顏南，王潤新，王正東，劉洪，張珉，張忠

（沈陽醫(yī)學院 1.康復教研室；2.2015級本科生；3.解剖學教研室；4.計算機教研室；5.病理學教研室，沈陽 110034）

2015年我國流行病學調查結果顯示，胃癌發(fā)生率為29.31/10萬，居癌癥死亡原因第三位［1］，晚期胃/胃食管交界處胃癌患者中位生存期通常＜1年［2］。因此，早期篩查和靶向治療對于胃癌的早期發(fā)現(xiàn)、診斷及治療至關重要。胃癌的篩查方法包括胃鏡、X線鋇餐檢查，血清幽門螺桿菌抗體檢測，胃萎縮（胃癌癌前病變）標志物，如血清生長激素釋放肽或血清胃蛋白酶原檢測等［3］。內窺鏡或手術病理活檢是診斷胃癌的金標準，胃癌相關的血清腫瘤標志物也可作為胃癌輔助診斷依據(jù)，但其靈敏度及特異度均不佳［4］。雖然HER2、EGFR、VEGFR等靶基因可用于胃癌靶向治療，但因胃癌具有細胞分化程度低、增殖速度快、侵襲性強等性質，以上靶向治療均未能獲得良好的預期效果［5］。

大多數(shù)的疾病都會發(fā)生基因翻譯及轉錄方面的特異改變，尤其癌癥這種遺傳或表觀遺傳改變的疾病，基因表達的改變對癌癥的發(fā)生發(fā)展進程有重要影響?；蛐酒夹g和生物學分析方法的結合是探究胃癌等疾病發(fā)生、發(fā)展分子機制的有效方法之一［6］。因此，本研究擬利用生物信息學方法篩選影響胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的核心基因，以探索胃癌發(fā)病的分子生物學機制。

1 材料與方法

1.1 生物信息數(shù)據(jù)庫及分析工具

本研究采用的數(shù)據(jù)庫包括基因表達數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/GEO），癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）（https：//portal.gdc.cancer.gov），韋恩圖（Biological venn，Bio venn）數(shù)據(jù)庫（http：//bioinformatics.psb.ugent.be），注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫（Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID）（http：//www.david.niaid.nih.gov），京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）（https：//www.genome.jp/kegg），基因蛋白質相互作用檢索（search tool for the retrival of interacting genes/proteins，STRING）數(shù)據(jù)庫（http：//string.db.org），Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫（http：//kmplot.com/analysis）。

1.2 生物信息學分析方法

在GEO數(shù)據(jù)庫中，限定選項篩選獲得數(shù)據(jù)集。利用GEO2R對數(shù)據(jù)集進行差異表達分析。保存GEO2R的分析結果，導入R studio，使用R包plot函數(shù)進行火山圖繪制，P＜ 0.05時，logFC＜0為下調基因，用藍色表示，logFC＞0為上調基因，用紅色表示。用GraghPad Prism8.0繪制熱圖，將兩芯片共有基因數(shù)據(jù)logFC導入Prism表格中，最小值用綠色表示，基準值用黃色表示，最大值用紅色表示。進入Bio venn在線制圖軟件，制作差異基因的韋恩圖。在TCGA數(shù)據(jù)庫中下載有關胃癌的病理數(shù)據(jù)，導入R中提取注釋信息和分組信息，使用R語言DESeq2包進行基因的差異表達分析，篩選差異表達基因（P＜ 0.05，logFC＜-1為下調基因，logFC＞1為上調基因）。通過DAVID在線分析對共有差異基因進行基因本體（gene ontology，GO）功能注釋及KEGG信號通路富集分析。通過STRING在線分析工具獲得共有差異蛋白之間的互作圖。利用Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫對互作基因進行生存分析，繪制基因與胃癌患者的生存曲線可視化圖。

2 結果

2.1 GEO胃癌數(shù)據(jù)

GEO數(shù)據(jù)庫篩選2個微列陣數(shù)據(jù)集GSE79973、GSE55696，數(shù)據(jù)均為GPL570芯片平臺。GSE79973包括10個胃癌樣本和10個正常樣本；GSE55696包括19個低級別上皮內瘤變（low-grade intraepithelial neoplasia，LGIN）、20個高級別上皮內瘤變（high-grade intraepithelial neoplasia，HGIN）、19個早期胃癌（early gastric cancer，EGC）和19個慢性胃炎組織樣本。TCGA-STAD數(shù)據(jù)集包括343個胃癌樣本和30個胃炎樣本。

2.2 差異表達基因

通過GEO2R在GSE55696中篩選出2 145個差異基因，包括822個下調基因和1 323個上調基因，在GSE79973中篩選出551個差異基因，獲得128個下調基因和383個上調基因。TCGA數(shù)據(jù)庫胃癌病理數(shù)據(jù)經(jīng)R語言DESeq2包進行篩選差異表達基因標準化處理后，共獲得14 053個差異表達基因。兩芯片及TCGA篩選出胃癌差異基因總體表達情況見圖1。

圖1 兩芯片及TCGA篩選胃癌差異基因表達火山圖Fig.1 Two microarrays and TCGA were used to screen out the volcanogram of differentially expressed genes in gastric cancer

韋恩圖獲得27個共有差異基因，見圖2。其中，17個基因（上調基因IRX3、FCRL5、FAM3D、GHRL、

圖2 2組數(shù)據(jù)差異基因韋恩圖Fig.2 The venn diagram of difference gene between the two groups

TRPA1、SLC5A9、LRRC31、IRX2、APOA1、SLC51A、HMGCS2、ACE2、MT1M、PCK1、ALDOB，下調基因FNDC1、NKX3-2）是和TCGA-STAD的共同差異表達基因。胃癌組織中，25個基因（HMGCS2、NPY6R、GHRL、IRX3、TRPA1、ACE2、CSHL1、CFAP74、KNG1、FCRL5、SLC2A2、FAM3D、MEP1B、MT1M、LRRC31、PDILT、PCK1、SLC5A9、TMPRSS15、CPA6、IRX2、CHIA、ALDOB、APOA1、SLC51A）表達上調，2個基因（FNDC1、NKX3-2）表達下調。根據(jù)兩芯片數(shù)據(jù)共有的27個基因logFC值作為基因表達情況制作熱圖，進一步驗證了上述結果。見圖3。

圖3 兩芯片數(shù)據(jù)集基因表達熱圖Fig.3 The heat maps of gene expression in two chip datasets

2.3 GO功能分析和KEGG通路分析結果

GO功能分析顯示，27個共有差異表達基因主要存在于細胞外空隙、分泌顆粒內腔，具有金屬羧肽酶活性，參與亨利恒等循環(huán)、葡萄糖的跨膜轉運、胰島素分泌的負調節(jié)和膽固醇生物合成等生物過程，見表1。

表1 差異表達基因本體論分析Tab.1 Ontological analysis of differentially expressed genes

KEGG通路分析顯示，27個差異表達基因出現(xiàn)在過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR）信號通路、炎癥介質對瞬時受體電位（transient receptor potential，TRP）通道的調節(jié)、膽固醇代謝、碳水化合物的消化吸收、刺激神經(jīng)組織中的交互、缺氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信號通路、膽汁分泌、胰島素的耐受性、酮體的合成和降解、補體系統(tǒng)、礦物質吸收、鞘脂類信號通路、磷酸戊糖途徑、維生素的消化吸收、腎素-血管緊張素系統(tǒng)等39個信號通路。由于有3個基因（HMGCS2、Apo-AI、PEPCK）顯著富集于hsa03320 PPAR 信號通路，見圖4。因此，在影響胃癌發(fā)生的相關諸多主要信號通路中篩選出PPAR信號通路。

圖4 PPAR信號通路圖Fig.4 The diagram of the PPAR signal pathway

2.4 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡分析

將27個共同差異基因導入STRING數(shù)據(jù)庫進行PPI分析，在得到的PPI網(wǎng)絡中，發(fā)現(xiàn)7個關鍵基因（SLC2A2、HMGCS2、ALDOB、PCK1、APOA1、KNG1、ACE2）相互密切作用，見圖5。其中，PCK1、ACE2、APOA1、HMGCS2、ALDOB是與TCGA-STAD共有差異表達基因。

圖5 共有差異基因蛋白質-蛋白質相互作用圖Fig.5 The protein-protein interaction map of the shared differential gene

2.5 核心基因與生存率的關系

為了獲得差異表達基因表達水平改變對患者生存率的影響，應用Kaplan-Meier數(shù)據(jù)庫在線分析了7個關鍵基因和患者總體生存率之間的關系。結果顯示，SLC2A2、HMGCS2、APOA1和KNG1高表達的胃癌患者生存率較低，與正常人群的總體生存率比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。其中，HMGCS2、APOA1屬于TCGA-STAD共有差異表達基因。見圖6。

圖6 差異基因生存曲線圖Fig.6 The survival curve of differential gene

3 討論

胃癌的發(fā)生是一個多因素參與、多步驟漸進的過程，涉及遺傳因素、癌前狀態(tài)、飲食因素等。研究顯示，p53、NGAL、TBL1XR1、FZD7、FAT4、NDRG1、BRD4、LKB1、CHFR、BUBI、MAD2以及部分微RNA（micro RNA，miRNA）在胃癌細胞凋亡、增殖、轉移、侵襲、血管生成等機制中發(fā)揮重要作用。

本研究從GEO基因表達數(shù)據(jù)庫中篩選數(shù)據(jù)集，并利用GEO2R分析胃癌組織和正常組織中顯著差異表達基因，共獲得27個共有差異基因。其中，3個基因（HMGCS2、APOA1、PEPCK）顯著富集于PPAR信號通路，主要影響腫瘤的微環(huán)境，并誘導胃癌發(fā)展。PPAR作為核激素受體超家族成員，與細胞核中的類維生素AX受體（retinoid X receptor，RXR）形成異源二聚體后，與靶基因的PPAR反應元件結合發(fā)揮作用［7］。在膀胱、膠質瘤、肝臟、腎臟和胃癌、食道癌中，PPAR信號失調集中參與多種代謝過程相關的共同下游通路［8］。用特定的 COX-2抑制劑治療過表達COX-2胃細胞株MKN45可導致PPARα表達時間和劑量依賴性的抑制［9］。胃癌細胞系MGC803中，PPAR-γ呈高表達，PPAR-γ在免疫系統(tǒng)、糖脂代謝、脂肪形成等生物過程中起重要作用，與肥胖、高血壓、帕金森病、癌癥等發(fā)展有關。抑制PPAR-γ功能可能是治療和預防胃癌的一種新方法［10］。GO和KEGG結果提示，膽固醇代謝途徑在癌癥發(fā)生過程中可發(fā)揮一定作用，另有研究［11］表明膽固醇穩(wěn)態(tài)基因可以調節(jié)腫瘤發(fā)育。

本研究中，通過Kaplan-Meier plotter分析發(fā)現(xiàn)，7個互作差異基因中，SLC2A2、HMGCS2、APOA1、KNG1基因高表達的胃癌患者預后明顯較差。SLC2A2（GLUT2）是溶質載體家族2成員，為滿足腫瘤細胞高代謝需求，腫瘤細胞通過溶質載體 ［SLC2A，葡萄糖轉運體（glucose transporters，GLUT）］高速運輸葡萄糖，尤其在細胞缺氧、缺血狀態(tài)下表達水平會明顯增高。研究［12］發(fā)現(xiàn)，HIF-1、Ras、c-Myc、PI3KAkt及p53途徑都對GLUT有調節(jié)作用。腫瘤細胞葡萄糖代謝速率增加說明其在惡性增殖過程中需要葡萄糖代謝的支持，研究提示在多種惡性腫瘤中葡萄糖轉運蛋白尤其是GLUT1的表達增加。研究［13］表明，SLC2A2與糖代謝異常疾病、肝癌有關，SLC2A2可能是影響肝細胞癌的一個重要因素。HMGCS2是生酮限速酶，研究［14］顯示HMGCS2與腫瘤血管生成有關，還可能與大鼠非酒精性脂肪肝、結腸癌有關，在結直腸癌和口腔鱗狀細胞癌患者中，HMGCS2表達水平與臨床預后不良有關［15］。提示HMGCS2可能是未來治療晚期癌癥的一個重要靶點。APOA1是正常人體組織中表達的蛋白質，研究［16］顯示其表達與胃癌的浸潤深度、淋巴結分期及分型呈明顯負相關。KNG1具有抗血管生成和抑制內皮細胞增殖的作用，晚期結腸直腸腺瘤患者KNG1明顯差異表達［17］，可作為早期結直腸癌的標志物［18］。APOA1和HMGCS2屬于TCGA-STAD數(shù)據(jù)集中差異表達的基因，并同屬于顯著富集于PPAR信號通路且與TCGA-STAD有交集的共有差異表達基因，且位于PPI網(wǎng)絡相互作用最緊密的7個基因構成的模塊中，因此，認為APOA1和HMGCS2在胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制中具有重要的意義。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)PPAR信號通路及SLC2A2、HMGCS2、APOA1、KNG1基因均可影響胃癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究結果為胃癌的易感基因鑒定、分子化的靶向治療、預后評價提供了新的研究方向。