蔡 欣，周婷婷，朱 進(jìn)，孫學(xué)偉，劉曉光，楊 展，汪茂榮

0 引 言

新型冠狀病毒肺炎(Corona virus disease 2019，COVID-19)疫情持續(xù)暴發(fā)，對(duì)全球公共衛(wèi)生構(gòu)成了嚴(yán)重威脅[1]。嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)是一種包膜陽(yáng)性單鏈基因組RNA病毒(+ssRNA)[2-4]，與SARS冠狀病毒、MERS冠狀病毒同屬巢病毒目，冠狀病毒科，正冠狀病毒亞科，β屬冠狀病毒[3-5]，SARS-CoV-2傳染性極強(qiáng)，傳播迅速，主要通過(guò)呼吸道飛沫和接觸傳播[6-8]。COVID-19患者的常見(jiàn)臨床癥狀為發(fā)熱、咳嗽、劇烈頭痛、肌痛和乏力，重癥病例還會(huì)出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征、多器官衰竭等[9-10]。由SARS-CoV-2引起的COVID-19正在全球大流行，對(duì)國(guó)際衛(wèi)生和全球經(jīng)濟(jì)構(gòu)成嚴(yán)重威脅[11]。因此，急需建立SARS-CoV-2的快速檢測(cè)方法，并應(yīng)用于SARS-CoV-2檢測(cè)工作，對(duì)疫情防控具有重要意義。重組酶介導(dǎo)的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(recombinase-aided amplification，RAA)是在恒溫條件下，大腸埃希菌中提取和純化的重組酶與引物形成復(fù)合體，該復(fù)合體與DNA鏈緊密結(jié)合，在單鏈結(jié)合蛋白協(xié)同下DNA完成解鏈，在DNA聚合酶的作用下不斷反應(yīng)形成新的DNA互補(bǔ)鏈，不斷重復(fù)這一過(guò)程，反應(yīng)產(chǎn)物呈指數(shù)級(jí)高效增長(zhǎng)[12]，最終實(shí)現(xiàn)核酸的擴(kuò)增[12-13]。本研究基于RAA技術(shù)建立了SARS-CoV-2的熒光RT-RAA法和可視化的RT-RAA-LFD法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料MiniBEST質(zhì)粒純化試劑盒，TaKaRa公司；RT-RAA核酸擴(kuò)增試劑盒(熒光法)、RT-RAA核酸擴(kuò)增試劑盒(試紙條法)，一次性膠體金側(cè)向流免疫層析試紙條，江蘇奇天基因生物科技有限公司；熒光定量PCR儀，Bio-Rad公司；B-6100 RAA 恒溫振蕩離心儀、F-1620恒溫核酸擴(kuò)增檢測(cè)儀，江蘇奇天基因生物科技有限公司；-20 ℃冰箱，中國(guó)Haier公司；Eppendorf移液器，德國(guó)Eppendorf公司。

1.2方法

1.2.1 引物探針合成選擇從全球流感數(shù)據(jù)共享倡議(GISAID)(https://www.gisaid.org/)下載的核衣殼蛋白(N)基因、刺突蛋白(S)基因及開(kāi)放閱讀區(qū)(ORF1ab)基因作為靶區(qū)。根據(jù)江蘇奇天基因生物科技有限公司RAA設(shè)計(jì)原則分別設(shè)計(jì)上下游引物和探針，在每個(gè)基因的保守區(qū)域內(nèi)運(yùn)用Primer Premier 5在該擴(kuò)增片段上分別設(shè)計(jì)3條上游引物、3條下游引物和1條探針。利用NCBI 網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Primer-BLAST驗(yàn)證引物和探針的特異性。所有引物和探針均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，并采用高效液相色譜法(HPLC)進(jìn)行純化。

1.2.2重組質(zhì)粒構(gòu)建從NCBI 網(wǎng)站上(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載人類冠狀病毒-OC43 (Human Coronavirus-OC43, HCoV-OC43)、人類冠狀病毒-229E,(human coronavirus-229E, HCoV-229E)、人類冠狀病毒- HKU1 (human coronavirus- HKU1, HCoV-HKU1、人類冠狀病毒-NL63 (Human Coronavirus-NL63, HCoV-NL63)、中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)、重癥急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus, SARS- CoV)的基因序列，運(yùn)用DNAMAN軟件挑選出一段保守基因片段，委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成質(zhì)粒，載體為PUC57質(zhì)粒。采用與RT-RAA方法相同的引物擴(kuò)增SARS-CoV-2的3個(gè)基因片段，也用同樣的方法合成質(zhì)粒。使用MiniBEST質(zhì)粒純化試劑盒提取質(zhì)粒后測(cè)定質(zhì)粒濃度，于-20 ℃冰箱保存。各基因的預(yù)期拷貝數(shù)根據(jù)之前的研究計(jì)算[14]。

1.2.3RT-RAA方法的建立熒光RT-RAA最佳引物對(duì)的篩選 以1.2.2中構(gòu)建的含有SARS-CoV-2 N、S、ORF1ab基因組DNA序列的質(zhì)粒作為模板，將設(shè)計(jì)的3條上游引物、3條下游引物進(jìn)行3×3組合，結(jié)合探針，按照說(shuō)明書(shū)與熒光RT-RAA核酸擴(kuò)增試劑盒中其他試劑混合為50 μL的擴(kuò)增體系，以去離子水為陰性對(duì)照。將反應(yīng)體系置于B-6100 RAA 恒溫振蕩離心儀中震蕩混勻2 min后，轉(zhuǎn)移至F-1620恒溫核酸擴(kuò)增檢測(cè)儀，39 ℃恒溫條件下反應(yīng)12 min，每20 秒采集 1次熒光值。挑選出起峰時(shí)間最早、峰值最高的上下游引物組合作為最佳引物。

熒光RT-RAA引物濃度和探針濃度優(yōu)化 在50 μL擴(kuò)增體系中分別加入1.5、1.8、2.1、2.4和2.7 μL原始濃度為10 μmol/L的上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，以濃度為105拷貝數(shù)/μL質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光RT-RAA核酸擴(kuò)增，篩選出最佳引物濃度。在擴(kuò)增體系中分別加入0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 μL原始濃度為10 μmol/L的探針進(jìn)行擴(kuò)增，以濃度為105拷貝數(shù)/μL質(zhì)粒為模板進(jìn)行RT-RAA擴(kuò)增，篩選出最佳探針濃度。

1.2.4RT-RAA-LFD法的建立在熒光RT-RAA法優(yōu)化的條件下，將熒光法挑選好的引物和探針序列設(shè)計(jì)成試紙條法的引物和探針。將設(shè)計(jì)好的引物探針按照熒光RT-RAA法優(yōu)化好的50 μL體系配置好反應(yīng)管，將反應(yīng)管置于B-6100 RAA 恒溫振蕩離心儀中震蕩混勻2 min后，恒溫39 ℃條件下反應(yīng)12 min。反應(yīng)結(jié)束后的擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)膠體金側(cè)向流免疫層析試紙條檢測(cè)。從反應(yīng)管中用移液器取出5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，與95 μL PBS緩沖液在1.5 mL EP管中混勻，將試紙條的偶聯(lián)墊末端垂直插入EP管中，使其接觸混合液，2 min 后取出試紙條觀察并拍照記錄結(jié)果(陽(yáng)性樣品出現(xiàn)紅色檢測(cè)線和藍(lán)色質(zhì)控線而陰性樣品不出現(xiàn)紅色檢測(cè)線僅出現(xiàn)藍(lán)色質(zhì)控線)。

1.2.5靈敏性實(shí)驗(yàn)以SARS-CoV-2 3種基因的質(zhì)粒為模板進(jìn)行靈敏性評(píng)價(jià)。將構(gòu)建的含有SARS-CoV-2 3種基因序列的質(zhì)粒按濃度梯度10倍倍比稀釋制備成100～1010拷貝數(shù)/μL陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品備用。利用優(yōu)化好的兩種RT-RAA反應(yīng)擴(kuò)增體系依次對(duì)上述定量樣品進(jìn)行檢測(cè)，確定方法的檢出限。同時(shí)將SARS-CoV-2重組質(zhì)粒熒光定量試劑盒(RT-PCR)在熒光定量PCR儀上按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間約為120 min，比較兩種方法的敏感性。

1.2.6特異性實(shí)驗(yàn)采用與呼吸道感染相關(guān)或者臨床癥狀相近的病毒樣本進(jìn)行特異性的評(píng)價(jià)。以6種在人群中較為常見(jiàn)的冠狀病毒(HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、MERS-CoV、SARS)及SARS-CoV-2質(zhì)粒模板同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)SARS-CoV-2熒光RT-RAA法和RT-RAA-LFD法的特異性。

1.2.7重復(fù)性試驗(yàn)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)設(shè)置一個(gè)陰性對(duì)照，3個(gè)重復(fù)對(duì)照，陰性對(duì)照使用1 μL ddH2O為模板，重復(fù)對(duì)照使用1 μL 105拷貝數(shù)/μL濃度的SARS-CoV-2質(zhì)粒DNA為模板。樣品加入后，各反應(yīng)管充分混合，根據(jù)SARS-CoV-2熒光RT-RAA法和RT-RAA-LFD法的實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 SARS-CoV-2 RT-RAA 擴(kuò)增體系的建立

2.1.1 引物、探針篩選以濃度為105copies/μL 3種質(zhì)粒分別為模板，陰性對(duì)照用ddH2O為模板，進(jìn)行熒光RT-RAA擴(kuò)增，篩選出最佳引物探針組合。N基因最佳引物探針為：N-F(上游引物) CAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAG，N-R(下游引物)CAGTTTGGCCTTGTTGTTGTTGGCCTTTAC，N-probe(探針)CAGACATTTTGCTCTCAAGCTGGTTCAATC/i6FAMdT//idSp//iBHQ1dT/CAAGCAGCAGCAAAG (C3-spacer)。S基因最佳引物探針為：S-F CTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATG，S-R GTTGGTTGGACTCTAAAGTTAGAAGTTTGATAG，S-probe CCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCC/i6FAMdT/C/idSp/C/iBHQ1dT/CAGAAACAAAGTGTACG(C3-spacer)。ORF1ab基因最佳引物探針為：ORF1ab-F TACGCCAAGCTTTGTTAAAAACAGTACAATTCTG，ORF1ab-R GGCATTAACAATGAATAATAAGAATCTACAACAGG，ORF1ab-probe TTGTTGGTGTACTGACATTAGATAATCAAGATC/i6FAMdT/C/idSp/A/iBHQ1dT/GGTAACTGGTATGATTTCG(C3-spacer)。擴(kuò)增在2～5 min 內(nèi)即開(kāi)始起峰，在12 min內(nèi)達(dá)到峰值。

2.1.2引物和探針濃度的優(yōu)化以濃度105copies/μL 3種SARS-CoV-2質(zhì)粒分別為模板，ddH2O為陰性對(duì)照，將濃度為10 μmol/L的3種引物加樣量設(shè)置5個(gè)梯度進(jìn)行熒光RT-RAA，引物體積為2.1 μL，擴(kuò)增曲線正常，效果最佳。同樣，探針體積為0.6 μL時(shí)，擴(kuò)增效果最佳。該方法的最佳體系見(jiàn)表1。

表 1 RT-RAA最佳反應(yīng)體系

2.2RT-RAA-LFD法的建立利用熒光法篩選好的引物和探針更改熒光標(biāo)記的位置，設(shè)計(jì)出RT-RAA-LFD法的引物和探針。N基因最佳引物探針為：N-F(上游引物) CAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAG，N-R-L(試紙條法下游引物)(Biotin)CAGTTTGGCCTTGTTGTTGTTGGCCTTTAC，N-probe-L(試紙條法探針)(FAM)CAGACATTTTGCTCTCAAGCTGGTTCAATCT/idSp/TCAAGCAGCAGCAAAG (C3-spacer)。S基因最佳引物探針為：S-F CTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATG，S-R-L (Biotin)GTTGGTTGGACTCTAAAGTTAGAAGTTTGATAG，S-probe-L (FAM)CCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTC/idSp/CTCAGAAACAAAGTGTACG (C3-spacer)。ORF1ab基因最佳引物探針為：ORF1ab-F TACGCCAAGCTTTGTTAAAAACAGTACAATTCTG，ORF1ab-R-L (Biotin)GGCATTAACAATGAATAATAAGAATCTACAACAGG，ORF1ab-probe-L (FAM)TTGTTGGTGTACTGACATTAGATAATCAAGATCTC/idSp/ATGGTAACTGGTATGATTTCG(C3-spacer)。

2.3靈敏性實(shí)驗(yàn)SARS-CoV-23種基因的熒光RT-RAA 法靈敏性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明12 min左右SARS-CoV-2 N基因,S基因101-1010拷貝數(shù)的樣本均有擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，100拷貝數(shù)樣本和陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增曲線，SARS-CoV-2 ORF1ab基因100-1010拷貝數(shù)的樣本均有擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，僅陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增曲線，見(jiàn)圖1。由此可見(jiàn)SARS-CoV-2 ORF1ab基因在3種基因中的靈敏性最好，可達(dá)100拷貝數(shù)。RT-RAA-LFD法的靈敏性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2?？傻贸鯯ARS-CoV-2 N基因、S基因、ORF1ab基因最低檢出限均為103拷貝數(shù)。SARS-CoV-2 RT-PCR法的靈敏性為102拷貝數(shù)。3種方法經(jīng)過(guò)比較，在本研究中SARS-CoV-2 N基因、S基因的熒光RT-RAA 法靈敏性比RT-PCR法高10倍左右，SARS-CoV-2 ORF1ab基因的熒光RT-RAA 法靈敏性比RT-PCR法高100倍左右，試紙條法的靈敏性略低于RT-PCR法。說(shuō)明熒光RT-RAA法具有較高靈敏性，RT-RAA-LFD法在具有可視化優(yōu)勢(shì)的情況下兼顧了靈敏性。

2.4特異性試驗(yàn)SARS-CoV-2熒光RT-RAA法特異性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。顯示只有SARS-CoV-2樣本出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，為陽(yáng)性擴(kuò)增，其他樣本如HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、MERS-CoV、SARS樣本及陰性對(duì)照均沒(méi)有擴(kuò)增，為陰性。RT-RAA-LFD法檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。顯示只有SARS-CoV-2質(zhì)粒DNA出現(xiàn)紅色檢測(cè)線和藍(lán)色質(zhì)控線，為陽(yáng)性，其他樣本(HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、MERS-CoV、SARS)及陰性對(duì)照僅出現(xiàn)藍(lán)色質(zhì)控線，為陰性結(jié)果。表明本實(shí)驗(yàn)建立的SARS-CoV-2熒光RT-RAA法和RT-RAA-LFD法具有較高的特異性。

a:SARS-CoV-2 N; b:SARS-CoV-2S; c：ORF1ab

a:SARS-CoV-2 N; b:SARS-CoV-2S; c：ORF1ab

a:SARS-CoV-2 N; b:SARS-CoV-2S; c：ORF1ab

a:SARS-CoV-2 N; b:SARS-CoV-2S; c：ORF1ab

2.5重復(fù)性試驗(yàn)按照表1的最佳體系配制好1個(gè)陰性對(duì)照、3個(gè)重復(fù)對(duì)照按照熒光RT-RAA法和RT-RAA-LFD法的實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。熒光RT-RAA法實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示3個(gè)重復(fù)組擴(kuò)增反應(yīng)起峰時(shí)間基本相同，曲線形態(tài)較為接近，表明熒光RT-RAA法具有良好的重復(fù)性。RT-RAA-LFD法的結(jié)果見(jiàn)圖6。3個(gè)實(shí)驗(yàn)組均出現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性，陰性對(duì)照顯示結(jié)果為陰性，表明RT-RAA-LFD法重復(fù)性也非常好。

a:SARS-CoV-2 N; b:SARS-CoV-2S; c：ORF1ab

a:SARS-CoV-2 N; b:SARS-CoV-2S; c：ORF1ab

3 討 論

COVID-19疫情的暴發(fā)已在全球造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生危機(jī)[15]，最初，SARS-CoV-2是通過(guò)傳統(tǒng)的聚合酶鏈反應(yīng)試驗(yàn)和測(cè)序確定的。隨后，SARS-CoV-2 RT-PCR法迅速建立，并在國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用[16-20]。但對(duì)于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)和基層條件匱乏地區(qū)來(lái)說(shuō)，缺乏足夠的專業(yè)操作人員和特殊的儀器設(shè)備。本實(shí)驗(yàn)所開(kāi)發(fā)的熒光RT-RAA法和RT-RAA-LFD法均在39 ℃恒溫條件下12 min內(nèi)完成，與其他方法相比，大大節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間。此外，熒光RT-RAA檢測(cè)系統(tǒng)和RT-RAA-LFD檢測(cè)系統(tǒng)均不需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)室設(shè)置、熟練的人員和昂貴的設(shè)備，可以使用便攜式設(shè)備。這對(duì)及時(shí)準(zhǔn)確診斷 SARS-CoV-2感染非常有幫助，特別是實(shí)驗(yàn)室環(huán)境之外的海關(guān)、機(jī)場(chǎng)和基層醫(yī)院等情況。這種方法有可能減少獲得可靠結(jié)果所需的時(shí)間，有助于早期識(shí)別 SARS-CoV-2感染患者，也有助于有效使用疫情防控物資，更好地制定有效的檢疫措施，并幫助臨床試驗(yàn)的治療。

本研究基于RAA技術(shù)設(shè)計(jì)了RT-RAA熒光法和RT-RAA-LFD法的特異引物和探針，優(yōu)化反應(yīng)體系，兩種RT-RAA 檢測(cè)法具有快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，熒光RT-RAA法僅需要一臺(tái)小型便攜的熒光擴(kuò)增儀即可完成檢測(cè)，可適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，尤其在海關(guān)、機(jī)場(chǎng)及基層偏遠(yuǎn)地區(qū)。在條件不允許的的情況下我們也可以使用RT-RAA-LFD法，由于可視化方法要借助試紙條，所以靈敏性不如熒光檢測(cè)，但該方法無(wú)需特殊儀器即可完成檢測(cè)，對(duì)條件受限地區(qū)SARS-CoV-2的檢測(cè)有重要意義，具有較好的發(fā)展前景。世界衛(wèi)生組織網(wǎng)站上也提供了一些引物和探針供參考。目前尚無(wú)文獻(xiàn)系統(tǒng)地比較了以往報(bào)道的引物和探針之間的優(yōu)先性[21]，目前已證實(shí)ORF1ab、N和S基因引物比其他引物具有更高的敏感性、特異性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值[21-22]。本研究建立的兩種方法具有良好的靈敏性和特異性，與前述研究結(jié)論相同。

同時(shí)，本研究也具有一定的不足，首先，本實(shí)驗(yàn)使用的為合成的質(zhì)粒做模板，并沒(méi)有使用臨床樣本做模板，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中我們需要繼續(xù)收集臨床樣本，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的靈敏性、特異性和重復(fù)性；其次，針對(duì)RT-RAA-LFD法，由于需要打開(kāi)試驗(yàn)管進(jìn)行操作，具有污染的可能性，目前我們采用試劑配制和反應(yīng)在不同房間，并在試驗(yàn)后用核酸清除劑處理，最大限度減少核酸污染情況。