黃芩素（wogonin）等。淫羊藿有效成分作用靶點(diǎn)459 個(gè)，牛膝有效成分作用靶點(diǎn)403個(gè)，合并后刪除重復(fù)值共得到靶點(diǎn)231 個(gè)。利用Cytoscape 3.8.0 對(duì)淫羊藿、牛膝藥對(duì)活性成分及其作用靶點(diǎn)的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行繪制和分析，共獲得270 個(gè)節(jié)點(diǎn)與901 條關(guān)系，節(jié)點(diǎn)的面積代表Degree 值大小，面積越大說(shuō)明該節(jié)點(diǎn)越重要。見(jiàn)表1、圖1。

表1 淫羊藿-牛膝主要活性成分

圖1 淫羊藿-牛膝藥對(duì)活性成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 ONFH 相關(guān)靶點(diǎn)的獲取從GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中共獲得ONFH 潛在靶點(diǎn)2033 個(gè)，Relevance Score 值越高代表該靶點(diǎn)與疾病聯(lián)系更密切。此次研究設(shè)定Relevance Score 大于中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)作為ONFH的潛在靶點(diǎn)，在該數(shù)據(jù)庫(kù)中ONFH靶點(diǎn)Relevance Score最大值為99.71，最小值為0.18，中位數(shù)為4.74，故設(shè)定Relevance Score＞4.74的靶點(diǎn)為ONFH的潛在靶點(diǎn)共1017個(gè)。結(jié)合OMIM、DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)補(bǔ)充相關(guān)靶點(diǎn)，合并3 個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)靶點(diǎn)后刪除重復(fù)值，最終得到2131個(gè)ONFH相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將篩選出來(lái)的藥物有效活性成分靶點(diǎn)與ONFH 疾病靶點(diǎn)取交集，并通過(guò)Venny 平臺(tái)制作韋恩圖，得到淫羊藿-牛膝藥對(duì)藥物成分——ONFH 共同靶點(diǎn)138 個(gè)，見(jiàn)圖2。運(yùn)用Cytoscape 3.8.0 分別構(gòu)建淫羊藿-牛膝藥對(duì)和ONFH 的PPI 網(wǎng)絡(luò)，從結(jié)果看：淫羊藿-牛膝藥對(duì)潛在靶點(diǎn)可能與7865 個(gè)靶點(diǎn)產(chǎn)生作用，交互關(guān)系有175281 種；與ONFH 相關(guān)的靶點(diǎn)共有13263 個(gè)，交互關(guān)系可達(dá)246136 種，取兩者交集網(wǎng)絡(luò)，如圖3。運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浜?，進(jìn)行2次篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)80個(gè)，篩選策略見(jiàn)圖4。

圖2 淫羊藿-牛膝藥對(duì)藥物成分ONFH靶點(diǎn)韋恩圖

圖4 淫羊藿-牛膝藥對(duì)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)篩選策略圖

2.4 靶點(diǎn)功能與通路的富集分析應(yīng)用Metascape數(shù)據(jù)平臺(tái)對(duì)上述獲取的80 個(gè)淫羊藿-牛膝藥對(duì)調(diào)治ONFH 關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)進(jìn)行信號(hào)通路分析，借助微生信平臺(tái)對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化。由結(jié)果可見(jiàn)，多個(gè)靶點(diǎn)的功能與ONFH 的發(fā)生密切相關(guān)。淫羊藿-牛膝藥對(duì)主要參與的生物學(xué)過(guò)程包括對(duì)無(wú)機(jī)物的應(yīng)答（response to inorganic substance）、對(duì)脂多糖的反應(yīng)（response to lipopolysaccharide）、對(duì)受傷的應(yīng)答（response to wounding）、細(xì)胞對(duì)有機(jī)環(huán)化合物的應(yīng)答（cellular response to organic cyclic compound）、對(duì)毒性物質(zhì)的反應(yīng)（response to toxic substance），見(jiàn)圖5中BP；在細(xì)胞組分中，主要作用于細(xì)胞膜筏（membrane raft）、膜微區(qū)（membrane microdomain）、膜區(qū)（membrane region）等，見(jiàn)圖5中CC；相關(guān)靶點(diǎn)調(diào)節(jié)ONFH的功能主要富集于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（transcription factor binding）、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合（protein domain specific binding）、核受體活性（nuclear receptor activity）、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接配體調(diào)節(jié)序列特異性DNA 結(jié)合（transcription factor activity，direct ligand regulated sequencespecific DNA binding）、蛋白激酶結(jié)合（protein kinase binding）、細(xì)胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）等，見(jiàn)圖5 中MF。將KEGG 通路結(jié)果繪制成氣泡圖，氣泡顏色從青到紅代表Log10（P）值由小到大，氣泡面積代表該通路的基因計(jì)數(shù)，橫軸代表該通路基因所占有的比值，如圖6 所示，KEGG 富集通路顯示淫羊藿-牛膝藥對(duì)防治ONFH 的 通 路 與PI3K-Akt 信 號(hào) 通 路、MAPK 信 號(hào) 通路、HIF-1 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、癌癥通路以及破骨細(xì)胞的分化等相關(guān)。

圖5 淫羊藿-牛膝藥對(duì)治療ONFH作用靶點(diǎn)富集分析條形圖

圖6 淫羊藿-牛膝藥對(duì)治療ONFH KEGG通路富集分析氣泡圖

2.5 分子對(duì)接結(jié)果選取活性成分——靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中前2個(gè)有效成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)TP53進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，分子對(duì)接結(jié)果顯示關(guān)鍵活性成分quercetin、kaempferol 與治療ONFH 的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)TP53 具有較好的結(jié)合活性，說(shuō)明該研究的預(yù)測(cè)較為可靠。見(jiàn)圖7。

圖7 藥物關(guān)鍵成分與核心靶點(diǎn)TP53分子對(duì)接結(jié)果

3 討論

通過(guò)分析表1和圖1可以得出淫羊藿-牛膝藥對(duì)治療ONFH 的核心有效成分可能為槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、漢黃芩素（wogonin）等。槲皮素是一種類(lèi)黃酮化合物，存在于諸多植物類(lèi)中藥材中，淫羊藿和牛膝成分中都含有槲皮素，藥理學(xué)研究表明，槲皮素具有抗炎、預(yù)防氧化等作用［22］，可通過(guò)MAPK 信號(hào)通路恢復(fù)成骨細(xì)胞功能，進(jìn)而起到骨保護(hù)的功能［23-24］。山柰酚是黃酮醇類(lèi)化合物，也同時(shí)包含在淫羊藿、牛膝之中，現(xiàn)代藥理學(xué)證明山柰酚具有防治癌癥、抗炎抗氧化等功效。漢黃芩素是從黃芩中提取出來(lái)的化合物，研究證明漢黃芩素具有抗炎抗氧化、保護(hù)血管等作用［25-26］。ONFH臨床疼痛癥狀多由于炎癥的局部反應(yīng)所致，而活性物質(zhì)槲皮素、山柰酚、漢黃芩素在炎癥反應(yīng)中均具有獨(dú)特的生物特性，與治療ONFH的理念不謀而合。

本研究經(jīng)篩選后共得到80 個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。根據(jù)Degree 值排名，其中較為重要的靶點(diǎn)有TP53、PPARG、PTGS2 等。有研究表明，產(chǎn)生ONFH 重要因素之一是脂質(zhì)代謝紊亂，PPARG 正是體內(nèi)脂肪形成的必要的轉(zhuǎn)錄因子，密切參與體內(nèi)脂肪的代謝過(guò)程［27-28］。TP53 是一種抑癌基因，密切參與細(xì)胞凋亡，研究證實(shí)TP53 的高表達(dá)與ONFH 有關(guān)，其作用機(jī)制為上調(diào)凋亡因子Bax的表達(dá)［29-30］。

由KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，淫羊藿-牛膝藥對(duì)治療ONFH 主要涉及以下幾個(gè)信號(hào)通路：PI3K-Akt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、癌癥通路。1）PI3K-AKT 信號(hào)通路：李云隆等［31］認(rèn)為PI3K通過(guò)激活激酶系統(tǒng)促使AKT逐漸被磷酸化，磷酸化后的AKT激活下游靶蛋白mTOR，從而激活該通路可以抑制自噬，進(jìn)而改善ONFH 的進(jìn)程。同時(shí)該通路已被證實(shí)與血管修復(fù)再生、成骨細(xì)胞分化、破骨細(xì)胞分化密切相關(guān)［32］。2）MAPK 信號(hào)通路：骨代謝失衡是導(dǎo)致ONFH 發(fā)生的重要機(jī)制，MAPK 是調(diào)節(jié)骨代謝平衡的重要信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，密切參與成骨細(xì)胞的增殖分化［33］，同時(shí)也是槲皮素干預(yù)ONFH 的重要因素［34］。由此可見(jiàn)淫羊藿-牛膝藥對(duì)可通過(guò)MAPK 信號(hào)通路調(diào)節(jié)骨代謝從而發(fā)揮治療作用。3）HIF-1 信號(hào)通路：研究證明，缺血缺氧同樣也是導(dǎo)致ONFH 發(fā)生的重要機(jī)制［35］，HIF-1 信號(hào)通路是一種經(jīng)典的缺氧代謝通路［36］，該信號(hào)通路在缺氧時(shí)密切參與了血管生成、骨吸收和新骨生成的骨修復(fù)過(guò)程［37］。

綜上所述，淫羊藿-牛膝藥對(duì)調(diào)治ONFH 的主要成分可能是槲皮素、山柰酚、漢黃芩素等，涉及到的通路有PI3K-Akt、MAPK、HIF-1、癌癥通路等，與自噬、缺氧應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、血管生成、骨代謝等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程息息相關(guān)，由此可知，淫羊藿-牛膝相須配伍使用并不是簡(jiǎn)單的相同成分含量的增加，而是通過(guò)信號(hào)通路互補(bǔ)，這為治療ONFH 的臨床用藥提供一定的理論參考，同時(shí)為新藥的研發(fā)提供新思路。