宋宇 叢培東 曲貴偉 楊清海

（遼東學院，遼寧 丹東 118003；第一作者：763869365@qq.com）

土壤微生物不僅是土壤的重要組成部分，也是土壤養(yǎng)分循環(huán)的主要驅動力[1]。土壤微生物在調節(jié)土壤肥力、植物修復、碳氮等養(yǎng)分循環(huán)方面發(fā)揮著重要作用[2-4]。土壤微生物多樣性可作為生態(tài)系統(tǒng)功能的敏感指標，指示生態(tài)環(huán)境變化和生態(tài)系統(tǒng)功能變化[5]。據(jù)估計，在實驗室條件下培養(yǎng)的微生物僅占這些種群的一小部分（＜1%）。隨著高通量測序技術的發(fā)展，人們對土壤微生物區(qū)系的研究也越來越深入，這為全面分析微生物群落的分類、系統(tǒng)發(fā)育和功能多樣性提供了可能[6-8]?，F(xiàn)代農業(yè)生產利用化肥降低了病害率并提高了作物產量，使得化肥的貢獻率達到40%～60%[9-10]。但隨著農業(yè)生產的高度現(xiàn)代化和集約化發(fā)展，大量施用化肥后造成了土壤板結、土壤微生物區(qū)系結構破壞進而降低了土壤養(yǎng)分轉化的驅動力[11]。因此，減施化肥及尋求生物肥料代替化學肥料達到增長效力已成為當前研究的熱點[12-13]。李全勝等[14]通過增施微生物肥提高了玉米干物質的積累，最終獲得高產。國外相關研究表明，通過在土壤中植入PGPR（生長促進根桿菌）可增加作物根際區(qū)域微生物數(shù)量，促進植物生長[15]。進入21世紀，人們將魚、蝦、蟹和鴨等養(yǎng)殖生物引入稻田進行復合種養(yǎng)生產綠色稻米，既保持了土壤肥力，又提高了產量，取得了良好效果[16-17]。目前國內外對稻田復合種養(yǎng)模式的研究集中在水稻增長、病蟲害控制等方面[18-20]，對稻田土壤微生物的群落結構研究還較少。本實驗采用高通量測序技術對河蟹稻田（sdhxz）、非洲雁稻田（sdfyz）和龍蝦稻田（sdlxz）土壤細菌群落結構及多樣性進行比較分析，以為復合種養(yǎng)模式研究提供相關數(shù)據(jù)，并為種養(yǎng)工藝的改進提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與DNA提取

土壤樣品采集于遼寧東港市北井子鎮(zhèn)蓋家壩農場。在水稻結穗期分別在河蟹、龍蝦和非洲雁三種復合種養(yǎng)稻田上隨機選5點，采集0～10.0 cm表層土壤，后將從5點采集的土樣混合為1個樣品，每個樣品重復3次。鮮土混勻裝入50 mL離心管后于-80℃冷凍保存用于多樣性分析。采用E.Z.N.A.SoilDNA試劑盒（OmegaBio-tek,Norcross,GA,U.S.）對3種土壤樣品分別進行總DNA提取。用紫外分光光度法和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的總DNA濃度和質量。

1.2 高通量16sr RNA焦磷酸測序

在基因文庫構建中，細菌16 srRNA基因通過PCR擴增，用于靶向超可變V3～V4區(qū)的引物。通用引物338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCAG和806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。PCR程序如下：首先，95℃溫度下2 min作為初始變性，然后25個循環(huán)，變性、退火和延伸溫度及時間依次為95℃、30 s，55℃、30 s，72℃、30 s，最后72℃延伸5 min。反應物的總體積為50μL，包括1×Pfx擴增緩沖液、0.4 mM dNTP、2 mM MgSO4、0.4μM每對引物、DNA模板10 ng/μL 1μL和2 U鉑Pfx DNA聚合酶，使用TruSeq SBS試劑盒V3在Illumina Hiseq 300中對提取的DNA進行高通量測序。

1.3 細菌群落與生物多樣性分析

高通量測序后，對序列進行聚類操作，將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組，1個小組就是1個OUT，利用微生物生態(tài)學的定量研究（QIIME）對97%相似水平的OTU進行生物信息統(tǒng)計分析[21]。為了得到每個OTU對應的物種分類信息，采用RDPclassifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并分別在門和屬水平上統(tǒng)計各樣本的群落組成[22]。利用Mothur軟件進行物種多樣性、豐富度及覆蓋度信息統(tǒng)計。

2 結果與分析

2.1 細菌群落多樣性和總體結構差異

在對V3～V4區(qū)進行測序后，9個樣本共獲得1171636個原始序列數(shù)，用QIIME“標準管-線”過濾低質量讀數(shù)并修剪引物、適配器和條形碼后，如表1所示，三種模式稻田土壤分別獲得24 345～30 306個高質量的有效序列數(shù)、2 168～2 540個OTU數(shù)。sdlxz的有效序列數(shù)和OTU數(shù)均高于sdhxz和sdfyz，說明sdlxz的物種數(shù)目要高于sdhxz和sdfyz。表1也展示了樣品的不同復合種養(yǎng)模式土壤的α多樣性指數(shù)變化情況。α多樣性是指一個特定區(qū)域或者生態(tài)系統(tǒng)內的多樣性，常用的度量標準有Chao、Ace、Shannon、Simpson等指數(shù)。其中，Chao和Ace指數(shù)用于分析群落物種的豐富程度，數(shù)值越大表示物種種類越多；Shannon和Simpson指數(shù)是反映群落的多樣性，不僅反映物種豐富度，還指示了物種的均勻度。Shannon數(shù)值越大，表示該樣品中的物種多樣性越高，而Simpson指數(shù)反之。sdhxz的Ace、Chao和Shannon指數(shù)均高于sdlxz和sdfyz，且sdhxz的Ace和Chao指數(shù)與sdfyz差異顯著。sdhxz的Simpson指數(shù)低于sdlxz和sdfyz，說明sdhxz中土壤細菌的多樣性和豐富度均高于另外兩組稻田。

表1 16Sr RNA基因文庫97%相似性的OTU豐富度和多樣性指數(shù)比較

稀釋曲線是比較生態(tài)系統(tǒng)中物種多樣性常用的方法，本研究繪制了三種復合種養(yǎng)模式土壤組的稀釋曲線（圖1）。每組3次重復，共9條稀釋曲線。結果表明，這些樣品的稀釋曲線不接近漸近線，表明每個樣品都具有高度多樣性的微生物群落，進一步測序將在每個樣品中產生更多的OTUs。這些曲線表明sdlxz的OTUs高于另外兩組。

圖1 樣品稀釋曲線

Venn圖可用于統(tǒng)計多個樣本中所共有和獨有的物種數(shù)目，可以比較直觀的展現(xiàn)不同環(huán)境樣本中物種組成相似性及重疊情況。圖2顯示，sdhxz、sdlxz和sdfyz的OUT數(shù)分別是2 540、2 570和2 168，三種稻田共有OTU數(shù)是1 638，sdhxz、sdlxz和sdfyz獨有的OTU數(shù)分別是111、119和332，說明sdlxz的物種數(shù)目最多，sdfyz的獨有物種數(shù)目最多。

圖2 物種Venn分析圖

β多樣性分析是通過不同微生物群落間的物種多樣性進行的組間比較分析，可探索不同分組樣本間群落組成的相似性或差異性。常用的分析方法有樣本層級聚類分析、PCA分析、PCoA分析和NMDS分析等。距離Heatmap圖可以呈現(xiàn)樣本層級聚類分析結果，該圖可通過顏色變化反映樣本間的距離變化大小。距離越大說明樣本特征值組成差異越大即2個樣本越不相似。從圖3可以看出，sdfyz與sdhxz和sdlxz的距離較遠，說明非洲雁稻田的細菌群落結構和河蟹和龍蝦稻田有較大差異；sdhxz和sdlxz的距離較近，說明河蟹稻田和龍蝦稻田的細菌群落結構相近。

圖3 稻田土壤細菌群落距離Heatmap圖

2.2 細菌群落組成的差異

圖4為門的平均相對豐度，分類序列為13個門，以變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、藍藻菌門（Cyanobacteria）、糖桿菌門（Saccharibacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、厚壁菌門（Firmicutes）和綠菌門（Ignavibacteria）為主，占90%以上。圖4也顯示了三種復合種養(yǎng)模式稻田土壤細菌群落的主要門成分。sdhxz中擬桿菌門、酸桿菌門、儉菌總門（Parcubacteria）的豐度值分別為13.6%、6.9%和1.4%，均高于另外兩組。其中，儉菌總門只在sdhxz和sdlxz中有，而在sdfyz中未發(fā)現(xiàn)。sdlxz中變形菌門和藍藻菌門的豐度值分別為41.8%和7.0%，均高于sdfyz和sdhxz。sdfyz中綠彎菌門和放線菌門的豐度值則分別為15.1%和13.9%，高于sdhxz和sdlxz。厚壁菌門、綠菌門和芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）在三種模式的稻田土壤中均有，但豐度較低。仍有許多序列在樣品土壤中豐富，但不能進行分類，說明土壤仍然是一個極具挑戰(zhàn)性的生物多樣性庫。

圖4 三種模式下稻田土壤門水平的細菌組成豐度圖

屬級的深入分析研究顯示出土壤樣品中優(yōu)勢菌群的富集趨勢。每個樣品中的任何一個屬的相對豐度均小于7%，表明3個樣品組的細菌多樣性均較高。如表2所示，所有土壤樣品中共獲得26個屬，其中優(yōu)勢菌屬norank_f_Anaerolineaceae、norank_c_Cyanobacteria、norank_c_Bacteroidetes_VadinHA17、norank_p_Saccharibacteria和Pseudarthrobacter分別屬于變形菌門、擬桿菌門、藍藻菌門和放線菌門。

2.3 細菌群落屬的比較

本研究在sdhxz、sdlxz和sdfyz中各自發(fā)現(xiàn)了一些獨特的屬。sdhxz中發(fā)現(xiàn)Nitrospira、Geobacter、norank_c_SBR2076和norank_c_OPB35等4個特殊屬；sdlxz有norank_f_Cytophagaceae特殊屬；sdfyz有Llumatobacter、Paenisporosarcina、norank_f_Nitrosomonadaceae、norank_f_Saprospiraceae和Triobacillus等5個特殊屬（表2）。norank_o_Sc_1_84、Sideroxydans、norank_f_Lentimicrobiaceae、norank_f_Gallionellaceae、Sulfuricurvum等5個屬在sdfyz中未發(fā)現(xiàn)，而存在于sdhxz、sdlxz中。norank_c_SJA_15、norank_f_Alcaligenaceae和norank_c_Acidobacteria則存在于sdhxz和sdfyz中。Pseudarthrobacter和norank_f_Xanthomonadales_Incertae_sedis則在sdlxz和sdfyz田中發(fā)現(xiàn)，而sdhxz沒有。

表2 三種模式下稻田土壤不同屬的分布

3 討論與結論

土壤是一個非常復雜的生態(tài)系統(tǒng)，土壤微生物在土壤中起著重要的作用。高通量測序是研究土壤微生物多樣性的良好方法，可用于土壤微生物群落DNA特異性片段的高質量測序。本研究利用Illumina高通量測序技術，研究了稻田不同復合種養(yǎng)模式的土壤細菌群落的多樣性、組成和相對豐度。研究結果揭示了不同養(yǎng)殖動物對微生物群落的影響。

對16SrRNA基因的V3~V4區(qū)進行測序，共獲得1 171 636個原始序列和581 818個有效序列，然后在97%的相似度水平上聚類成3 101個OUT，可將細菌分為48門、115綱、223目、39科、71屬、1 335種。通過與數(shù)據(jù)庫的比較，發(fā)現(xiàn)三種復合種養(yǎng)模式的優(yōu)勢菌門相近，均為變形菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、放線菌門和酸桿菌門，但各門在土壤樣品中的相對豐度有所不同，變形菌門在河蟹、龍蝦和非洲雁三種稻田的平均相對豐度分別為36.73%、41.82%和36.37%，擬桿菌門分別為15.62%、14.30%和13.32%，綠彎菌門分別為13.64%、9.42%和15.11%，放線菌門分別為6.87%、11.80%和13.92%，而酸桿菌門則分別為6.87%、11.80%和13.92%。Venn圖顯示，河蟹稻田、龍蝦稻田和非洲雁稻田的OTU數(shù)分別是2 540、2 570和2 168，三種稻田共有OTU數(shù)是1 638，河蟹稻田、龍蝦稻田和非洲雁稻田獨有的OTU數(shù)分別是111、119和332，說明龍蝦稻田的物種數(shù)目最多，非洲雁稻田的獨有物種數(shù)目最多。這些可能與土壤結構、養(yǎng)分等因素有關。

變形菌門是三種復合種養(yǎng)模式土壤的優(yōu)勢菌門，研究證實，營養(yǎng)豐富的環(huán)境適合于該菌門的快速生長[23]。該細菌大多為革來氏陰性菌，其中許多細菌負責固氮和多環(huán)芳烴。根據(jù)以往的研究，無論作物品種還是土地管理實踐的不同，酸桿菌門都是相似的[24]。腸道內的擬桿菌門數(shù)量在三種模式的土壤中占據(jù)細菌總數(shù)的1/4以上，說明其隨河蟹、龍蝦和非洲雁的排泄物排放到土壤中可作為肥料改良土壤。放線菌門廣泛存在土壤和水生態(tài)系統(tǒng)中，在分解和腐殖質形成過程中起著關鍵作用[25]。綠彎菌門的主要營養(yǎng)方式是化能異養(yǎng)型，除此之外還包括化能自養(yǎng)、光能自養(yǎng)、光能異養(yǎng)及混合營養(yǎng)型。同一物種可隨外界條件的改變切換所需要的不同營養(yǎng)模式，因此使得綠彎菌門可以驅動自身各種代謝與外界物質交換來獲取和利用能源、碳源等參與了C、N、S等一系列重要生源元素的生物地球化學循環(huán)過程[26]。三種復合種養(yǎng)模式稻田土壤測序共獲得26個屬，每種稻田都有獨有的屬類。河蟹稻田有4種獨有屬類，龍蝦稻田1種，非洲雁稻田則有5種。

國外研究證實，生物多樣性越高生態(tài)系統(tǒng)越穩(wěn)定[27]。本研究中，河蟹稻田和龍蝦稻田α多樣性相關指數(shù)都優(yōu)于非洲雁稻田，究其原因可能是河蟹和龍蝦是爬行動物且具有尖銳的足，在稻田爬行過程中能很好的疏松土壤，增加土壤的通透性，利于更多微生物生長，而非洲雁是站立行走的動物且鴨蹼扁平，在行走過程中減少了土壤的透氣性，限制了微生物的生長。同時本研究結果顯示，河蟹稻田細菌群落的豐富度和多樣性均高于龍蝦稻田，說明在三種復合種養(yǎng)稻田中，河蟹稻田有更好的土壤細菌生態(tài)組成。