平婉菁，劉逸宸，付巧妹

前沿聚焦

沉積物古DNA探秘滅絕古人類(lèi)演化

平婉菁，劉逸宸，付巧妹

中國(guó)科學(xué)院古脊椎動(dòng)物與古人類(lèi)研究所，北京 100044

古DNA領(lǐng)域首次從世界不同洞穴遺址的沉積物里提取古核基因組以揭示相關(guān)物種演化的突破性進(jìn)展，標(biāo)志著沉積物古DNA研究正式進(jìn)入全基因組時(shí)代。近期，一種新的沉積物古核DNA富集方法成功從西班牙Estatuas洞穴沉積物里捕獲多個(gè)尼安德特人的核DNA，揭示該滅絕古人類(lèi)群體此前未知的人口更替的歷史。沉積物古核DNA富集突破了古DNA研究依賴(lài)化石材料的限制，為深入探究遠(yuǎn)古不同人類(lèi)群體在更宏大時(shí)空框架下遷徙、演化與適應(yīng)的歷史提供了更多可能。由此，本文將著重解讀該研究帶來(lái)的對(duì)尼安德特人遺傳歷史的新認(rèn)識(shí)及其方法創(chuàng)新的重要意義；此外還將結(jié)合人類(lèi)化石DNA及其他沉積物研究所發(fā)現(xiàn)的滅絕古人類(lèi)線粒體DNA證據(jù)，厘清尼安德特人的種群多樣性及其種群間分離或替代的歷史。

沉積物古DNA；核基因組；滅絕古人類(lèi)；尼安德特人；丹尼索瓦人；雜交捕獲；探針組；種群替代

近期，雜志評(píng)選出“2021年度十大科學(xué)突破”，主題“解鎖古老泥土DNA的時(shí)代到來(lái)”(ancient soil DNA comes of age)列舉了古DNA領(lǐng)域多項(xiàng)研究首次從世界不同洞穴遺址的沉積物里提取古核基因組以揭示相關(guān)物種演化的突破性進(jìn)展，這標(biāo)志著沉積物古DNA研究正式進(jìn)入全基因組時(shí)代。其中的一項(xiàng)重要研究是Vernot等[1]通過(guò)開(kāi)發(fā)新的沉積物古DNA富集方法，從西班牙Estatuas等洞穴沉積物里捕獲多個(gè)尼安德特人的核DNA，揭示了該滅絕古人類(lèi)群體一段不為人知的人口更替的歷史。這一突破對(duì)人類(lèi)古基因組研究尤其具有里程碑式的意義。它意味著該領(lǐng)域研究得以突破材料的限制，將可能從更多不管是否有人類(lèi)骨骸或活動(dòng)痕跡的更新世遺址沉積物里去探尋遠(yuǎn)古人類(lèi)的遺傳信息，為更全面探索遠(yuǎn)古不同人類(lèi)群體的遷徙、演化與環(huán)境適應(yīng)的歷史開(kāi)辟了新的道路。

20世紀(jì)80年代以來(lái)，古DNA技術(shù)和研究的革新與發(fā)展，不斷刷新著人類(lèi)對(duì)自身由來(lái)及在地球上遷徙演化歷程的理解和認(rèn)識(shí)。尤其是，研究通過(guò)人類(lèi)遺骸里的古DNA直接觀察到與現(xiàn)代人在遺傳上不同的群體——現(xiàn)代人的近親——尼安德特人和丹尼索瓦人的存在，及獲悉這些滅絕古人類(lèi)群體(受限于目前已有的古DNA證據(jù)，本文關(guān)于滅絕古人類(lèi)的討論將僅限于尼安德特人和丹尼索瓦人)與現(xiàn)代人祖先之間此前未知的互動(dòng)歷史。2010年，尼安德特人和丹尼索瓦人的基因組草圖相繼發(fā)布，為揭示遠(yuǎn)古人類(lèi)群體間基因交流及其對(duì)歐亞現(xiàn)代人深遠(yuǎn)的遺傳影響提供了直接的證據(jù)[2,3]。隨著更多對(duì)更新世時(shí)期地點(diǎn)人類(lèi)化石(包括尼安德特人、丹尼索瓦人、早期現(xiàn)代人及其混血個(gè)體)古DNA的提取和研究，學(xué)界對(duì)這些遠(yuǎn)古人類(lèi)群體間基因交流的認(rèn)識(shí)日益深入：尼安德特人與早期現(xiàn)代人發(fā)生基因交流的時(shí)間、地點(diǎn)、次數(shù)和基因流向[4～6]，丹尼索瓦人可能有的不同亞群數(shù)量和廣泛分布的范圍[3,7～12]，尼安德特人與丹尼索瓦人形成混血后代的直接證據(jù)[13]，滅絕古人類(lèi)基因在歐亞不同現(xiàn)代人群中的分布比例[2,3,12,14～17]及其對(duì)現(xiàn)代人生理機(jī)能、疾病發(fā)生率和環(huán)境適應(yīng)性的潛在影響[7,15,16,18～25]等更多細(xì)節(jié)得以被揭露。

然而，這些研究大多聚焦于滅絕古人類(lèi)群體與早期現(xiàn)代人的互動(dòng)及對(duì)當(dāng)今現(xiàn)代人的影響。受制于滅絕古人類(lèi)化石的稀缺，對(duì)這些滅絕古人類(lèi)本身遺傳譜系和演化歷史的探索卻極其有限——他們?cè)嬖谟诤螘r(shí)，分布有多廣？他們?cè)只赡男┎煌姆N群，種群間是否發(fā)生過(guò)更替或融合？他們?nèi)绾芜m應(yīng)于環(huán)境的變化，又是怎樣滅絕的？這些問(wèn)題都所知甚少。因此，本文將著重解讀沉積物里首獲滅絕古人類(lèi)核基因組的研究帶來(lái)的對(duì)尼安德特人遺傳歷史的新認(rèn)識(shí)及其方法創(chuàng)新的重要意義；此外還將結(jié)合人類(lèi)化石DNA及其他沉積物研究所發(fā)現(xiàn)的滅絕古人類(lèi)線粒體DNA證據(jù)，厘清尼安德特人的種群多樣性及其種群間分離或替代的歷史。

1 從線粒體DNA到核DNA：沉積物古DNA捕獲方法的新突破

目前，研究人員已從來(lái)自歐亞大陸14個(gè)地點(diǎn)(大多數(shù)在歐洲)的23個(gè)滅絕古人類(lèi)的骨骼或牙齒樣本中提取到全部或部分核基因組[1]，包括18個(gè)尼安德特人[2,17,26～30]、4個(gè)丹尼索瓦人[3,8,31]和1個(gè)有著尼安德特人母親和丹尼索瓦人父親的混血兒[13]。然而，在發(fā)現(xiàn)的大量晚更新世遺址里，出土有滅絕古人類(lèi)骨骸化石的地點(diǎn)還是相對(duì)較少，而且大多數(shù)地點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的骨骸化石都集中在一個(gè)或幾個(gè)地層之中，很多時(shí)候并不能覆蓋相關(guān)地點(diǎn)的全部時(shí)間跨度。這意味著，對(duì)滅絕古人類(lèi)骨骸化石的古DNA研究有著極大的時(shí)空局限性，甚至有時(shí)候因?yàn)楣呛』４媲闆r不佳，還可能無(wú)法提取到相關(guān)古DNA[1]。

早在2017年，Slon等[32]為找到更多滅絕古人類(lèi)演化的線索，通過(guò)開(kāi)發(fā)沉積物古DNA雜交捕獲的方法，從歐洲比利時(shí)Trou Al'Wesse洞、克羅地亞Vindija洞、西班牙El Sidrón洞、法國(guó)Caune de l'Arago洞和Les Cottés洞，及西伯利亞Denisova洞和Chag-yrskaya洞等7個(gè)已知有滅絕古人類(lèi)存在的洞穴沉積物中獲取多例尼安德特人和丹尼索瓦人的線粒體DNA[32]。該研究首次突破人類(lèi)遺骸化石的限制，實(shí)現(xiàn)從沉積物里直接提取史前人類(lèi)的遺傳信息，其制備的相關(guān)文庫(kù)也為后來(lái)沉積物核DNA的提取和研究奠定基礎(chǔ)。

而后，本課題組運(yùn)用這一方法從青藏高原白石崖溶洞距今10～4.5萬(wàn)年的數(shù)個(gè)地層沉積物里獲取丹尼索瓦人的線粒體DNA。這是首次在Denisova洞之外獲取丹尼索瓦人的DNA信息，明確證實(shí)丹尼索瓦人在晚更新世時(shí)期曾長(zhǎng)期生存在青藏高原[33]，表明沉積物古DNA對(duì)探究滅絕古人類(lèi)的時(shí)空分布和環(huán)境適應(yīng)歷史有極大潛力。不過(guò)，線粒體能夠提供的遺傳信息有限，僅可證實(shí)相關(guān)滅絕古人類(lèi)的存在及追溯其母系遺傳的歷史，并不足以反映更為復(fù)雜的祖源成分。要深入了解滅絕古人類(lèi)的演化譜系和更完整的遺傳歷史，則要從核DNA上進(jìn)行突破。

沉積物里含有海量的環(huán)境微生物DNA和哺乳動(dòng)物DNA，要分離并識(shí)別出滅絕古人類(lèi)的線粒體DNA已非常困難，而要識(shí)別出滅絕古人類(lèi)的內(nèi)源核DNA則更具挑戰(zhàn)。沉積物里的絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物DNA都不是人類(lèi)的DNA，而且因?yàn)槿祟?lèi)和其他哺乳動(dòng)物在許多位點(diǎn)都存在同源序列，要識(shí)別出人類(lèi)的DNA非常困難。核DNA信息量大，提取的難度更大。因此，Vernot等[1]在原來(lái)雜交捕獲方法的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)一系列模擬和實(shí)驗(yàn)探索出新的富集方法。具體來(lái)說(shuō)，他們通過(guò)15種靈長(zhǎng)類(lèi)和非靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的多序列比對(duì)識(shí)別出哺乳動(dòng)物核基因組中序列多樣性高的區(qū)域，也就是圍繞一個(gè)目標(biāo)SNP(單核苷酸多態(tài)性，指基因組水平上單個(gè)核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單個(gè)堿基的轉(zhuǎn)換、顛換、插入、缺失等形式)前25 bp和后26 bp的序列片段進(jìn)行比對(duì)時(shí)，經(jīng)計(jì)算和模擬識(shí)別出人類(lèi)和9種非靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物基因組相差超過(guò)8個(gè)堿基對(duì)的區(qū)域，這可極大降低非人源哺乳動(dòng)物DNA錯(cuò)配率并最有效富集人源DNA。根據(jù)以上設(shè)計(jì)思路，他們開(kāi)發(fā)了針對(duì)人類(lèi)基因組中160萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn)的探針組，針對(duì)每個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)有兩個(gè)52 bp的探針，一個(gè)探針包含有目標(biāo)位點(diǎn)的衍生等位基因，一個(gè)探針包含有祖先等位基因，由此通過(guò)雜交捕獲對(duì)序列多樣性高區(qū)域里這些位點(diǎn)的目標(biāo)片段進(jìn)行富集[1]。

Vernot等[1]將這些方法應(yīng)用于西伯利亞阿爾泰山脈中的Denisova洞、Chagyrskaya洞和西班牙北部的Estatuas洞等3個(gè)洞穴100多例沉積物樣本，通過(guò)古DNA捕獲分析，從三個(gè)地點(diǎn)都獲得了尼安德特人的核DNA和線粒體DNA[1]，并得到對(duì)該滅絕古人類(lèi)群體在一個(gè)遺址更完整活動(dòng)歷史及多個(gè)遺址不同種群間互動(dòng)關(guān)系的新的、更全面的理解。

2 化石和沉積物古DNA：共探尼安德特古人類(lèi)的遷徙與演化歷史

在現(xiàn)代人類(lèi)從非洲向世界各地?cái)U(kuò)散之前，尼安德特人已廣泛生活在歐亞大陸西部，但他們起源和擴(kuò)散的歷史仍是未解之謎。迄今尼安德特人最早的形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)證據(jù)可以追溯到約43萬(wàn)年前[34]，而最后的尼安德特人大約在4萬(wàn)年前消失[28,35]。滅絕古人類(lèi)化石的DNA證據(jù)顯示尼安德特人在與丹尼索瓦人分離以后人口規(guī)模迅速擴(kuò)大并向各區(qū)域擴(kuò)散，而后他們長(zhǎng)期以孤立的群體生活，群體內(nèi)部近親繁殖的現(xiàn)象顯著，而基因流動(dòng)程度很低，由此導(dǎo)致人口規(guī)模下降，這也被認(rèn)為是尼安德特人滅絕的可能原因[26～28,36]。

盡管尼安德特人遺傳多樣性遠(yuǎn)低于現(xiàn)代人類(lèi)[36]，但是仍能通過(guò)DNA識(shí)別其不同的種群并探知這些種群間的關(guān)系。Vernot等[1]選取了三個(gè)地點(diǎn)展開(kāi)對(duì)沉積物中滅絕古人類(lèi)核DNA的探索——西伯利亞南部的Denisova洞和Chagyrskaya洞，及西班牙北部的Galeria de las Estatuas洞[1]。

Denisova洞和Chagyrskaya洞均位于阿爾泰山脈，兩地相距約100 km。已有研究從這兩個(gè)地點(diǎn)的人類(lèi)遺骸(約12萬(wàn)年前的阿爾泰尼安德特人- Denisova 5個(gè)體和約8萬(wàn)年前的Chagyrskaya 8個(gè)體)中獲得高覆蓋度的尼安德特人基因組[26,30]。數(shù)據(jù)顯示Chagyrskaya 8相較于同地區(qū)較老的阿爾泰尼安德特人來(lái)說(shuō)，與遠(yuǎn)在克羅地亞更年輕的尼安德特人(約5.2萬(wàn)年前的Vindija 33.19個(gè)體)和歐亞大陸西部其他晚期尼安德特人(高加索北部約7萬(wàn)年前的Mezmaiskaya 1個(gè)體及歐洲比利時(shí)、法國(guó)、克羅地亞4個(gè)約4.7～3.9萬(wàn)年前的個(gè)體)共享有更多的等位基因，即有著更近的遺傳關(guān)系。而就Vindija 33.19個(gè)體和Chagyrskaya 8個(gè)體比較來(lái)說(shuō)，前者與其他歐洲晚期尼安德特人關(guān)系更近，而后者與丹尼索瓦人和尼安德特人的第一代混血兒(約5萬(wàn)年前的Denisova 11個(gè)體)關(guān)系更近，更進(jìn)一步說(shuō)是與Denisova 11個(gè)體的尼安德特人母親的關(guān)系最為密切[13,17,26,28,30,37]。

Vernot等[1]從這兩個(gè)地點(diǎn)沉積物中所捕獲的尼安德特人核DNA的分析結(jié)果與化石DNA的結(jié)果保持一致。具體而言，Denisova洞穴地層沉積物里獲得的2例尼安德特人核DNA經(jīng)分析屬于阿爾泰尼安德特人種群，其中之一(E11.4)來(lái)自阿爾泰尼安德特人所發(fā)現(xiàn)的同一地層(約10.5～12萬(wàn)年前)，另一份(M14.2)則來(lái)自主室同時(shí)期(約9.7～11.2萬(wàn)年前)的地層；Chagyrskaya洞穴所有地層沉積物里獲得的尼安德特人核DNA都屬于Chagyrskaya 8個(gè)體所代表的種群[1,26,30]。這些結(jié)果表明至少有兩個(gè)獨(dú)立的尼安德特人種群分批從歐洲遷至西伯利亞南部阿爾泰山脈，第一批歐洲早期尼安德特人在12萬(wàn)年以前進(jìn)入Denisova洞生活，而后來(lái)的尼安德特人部分進(jìn)入Chagyrskaya洞生活并帶來(lái)了他們的技術(shù)文化(這與考古學(xué)家們針對(duì)這些地點(diǎn)出土的文化器物分析的結(jié)果[38]相印證)，部分則來(lái)到Denisova洞，替換了前一批到來(lái)的尼安德特人種群，并與丹尼索瓦人發(fā)生基因交流。

Denisova洞是發(fā)現(xiàn)過(guò)大量丹尼索瓦人、尼安德特人和兩者混血兒骨骸化石的地點(diǎn)。為找到更多線索，Zavala等[39]此前使用自動(dòng)化實(shí)驗(yàn)方案對(duì)Denisova洞728例沉積物樣本展開(kāi)過(guò)大規(guī)模的線粒體DNA捕獲和研究，發(fā)現(xiàn)該地點(diǎn)最早的居民是丹尼索瓦人，可追溯至約30萬(wàn)年前。尼安德特人則在約17萬(wàn)年前到來(lái)，且兩者在這個(gè)遺址可能發(fā)生多次重疊或更替。另一意外的發(fā)現(xiàn)是研究首次從Denisova洞穴沉積物里獲得早期現(xiàn)代人的線粒體DNA，表明他們約4.5萬(wàn)年前在這里出現(xiàn)[39]。但是，線粒體DNA并不足以探究這三個(gè)人類(lèi)種群之間更為復(fù)雜的互動(dòng)歷史，這也凸顯出沉積物核DNA的提取和研究將對(duì)闡明人類(lèi)演化歷史發(fā)揮重要作用。

沉積物古核DNA富集方法的應(yīng)用，使Vernot等[1]得以從尚未有任何化石古DNA證據(jù)的Estatuas洞穴沉積物里捕獲多個(gè)尼安德特人的線粒體和核DNA，為揭示該地點(diǎn)及更大時(shí)空框架下尼安德特人的遺傳圖譜提供了關(guān)鍵證據(jù)。從線粒體譜系來(lái)看，來(lái)自最深地層、可追溯至約11.3萬(wàn)年前的尼安德特人(GE pit I Layer 4)與歐洲早期尼安德特人(比利時(shí)約12.7萬(wàn)年前的Scladina個(gè)體和德國(guó)約12.4萬(wàn)年前的HST個(gè)體)關(guān)系密切；而來(lái)自其他地層約10萬(wàn)年前的尼安德特人(GE pit I Layer 2-3和GE pit II Layer 2)則與高加索北部尼安德特人(Mezmaiskaya 1)有更近的遺傳關(guān)系[1,28,29]?；诤嘶蚪M的系統(tǒng)發(fā)育分析(圖1)，Vernot等[1]推算出Estatuas洞穴這兩個(gè)不同尼安德特人種群的分化時(shí)間。具體而言，該地點(diǎn)更晚期尼安德特人從最近祖先群體分離出來(lái)的時(shí)間在約10～11.5萬(wàn)年前，與Vindija、Mezmaiskaya 1和Chagyrskaya 8等種群彼此分離的時(shí)間相近。此外，該地點(diǎn)與HST同屬一個(gè)種群的更早期尼安德特人，則是在約12.2～13.4萬(wàn)年前從最近祖先群體分離出來(lái)，與HST、Scladina和阿爾泰尼安德特人等種群彼此分離的時(shí)間相近。這些結(jié)果清楚表明西班牙北部的尼安德特人在約10萬(wàn)年前發(fā)生了種群的更替，且在晚更新世早期存在兩次明顯的尼安德特人向外擴(kuò)散的事件，研究推測(cè)可能與末次冰期環(huán)境氣候的變化有關(guān)[1]。

圖1 Estatuas洞穴沉積物樣本在尼安德特人系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上的分布

尼安德特人系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示尼安德特人群體相繼在約10.5萬(wàn)年前和13.5萬(wàn)年前出現(xiàn)分化，向外發(fā)生輻射。根據(jù)參考文獻(xiàn)[1]修改繪制。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

20世紀(jì)初，Willerslev等[40]已開(kāi)始從沉積物里檢測(cè)和分析史前生物的線粒體DNA，繼而更多研究得以用沉積物里的線粒體古DNA重建遠(yuǎn)古生態(tài)環(huán)境并探尋史前生物的多樣性[41～43]。歷經(jīng)數(shù)十年的探索，沉積物古DNA的提取和研究終于迎來(lái)新的契機(jī)，最近的3項(xiàng)成果在洞穴沉積物的核基因組提取和研究上取得重大突破：Pedersen等[44]從墨西哥北部Chiquihuite洞穴沉積物里提取并識(shí)別出同一地點(diǎn)不同古熊種群的核基因組，Gelabert等[45]從佐治亞州西部Satsurblia洞穴沉積物里直接測(cè)序古老人類(lèi)和多種滅絕哺乳動(dòng)物的核基因組，以及用新方法從多個(gè)洞穴沉積物里富集滅絕尼安德特古人類(lèi)不同種群的核基因組[1]，它們標(biāo)志著沉積物古DNA研究從線粒體DNA向全基因組時(shí)代的跨越。

未來(lái)的沉積物古DNA研究將不再僅局限于識(shí)別遠(yuǎn)古物種、重建古生態(tài)環(huán)境或了解人類(lèi)群體的時(shí)空分布，而是真正邁入全基因組階段，使研究能夠更精確、深入地探究不同人類(lèi)群體在時(shí)空中的交流和演變歷史，及其他生物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。通過(guò)分離沉積物中來(lái)源豐富(遠(yuǎn)古人類(lèi)、動(dòng)物、植物、微生物等)的古DNA，將可能解讀更大時(shí)空范圍因缺乏古生物遺骸而被忽略的遺傳歷史，并在一個(gè)更加宏大的時(shí)空框架里探討遠(yuǎn)古生命起源、演化、擴(kuò)散、適應(yīng)等重大科學(xué)問(wèn)題[2]，通過(guò)豐富的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)繪制此前不為人知的遠(yuǎn)古世界圖景。

感謝中國(guó)科學(xué)院古脊椎動(dòng)物與古人類(lèi)研究所Ethan Andrew Bennett博士對(duì)英文摘要提出建議。

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Exploring the evolution of archaic humans through sedimentary ancient DNA

Wanjing Ping, Yichen Liu, Qiaomei Fu

Recent success in the retrieval of nuclear DNA of ancient humans and animals from cave sediments paves the way for genome-wide studies of past populations directly from sediments. In three studies, nuclear genomes of different species were obtained from the sediments of multiple archeological caves and their genetic histories were revealed, including an unknown population replacement of Neanderthals from Estatuas cave in Spain, which was recovered using a new DNA capture approach. By extending sediments as a source of DNA beyond fossils, this breakthrough is of particular significance to the field of ancient human genomics, which brings about more possibilities for exploring the history of past population migration, evolution and adaptation within larger time-scales and geographical areas where no fossil remains exist. Here, we mainly review the significance of the technical advances in retrieving ancient nuclear DNA from sediments and present new insights into the genetic history of Neanderthals revealed by this technique. By combining ancient genomes retrieved from fossils and additional mitochondrial DNA extracted from sediments of archaeological sites, we may begin investigating diverse archaic populations and examine their genetic relationships, movements and replacements in detail.

sedimentary ancient DNA; nuclear genomes; archaic humans; Neanderthals; Denisovans; hybridization capture; probe-set; population replacement

2022-02-14;

2022-03-11;

2022-03-31

國(guó)家自然科學(xué)基金杰出青年基金(編號(hào)：41925009)，中國(guó)科學(xué)院項(xiàng)目(編號(hào)：YSBR-019，XDB26000000)和騰訊基金會(huì)(科學(xué)探索獎(jiǎng))資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 41925009), the Chinese Academy of Sciences (Nos. YSBR-019, XDB26000000), and the Tencent Foundation (through the XPLORER PRIZE)]

平婉菁，碩士，科研助理/工程師，研究方向：實(shí)驗(yàn)技術(shù)。E-mail: pingwanjing@ivpp.ac.cn

付巧妹，博士，研究員，研究方向：演化遺傳、群體遺傳。E-mail: fuqiaomei@ivpp.ac.cn

10.16288/j.yczz.22-032

(責(zé)任編委: 張蔚)