許振勝 符芳姿 孫南陽

(1 中南大學湘雅醫(yī)學院附屬?？卺t(yī)院腫瘤化療科，海南省?？谑?570208，電子郵箱:22247316@qq.com；2 湖南中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院骨科，湖南省長沙市 410005)

骨肉瘤是小兒和青少年惡性程度最高的骨癌之一，2/5的骨肉瘤患者確診時疾病已處于晚期，僅有1/5的骨肉瘤患者生存期較長[1]。經過20多年的研究探索，目前使用的新輔助化療+手術和放療+化療+靶向藥物等方式治療骨肉瘤已從很大程度上改善患者的預后，但由于腫瘤對化療耐藥、對放療不敏感等問題，患者的總生存率仍未得到明顯提高[2]。因此，如何改善骨肉瘤患者的預后仍然是一個挑戰(zhàn)，研究一種高效低毒的方法治療晚期骨肉瘤迫在眉睫。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶，大量研究結果表明，抑制mTOR通路可誘導骨肉瘤細胞凋亡[3-7]。例如，β-欖香烯通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)/mTOR信號通路上調缺氧誘導因子1α蛋白表達，有助于抑制骨肉瘤細胞凋亡[7]。這提示抑制mTOR通路可以作為治療骨肉瘤的潛在方法。

部分中藥及食品均含有槲皮素，它具有多種生物活性，能抑制骨肉瘤細胞增殖、遷移、侵襲[8]。我們前期研究表明，槲皮素可顯著抑制骨肉瘤MG-63細胞增殖，使其停滯在細胞周期G1期，且以上作用具有明顯的劑量和時間依賴性；同時槲皮素可誘導MG-63細胞凋亡，并誘導細胞自噬[9-10]。本實驗進一步研究槲皮素對骨肉瘤MG-63細胞生長周期的影響，并探討槲皮素是否是通過阻斷骨肉瘤MG-63細胞PI3K-Akt-mTOR通路以發(fā)揮抗腫瘤效應，從而為槲皮素治療骨肉瘤提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞來源與培養(yǎng) 人骨肉瘤 MG-63細胞株來自美國ATCC細胞庫。用6 mL加入胎牛血清和雙抗的高糖杜氏改良伊戈爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM，美國Gibco公司)將MG-63細胞沉淀重懸后接種于培養(yǎng)瓶中，在37℃、飽和濕度及5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，鏡下觀察細胞狀態(tài)及貼壁程度，96 h后將細胞傳代再培養(yǎng)。待細胞長滿細胞培養(yǎng)瓶壁后進行后續(xù)實驗。

1.2 藥物、試劑與儀器 槲皮素由中國藥品生物制品檢定所提供(批號：100081-201708)。Tris緩沖液購自雷根生物技術有限公司(批號：PE0080)；10%聚丙烯酰胺、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)均購自上海源葉生物科技有限公司(批號：S31321、S24295)；蛋白磷酸酶抑制劑、RIPA裂解液均購自上海研生實業(yè)有限公司(批號：S21023、ML4313)；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)購自南京森貝伽生物科技有限公司(批號:1263)；碘化丙啶購自京凱基生物科技發(fā)展有限公司(批號：KGA511)；二喹啉甲酸蛋白濃度測定試劑購自南京建成生物工程研究所(批號：A045-4-2)；Akt、mTOR抗體購自上海莼試生物(批號：CS10044、CS10787);磷酸化Akt(phosphorated Akt,p-Akt)抗體、磷酸化mTOR(phosphorated mTOR,p-mTOR)抗體購自上海谷研實業(yè)有限公司(批號：GOYK96479、GOYK96849)；內參β肌動蛋白(β-actin)抗體購自上海戶實醫(yī)藥科技有限公司(批號：HK13769)；辣根過氧化物酶購自上海澤葉生物科技有限公司(批號：ZY424)；ECL試劑購自北京雅安達生物技術有限公司(批號：WBKIS0100)。超凈工作臺；CO2恒溫培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)；電泳儀(Bio-Rad公司)；臺式冷凍離心機(珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司 )；電泳槽(北京六一生物科技有限公司)；Attune?NxT流式細胞儀(美國Thermo Fisher公司)。

1.3 細胞分組與干預 取細胞，先用PBS洗去培養(yǎng)液， 0.25%胰蛋白酶常溫消化2 min后，細胞形態(tài)變圓，貼壁細胞部分脫落，吹打后制成細胞懸液，以(4～5)×103個/孔的細胞密度接種于96孔板中，每孔接種細胞懸液100 μL，96孔板最外圍一圈只加入培養(yǎng)基，以減少液體蒸發(fā)對實驗結果的影響。將細胞分為對照組和實驗組，每組設3個復孔。對照組中，加入含0.1% DMSO的細胞培養(yǎng)液100 μL作為溶劑對照。根據(jù)前期研究結果，與0 μg/mL槲皮素比較，50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL和250 μg/mL槲皮素均可顯著抑制骨肉瘤MG-63細胞活力，其中200 μg/mL槲皮素可顯著增加骨肉瘤MG-63細胞的晚期凋亡率和壞死，誘導細胞自噬[9-10]。因此本實驗采用200 μg/mL槲皮素50 μL干預細胞作為實驗組。加入相關藥物干預細胞后，將96孔板放置CO2培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)中分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。

1.4 流式細胞儀檢測細胞周期 取干預后48 h的兩組細胞，用0.25%胰蛋白酶消化細胞2 min，待細胞形態(tài)變圓，貼壁細胞部分脫落，吹打后制成細胞懸液，加入至15 mL離心管調整細胞濃度為4×105個/mL。在低速離心機上離心10 min(1 000 r/min，4℃)后小心棄去上清，加入1 mL PBS制成細胞懸液。使用300目尼龍過濾上述細胞懸液后，再使用低速離心機離心10 min(1 000 r/min，4℃)，小心棄去上清，加入PBS 1 mL制成細胞懸液，重復2次。將上述經多次離心清洗后的細胞用200 μL PBS再次吹打至細胞懸液。加入800 μL 預冷的75%乙醇固定2 h以上，并放置于4℃冰箱避光過夜。然后使用低速離心機離心(1 000 r/min，4℃)10 min，棄去上清，加入1 mL PBS再次吹打制成細胞懸液，重復1次；將重懸細胞加入500 μL的PBS緩沖液中(預先配成含100 U/mL RNaseA的PBS)，避光孵育30 min。加碘化丙啶至終濃度為50 μg/mL，室溫避光30 min。過濾后使用流式細胞儀分析各周期的細胞數(shù)目。實驗重復3次。

1.5 蛋白免疫印跡法檢測Akt和mTOR蛋白表達及磷酸化蛋白表達水平 取干預后的兩組細胞，每組細胞加3 mL 4℃預冷的PBS，洗滌細胞2～3次；加入400 μL含苯甲基磺酰氟的RIPA裂解液，于冰上裂解30 min后在4℃下12 000 r/min離心5 min，隨后采用蛋白定量BCA法檢測總蛋白濃度。制膠、預電泳，然后計算需要加樣樣品的體積，按照緩沖液與樣品體積比為4 ∶1的比例加入緩沖液，沸水煮10 min；依次加入標準品和待分析樣品，每個泳道5 μL；加樣完畢后行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，約80 min；設定恒壓20 V轉模，4℃冰箱中過夜；用TBST液洗滌印跡膜10 min，重復2次，然后放入5%脫脂奶粉封閉液中，搖床震動，70 r/min，室溫封閉1 h。分別加入一抗Akt(1 ∶2 000稀釋)、p-Akt(1 ∶2 000稀釋)、mTOR(1 ∶1 000稀釋)、p-mTOR(1 ∶1 000稀釋)、內參β-actin(1 ∶4 000稀釋)，4℃冰箱中孵育24 h。TBST沖洗3次，經過1 ∶2 000稀釋的KPL(用辣根過氧化物酶耦合后)在常溫孵育1 h；孵育結束后用TBST沖洗3次，使用ECL 試劑顯影、曝光后，使用Image J軟件測定條帶灰度值，以目的蛋白的灰度值與內參蛋白灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達量，實驗重復3次。

1.6 統(tǒng)計學分析 運用SPSS 17.0軟件包進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 兩組骨肉瘤MG-63細胞周期分布情況 與對照組比較，實驗組的G1期細胞比例增加，而S期細胞比例減少(均P<0.05)，但兩組G2期細胞比例差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1和圖1。

表1 兩組骨肉瘤MG-63細胞周期分布的比較(x±s，%)

圖1 兩組骨肉瘤MG-63細胞周期分布情況

2.2 兩組骨肉瘤MG-63細胞Akt和mTOR蛋白表達及磷酸化蛋白表達水平的比較 干預后48 h，實驗組的p-Akt、p-mTOR蛋白相對表達水平低于對照組(均P<0.05)，但兩組Akt、mTOR蛋白相對表達水平差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。見表2和圖2。

表2 兩組骨肉瘤MG-63細胞Akt和mTOR蛋白相對表達水平及磷酸化蛋白表達水平的比較(x±s)

圖2 兩組骨肉瘤MG-63細胞Akt、mTOR總蛋白及磷酸化蛋白表達水平

3 討 論

細胞周期是指細胞分裂完成后至下一個分裂結束的整個過程，一般分為DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)及細胞分裂期(M期)。本實驗結果提示，給予槲皮素干預后大多數(shù)MG-63細胞停滯在G1期，這表明槲皮素可使骨肉瘤細胞停滯在DNA合成前期，從而有效抑制骨肉瘤細胞進行DNA合成。這與其他研究結果[11]相似，提示骨肉瘤細胞生長周期停滯在G1期與槲皮素增加了細胞G1/S期骨肉瘤細胞數(shù)目有關。由此可見，槲皮素可通過影響骨肉瘤細胞的增殖，而發(fā)揮治療骨肉瘤的作用。

PI3K-Akt-mTOR介導的信號通路是與mTOR有關的主要關鍵通路，通路中的Akt主要被上游的PI3K激活,Akt的磷酸化程度可以間接反映PI3K的活化水平，此外磷酸化的Akt可直接激活mTOR。癌癥的發(fā)生是一個多階段的過程，在此過程中，負責細胞周期調節(jié)和分裂的信號通路的活性被破壞，從而導致細胞的凋亡受到抑制，細胞的增殖得到增強。PI3K-Akt-mTOR是細胞信號傳導的重要通路之一，在癌細胞中該通路處于過度激活狀態(tài)，從而抑制了癌細胞的自噬死亡，因此抑制該通路的激活可以起到一定抗癌作用[12]。本課題組前期研究表明，槲皮素可抑制骨肉瘤MG-63細胞凋亡，促進MG-63細胞自噬進程，誘發(fā)細胞自噬[9-10]。而mTOR是細胞凋亡和自噬過程的共同上游調控靶點[5-6，13]，且mTOR的激活與骨肉瘤細胞的生長、增殖、轉移有關[6]。由此推測，抑制mTOR通路的激活可作為治療骨肉瘤的候選策略。本研究結果顯示實驗組的p-Akt、p-mTOR蛋白相對表達水平低于對照組(均P<0.05)，表明槲皮素可抑制MG-63細胞內Akt和mTOR的磷酸化、PI3K的活化(Akt磷酸化的程度可以間接反映PI3K活化的水平)，這表明槲皮素能有效抑制PI3K-Akt-mTOR通路的激活，這或許是其發(fā)揮抑制骨肉瘤細胞增殖的機制。在其他研究中，槲皮素也表現(xiàn)出類似的生物學效應：如槲皮素可以通過Akt-mTOR途徑上調高糖培養(yǎng)RSC96細胞的自噬[14]；槲皮素能夠有效地抑制肝惡性腫瘤細胞SMMC-7721的增殖，其機制可能是使SMMC-7721細胞周期阻滯于G0/G1期，通過上調第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因的表達抑制Akt活化從而促進細胞凋亡[15]。以上研究結果進一步佐證了本實驗的可靠性。

綜上所述，槲皮素可能通過阻斷PI3K-Akt-mTOR通路阻滯骨肉瘤MG-63細胞生長，從而發(fā)揮抗骨肉瘤效應。該通路或成為槲皮素抑制骨肉瘤MG-63細胞增殖的主要靶點，為相關抗癌藥物的研發(fā)提供理論數(shù)據(jù)支持。但槲皮素是否存在其他調控通路發(fā)揮抗腫瘤作用仍需進一步研究。