閆炳儒，艾顯輝，劉淼，田麗紅，梁洋，滕春波

研究報告

利用譜系追蹤方法探究Lgr5在胰腺組織及其類器官中的表達

閆炳儒1，艾顯輝1，劉淼1，田麗紅2，梁洋1，滕春波1

1. 東北林業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150040 2. 東北林業(yè)大學野生動物保護與自然保護地學院，哈爾濱 150040

富含亮氨酸重復序列G蛋白偶聯受體5 (leucine-rich repeat containing G protein-coupled receptor 5, Lgr5)在體內分布廣泛，可以作為多種上皮組織(包括小腸、結腸、胃和毛囊)中干細胞的標記物。為了探究小鼠()胰腺發(fā)育過程中導管上皮細胞及體外培養(yǎng)的胰腺導管類器官中Lgr5的表達情況，本研究利用Lgr5-CreERT2+/–和Rosa26-mTmG雜交后的轉基因小鼠，經Tamoxifen (他莫昔芬)誘導后，觀察不同發(fā)育階段胰腺組織切片的熒光表達情況，并通過三維培養(yǎng)建立成體小鼠胰腺導管類器官，觀察誘導后類器官細胞中的熒光變化。結果顯示：Tamoxifen誘導的正常成體轉基因小鼠胰腺導管內未檢測到表達Lgr5的細胞；通過對孕鼠及哺乳母鼠注射Tamoxifen，在胚胎發(fā)育15.5 d和新生小鼠胰腺中也未發(fā)現Lgr5陽性細胞；但是將4-hydroxy- Tamoxifen (4-羥基–他莫昔芬)添加到培養(yǎng)基中，在Lgr5-CreERT2+/–;Rosa26-mTmG轉基因小鼠胰腺導管來源的類器官中檢測到部分細胞表達Lgr5。本研究結果證實，在成體及胚胎胰腺組織中沒有檢測到Lgr5表達，但在體外培養(yǎng)的胰腺導管類器官細胞中檢測到Lgr5表達。本研究為探索胰腺發(fā)育過程中干/祖細胞特異性表達基因奠定了基礎。

胰腺；導管；Lgr5；類器官；譜系追蹤

富含亮氨酸重復序列G蛋白偶聯受體5 (leucine rich repeat containing G protein-coupled receptor 5, Lgr5)，又名GPR49、HG38、FEX、GPR67和MGC117008，屬于糖蛋白激素受體類，是Wnt激動劑R-spondins的受體，在體內廣泛分布，已經證明其可以作為小腸、胃、肝臟等多個組織中成體干/祖細胞的標記物。利用Lgr5-CreERT2小鼠()，Barker等[1]成功標記了小腸中的干細胞。R-spondins信號在離體類器官形成過程中具有重要作用。已有研究發(fā)現，R-spondins通過激活Lgr5，促進肺、胃、肝、腸、乳腺等多種組織干/祖細胞形成類器官(organoid)[2,3]。

胰腺是人體重要的消化器官，與小腸、肝臟相同，均起源于內胚層形成的原始腸管[4,5]。胰腺由內、外分泌細胞組成，外分泌細胞產生的分泌酶進入消化道，內分泌細胞產生的激素進入血液[6]。目前，成體胰腺組織中是否有多能干/祖細胞及其亞細胞定位一直存在爭議。Gu等[7]研究認為，成體胰腺中的β細胞主要通過自我復制產生，而不是來源于干細胞。也有研究發(fā)現，成人胰腺導管中存在干/祖細胞，能夠介導胰腺再生[8]。近年來利用類器官培養(yǎng)技術，Huch等[9]獲得胰腺導管類器官，但是在成體胰腺導管中沒有檢測到Lgr5陽性細胞，然而在胰腺結扎導管造成的胰腺損傷組織中的導管細胞有Lgr5表達。但是，小鼠早期發(fā)育過程中的胰腺祖細胞是否存在Lgr5表達目前仍不清楚。

為了探討小鼠胰腺發(fā)育過程中導管上皮細胞及體外培養(yǎng)的胰腺導管類器官中Lgr5的表達情況，本研究利用譜系追蹤方法，探究了Lgr5-CreERT2+/–；Rosa26-mTmG轉基因小鼠在胰腺發(fā)育過程中上皮細胞Lgr5的表達情況，進一步分離轉基因小鼠胰腺導管上皮細胞經培養(yǎng)獲得小鼠胰腺導管類器官(mouse pancreatic duct organoid, mPDO)，利用4-hydroxy-Tamoxifen誘導類器官中Cre酶對floxed (flanked)序列的切除，通過觀察熒光變化鑒定是否存在Lgr5的表達。本研究為發(fā)掘胰腺發(fā)育過程中干/祖細胞特異性表達基因，及胰腺類器官的開發(fā)應用等奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Lgr5-CreERT2+/–轉基因小鼠購自賽業(yè)(蘇州)生物科技有限公司，Rosa26-mTmG轉基因小鼠為本實驗室自有，飼養(yǎng)在東北林業(yè)大學生命科學學院SPF級實驗動物室。動物實驗經東北林業(yè)大學實驗動物管理與倫理委員會審查，符合倫理原則。Lgr5-CreERT2+/–是具有Lgr5-Cre等位基因的小鼠，表達CreERT2蛋白。Lgr5-CreERT2+/–與Rosa26-mTmG轉基因小鼠交配產生后代，經Tamoxifen誘導后Cre介導的重組將導致后代Lgr5表達細胞中floxed序列的缺失，該小鼠可用于譜系追蹤，也可用于標記表達Lgr5的干/祖細胞。Rosa26-mTmG小鼠在Cre重組之前，在細胞/組織中廣泛表達細胞膜定位的tdTomato (mT)紅色熒光蛋白，發(fā)生Cre重組后，細胞膜定位的EGFP (mG)熒光表達取代了紅色熒光。本研究使用基因型為Lgr5-CreERT2+/–和Rosa26-mTmG的成年小鼠，經過合籠繁殖出實驗所需要的小鼠，最終所需的轉基因小鼠基因型為Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG。

1.2 Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG轉基因小鼠的構建

選擇健康狀況良好且處于發(fā)情期的Lgr5- CreERT2+/–雄鼠和Rosa26-mTmG雌鼠，雄∶雌為1∶2或1∶3比例合籠，小鼠過了斷奶期分開獨自籠養(yǎng)，直到小鼠性成熟。具體構建模式見圖1。

1.3 小鼠總DNA提取及PCR鑒定

剪取小鼠尾尖(大約0.4～0.6 cm)迅速轉移至研缽加入液氮研磨，直至樣品變?yōu)榘咨勰?。將研磨好的組織粉末移至經過預冷的1.5 mL EP管中，并加入180 μL Buffer GTL，20 μL Proteinase K，渦旋震蕩使樣品徹底混勻，56℃消化。根據DNA提取試劑盒(CW2298M，北京CWBIO公司)說明提取鼠尾DNA。

設計基因引物，基因引物由賽業(yè)(蘇州)生物科技有限公司提供(各引物信息見表1)進行樣品DNA的PCR檢測。構建15 μL PCR擴增體系，包括7.5 μL PCR Master Mixture (2×，P222-AA，南京Vazyme公司)、1 μL上游引物和1 μL下游引物、1 μL DNA模板和4.5 μL ddH2O。采用如下程序進行PCR擴增反應：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，67℃退火35 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)；最后再72℃延伸5 min。

1.4 Tamoxifen誘導

將Tamoxifen (CAS#10540-29-1，美國Sigma公司)以20 mg/mL的濃度配于玉米油中，37℃避光加熱1 h后分裝避光保存至4℃冰箱，以腹腔注射的方式，參照THE JACKSON LABORATORY建議劑量[10,11]，每只小鼠按100 μL/d的劑量注射Tamoxifen，連續(xù)注射5 d。注射停止一周后收集小鼠組織樣本進行切片。

在小鼠胚胎期8.5 d (Embryo 8.5 day，E8.5 d)，發(fā)育的內胚層中假定的胰腺和肝臟開始發(fā)生分離。為了觀察胰腺胚胎發(fā)育時期Lgr5的表達情況，取7～8周齡發(fā)情的Lgr5-CreERT2+/–與Rosa26-mTmG小鼠合籠，次日早上檢測陰道栓，見栓鼠記E0.5 d，于胰腺祖細胞活躍期E9.5 d對孕鼠腹腔注射100 μL Tamoxifen注射液，每24 h注射一次，連續(xù)注射6 d，第7 d收集E15.5 d胎鼠胰腺組織及小腸組織冰凍切片進行觀察。取7～8周齡健康的Lgr5-CreERT2+/–與Rosa26-mTmG小鼠合籠，新生小鼠出生當日記第0 d，出生后24 h給哺乳母鼠注射Tamoxifen，每只哺乳母鼠腹腔注射100 μL Tamoxifen注射液，每24 h注射一次，連續(xù)注射7 d，第8 d收集新生小鼠胰腺組織及小腸組織冰凍切片進行觀察。

1.5 小鼠組織的冰凍切片

利用過量注射戊巴比妥鈉(P11011，美國Merck公司)麻醉處死Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG小鼠，75%的消毒酒精浸潤。從小鼠腹部剪開，取出小腸及胰腺組織。將取出的組織放入1×PBS清洗去掉血漬，然后在解剖顯微鏡下剔除多余的脂肪組織等。將上述處理干凈的胰腺組織放于4%PFA溶液中固定20 min，用30%質量比的蔗糖脫水過夜。用冰凍切片包埋劑(OCT)將胰腺組織進行包埋。將包埋好的樣品冰凍切片做好標記，–80℃凍存。

圖1 Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG小鼠繁育模式圖

表1 PCR引物

F：forward primer；R：reverse primer。

1.6 免疫染色

Lgr5-CreERT2+/–；Rosa26-mTmG成鼠、E15.5胎鼠及新生鼠的小腸、胰腺、胰腺導管組織和類器官冰凍切片于37℃雜交箱放置20～30 min進行烘片，1×PBS洗3遍，每次10 min，洗掉殘留的OCT。4%PFA于37℃固定20 min，除去PFA。用0.3%TritonX 100在37℃孵育20 min。10%HSA (馬血清)于37℃封閉50 min。I抗4℃孵育過夜，I抗包括Lgr5 (1∶100，bs-20746R，北京Bioss公司)和Insulin (1∶100，AF1159，上海碧云天生物技術有限公司)。II抗Alexa Fluor 488標記的驢抗兔IgG H&L (1∶100，bs-0295D- AF488，北京Bioss公司) 37℃孵育1 h，后面全程避光。經DAPI (1∶1000，33259，德國Biofroxx公司)染核5 min。防淬滅劑封片，4℃暗盒短暫保存。

1.7 小鼠胰腺導管類器官的培養(yǎng)

處死成體Lgr5-CreERT2+/–；Rosa26-mTmG轉基因小鼠后，剝離胰腺的主導管，用于類器官的制備。將胰腺主導管置于15 mL離心管，2 mg/mL膠原酶IV于37℃消化15 min，分離導管周圍殘留的組織，劇烈搖晃離心管。將消化好的胰腺主導管重新置于含有無菌PBS的10 cm皿中。利用解剖鏡剝離殘留在導管周圍的組織，PBS沖洗以保證去除多余組織。置于不同的無菌1.5 mL離心管中，用解剖剪刀將胰腺導管盡可能的剪碎，加入2 mg/mL膠原酶IV共1 mL，37℃消化20 min，用1 mL槍頭反復吹打。將消化好的導管細胞于水平離心機300離心5 min。無菌PBS洗3遍，水平離心機300離心5 min。Matrigel基質膠(美國Corning公司)于前一天4℃放置過夜，使其充分溶解成液態(tài)，再用預冷的槍頭吸取Matrigel，重懸消化好的導管細胞，滴于培養(yǎng)板中心，形成一個半球形的凝膠進行三維(three- dimensional, 3D)培養(yǎng)。將培養(yǎng)板于37℃放置10 min，使Matrigel凝固，加入小鼠類器官擴增培養(yǎng)基(mouse expansion medium, mEM)，在37℃含有5%CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，隔天需更換新鮮mEM培養(yǎng)基。mEM主要成分包括D/F12基礎培養(yǎng)基、1%青霉素-鏈霉素、1%Glutamax (美國Hyclone公司)、2%B27 Supplementminus VA (美國Thermo公司)、100 ng/mL R-Spondin-1 (RSPO1，美國R&D公司)、50 ng/mL EGF、25 ng/mL Noggin、100 ng/mL FGF10 (美國Peprotech公司)、1 mmol/L N-acetylcysteine和10 mmol/L Nicotinamide (美國Sigma公司)。

誘導類器官表達Lgr5實驗中使用含有500 nmol/L 4-hydroxy-Tamoxifen (CAS#68047-06-3，美國Sigma公司)的mEM培養(yǎng)mPDO 7～10 d左右，利用熒光顯微鏡觀察類器官熒光變化。

1.8 類器官細胞冰凍切片的制備步驟

去除類器官培養(yǎng)過程中mEM培養(yǎng)液，加入常溫PBS清洗。加入4%PFA，室溫固定15 min。去除PFA后用勺子將含有類器官的Matrigel凝膠放入含有30%蔗糖(PBS配制)的50 mL離心管中，4℃過夜，直至凝膠沉到管底。從蔗糖溶液中取出凝膠，放入含有OCT化合物的模具中，OCT完全凝固后放于–80℃冰箱保存。利用恒溫冷凍切片機切割制備好的類器官模具，制備約10 μm的細胞切片，可放于–80℃冰箱保存。

2 結果與分析

2.1 Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG轉基因小鼠的獲得與鑒定

本研究將Lgr5-CreERT2+/–小鼠與Rosa26-mTmG小鼠雜交，獲得基因型為Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26- mTmG目的轉基因小鼠(圖1)。通過該方法獲得譜系追蹤小鼠后，利用NCBI數據庫查詢基因序列并設計引物，引物由賽業(yè)生物公司提供(表1)。提取小鼠鼠尾DNA作為模板，進行PCR擴增，用2%瓊脂糖凝膠鑒定小鼠基因型。PCR擴增結果顯示，目的條帶為174 bp，與吻合，該結果顯示已經獲得Lgr5-CreERT2+/–;Rosa26- mTmG轉基因小鼠，可用于后續(xù)實驗(圖2)。

2.2 譜系追蹤顯示成鼠胰腺組織沒有Lgr5表達

已有研究表明Lgr5可以用來標記小腸、胃和毛囊組織中的干細胞[12,13]。因此本研究利用Lgr5- CreERT2+/–; Rosa26-mTmG轉基因小鼠觀察成體胰腺組織中上皮細胞Lgr5的表達情況。將7～8周齡轉基因鼠通過注射Tamoxifen激活體內Cre酶的活性，連續(xù)注射5 d，注射結束7 d后收集小腸及胰腺導管組織(圖3A)，其中小腸組織作為陽性對照。結果顯示，小腸切片中觀察到大量EGFP表達細胞(圖3B)，證明小鼠體內Lgr5啟動的Cre酶具有有效的酶活性。將轉基因小鼠的胰腺組織進行連續(xù)切片，導管中未檢測到明顯的EGFP表達(圖3B)。以上結果暗示：在正常的成體小鼠中胰腺導管上皮中沒有Lgr5表達。

圖2 Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG轉基因小鼠PCR鑒定結果

M：DL2000 DNA marker；1：GAPDH，200 bp；2：CreERT2基因鑒定PCR產物，542 bp；3：Lgr5突變體基因鑒定PCR產物，174 bp；4：Lgr5野生型基因鑒定PCR產物，298 bp；5：mTmG純合突變體基因鑒定PCR產物，250 bp；0：negative control。

圖3 Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG成鼠胰腺組織Lgr5表達分析

A：Tamoxifen給藥模式圖；B：熒光顯微鏡觀察Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG小鼠小腸及胰腺導管切片。小腸切片顯示有EGFP表達細胞，證明Tamoxifen誘導成功。EGFP標記Lgr5-CreERT2，顯示為綠色；tdTomato標記細胞膜，顯示為紅色；DAPI染細胞核，顯示為藍色；比例尺：100 μm。

2.3 譜系追蹤顯示新生鼠及E15.5 d胎鼠胰腺組織沒有Lgr5表達

成體小鼠的胰腺導管內未檢測到Lgr5的表達，為進一步探究在增殖和分化活躍的胚胎期或出生后是否有Lgr5標記的祖細胞，本研究通過Tamoxifen誘導制備E15.5 d胎鼠及新生小鼠胰腺及胰腺導管切片(圖4A，圖5A)，觀察胰腺發(fā)育過程中Lgr5的表達情況，小腸上皮切片作為陽性對照。結果顯示，制備的胎鼠及新生鼠的小腸中廣泛表達Lgr5，而胰腺及胰腺導管中沒有檢測到EGFP的表達(圖4B，圖5B)，暗示在小鼠胰腺胚胎和新生時期的胰腺組織中Lgr5也不表達。

2.4 Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG轉基因小鼠胰腺導管類器官的培養(yǎng)

通過分離Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG小鼠原代胰腺導管細胞，經剪碎及胰酶消化，利用Matrigel進行3D培養(yǎng)，制備mPDO，其中mEM(小鼠類器官擴增培養(yǎng)基)參考Barker等[12]建立的小鼠類器官培養(yǎng)成份，通過加入小鼠EGF及RSPO1等類器官生長的必需因子，可以觀察到mPDO增殖形成閉合結構，隨后閉合結構不斷擴增，最終形成較大的囊狀類器官。擴大的囊狀類器官經過吹打消化形成單細胞之后，按1∶3～1∶5比例傳代培養(yǎng)，結果顯示依舊可以保持正常增殖傳代能力(圖6)。

圖4 Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG E15.5 d胎鼠胰腺組織Lgr5表達分析

A：Tamoxifen給藥模式圖；B：熒光顯微鏡觀察Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG E15.5 d胎鼠小腸及胰腺切片圖。EGFP標記Lgr5-CreERT2，顯示為綠色；tdTomato標記細胞膜，顯示為紅色；DAPI染細胞核，顯示為藍色；比例尺：100 μm。

圖5 Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG新生小鼠胰腺組織Lgr5表達分析

A：Tamoxifen給藥模式圖；B：熒光顯微鏡觀察Lgr5-CreERT2+/–;Rosa26-mTmG新生小鼠小腸，胰腺導管和胰腺切片圖。EGFP標記Lgr5-CreERT2，顯示為綠色；tdTomato標記細胞膜，顯示為紅色；Insulin標記胰腺β細胞，顯示為白色；DAPI染細胞核，顯示為藍色；比例尺：100 μm。

圖6 mPDO生長及傳代培養(yǎng)

比例尺：100 μm。

2.5 譜系追蹤顯示小鼠胰腺導管類器官有Lgr5表達

本研究在成體小鼠、新生鼠及E15.5 d胎鼠的胰腺導管內均未檢測到Lgr5的表達。由于Lgr5廣泛用作類器官的特異性標記，因此本研究通過觀察譜系特異性的熒光變化，鑒定Lgr5的表達情況。首先制備了Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG小鼠胰腺導管類器官，在培養(yǎng)基中加入4-hydroxy-Tamoxifen進行培養(yǎng)，在第7 d，與未添加4-hydroxy-Tamoxifen組相比(圖7A)，4-hydroxy-Tamoxifen培養(yǎng)組觀察到明顯的EGFP表達(圖7B)，說明胰腺導管上皮細胞在體外3D培養(yǎng)后生成表達Lgr5的細胞。

3 討論

糖尿病是功能性β細胞量嚴重減少的結果[14]，目前細胞療法有望成為糖尿病的潛在治療方法。但尋找成體胰腺干/祖細胞一直飽受爭議，也存在很多技術限制，因此利用類器官培養(yǎng)技術獲得具有干細胞潛能的胰腺類器官已經成為疾病模型建立、研究損傷再生及胰島移植新的細胞資源[15～17]。

本研究利用3D培養(yǎng)技術建立了小鼠胰腺導管類器官(mPDO)培養(yǎng)系統(tǒng)，發(fā)現mPDO表達干細胞標志基因。利用譜系追蹤方法探討胰腺發(fā)育過程中導管上皮細胞Lgr5體內表達情況，發(fā)現在正常成體小鼠的胰腺導管沒有Lgr5的表達；在增殖和分化活躍的胚胎期和新生小鼠胰腺中也未發(fā)現表達Lgr5的細胞；但在Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG小鼠的原代胰腺導管類器官中檢測到Lgr5的表達。

細胞譜系追蹤(cell lineage tracing)是一種對動物特定細胞進行追蹤的技術[18,19]，基于Cre-系統(tǒng)，可以在組織或細胞中的任何時間進行特異性Tamoxifen誘導以對細胞進行特殊標記，通過檢測標記物來研究被標記細胞的遷移、改變或存在與否等問題[20～23]。本研究所選用的Rosa26-mTmG轉基因小鼠是一種基于Cre-系統(tǒng)的條件基因靶向標記的雙熒光蛋白報告小鼠模型，在Cre酶介導切除之前，細胞膜特異性表達tdTomato紅色熒光蛋白，當Cre介導切除后，細胞膜轉變?yōu)樘禺愋员磉_EGFP綠色熒光蛋白[18,23～25]。本研究通過雜交獲得Lgr5- CreERT2+/–; Rosa26-mTmG轉基因小鼠，經PCR檢測發(fā)現目的條帶與預期大小吻合(圖2)；小腸切片作為陽性對照，觀察到EGFP的表達，說明小鼠體內Tamoxifen能有效誘導Cre酶切割位點，從而反映存在內源性Lgr5表達。

Lgr5屬于糖蛋白激素受體類，是Wnt激動劑R-spondins受體，既可以作為小腸、胃、肝臟等多個組織中成體干/祖細胞的標記物，也可以作為機體(腫瘤)干細胞的標記物，參與Wnt等信號通路維持細胞自我更新，調控分化、增殖、遷移、極性以及凋亡等[12,18,22]。目前在自我更新率低的內胚層來源器官中未觀察到Lgr5的表達，如肝臟或胰腺。但是在肝臟和胰腺損傷后的再生組織中，檢測到Lgr5標記的祖細胞群[26,27]。本研究結果顯示，在成體小鼠胰腺中未觀察到Lgr5表達，與Huch等[26]研究結果一致。我們推測在增殖和分化活躍的胚胎期或新生小鼠中，胰腺組織可能會含有Lgr5標記的祖細胞，然而本研究結果顯示，在胚胎E15.5 d和新生小鼠的胰腺組織也不表達Lgr5。但是最新的研究報道，在妊娠晚期及分娩后母鼠的胰腺中有Lgr5的表達，該研究推測妊娠相關的信號以及妊娠損傷可能會誘導導管附近的胰腺干/祖細胞增殖、分化，進而導致Lgr5表達[28]。但在正常小鼠胰腺導管中，無論是成體還是胎鼠或新生鼠，均沒有發(fā)現Lgr5陽性細胞存在，暗示不適合作為標記胰腺祖細胞的特異基因。

圖7 Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG小鼠胰腺導管類器官Lgr5表達分析

A：熒光顯微鏡觀察Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG成鼠制備的mPDO；B：體外使用4-hydroxy-Tamoxifen誘導培養(yǎng)7 d后的mPDO。EGFP標記Lgr5-CreERT2，顯示為綠色；tdTomato標記細胞膜，顯示為紅色；BF：明場(bright field)；比例尺：100 μm。

本研究進一步利用Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG小鼠原代胰腺導管細胞進行類器官培養(yǎng)，發(fā)現有表達Lgr5陽性細胞出現，且這些Lgr5標記的細胞可以長期在體外擴增，與Barker等[12]研究結果一致。這些結果暗示，在類器官培養(yǎng)過程中，Wnt信號通路可能被激活進而促使干細胞標志物Lgr5表達上調。

綜上所述，本研究證明Lgr5不適合作為胰腺干/祖細胞的特異基因，但可以作為胰腺導管類器官的潛在標記物。本研究結果為干/祖細胞的特異基因的發(fā)掘，及利用胰腺類器官治療糖尿病等胰腺疾病提供了新的思路。

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Study on Lgr5 expression in pancreas tissues and organoids by lineage tracing

Bingru Yan1, Xianhui Ai1, Miao Liu1, Lihong Tian2, Yang Liang1, Chun-Bo Teng1

Leucine rich repeat containing G protein-coupled receptor 5(Lgr5) is widely expressed in multiple tissues and can be used as a stem cell marker in a variety of epithelial organs (including the small intestine, colon, stomach and hair follicles). In this study, we used Lgr5-CreERT2+/–and Rosa26-mTmG hybridized transgenic mice to investigate the expression of Lgr5 in both ductal epithelial cells during pancreas development andcultured pancreatic duct organoids. After induction with Tamoxifen, the Lgr5 expression was analyzed by detecting the enhanced green fluorescence protein in the pancreatic tissue sections in adult animals and embryos at different developmental stages. The results showed that Lgr5 expression was detected neither in adult pancreatic duct epithelia nor in the embryonic pancreatic tissues at day 15.5 or in newborn mice. However, when 4-hydroxy-Tamoxifen was supplemented to the culture medium, EGFP could be detected in the primary pancreatic duct organoids from Lgr5-CreERT2+/–; Rosa26-mTmG mice. These results suggested that Lgr5 was not expressed in adult and embryonic pancreatic tissues; but could be expressed in the cultured pancreas ductal organoids. The research lays the foundation for exploring specific gene expression patterns in stem/progenitor cells during pancreatic development.

pancreas; duct; Lgr5; organoid; lineage tracing

2022-01-26;

2022-03-26;

2022-04-18

國家自然科學基金面上項目(編號：32072801)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.32072801)]

閆炳儒，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：生物學。E-mail: heylr5553@163.com

滕春波，博士，教授，研究方向：細胞生物學。E-mail: chunboteng@nefu.edu.cn

10.16288/j.yczz.22-022

(責任編委: 趙冰)