張弘揚(yáng)，李思嘉，李巍

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，沈陽 110001）

甲狀腺癌是一種常見的腫瘤，可發(fā)生于所有年齡段［1］。目前，針對(duì)甲狀腺癌的診斷主要依靠超聲和經(jīng)皮細(xì)針穿刺，治療手段上則以手術(shù)和I131放射治療為主。雖然，這種成熟的診斷和治療方案得到了廣泛的認(rèn)可，但是，關(guān)于甲狀腺癌的預(yù)后分析仍然是學(xué)者們探討的熱點(diǎn)。

眾所周知，腫瘤細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境的紊亂多由供氧不足導(dǎo)致。缺氧可使基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生異常，也可能在遺傳不穩(wěn)定性、腫瘤發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮作用。已有研究［2］表明，缺氧引起腫瘤微環(huán)境的變化，促進(jìn)炎癥發(fā)生、免疫抑制和治療抵抗，從而誘發(fā)肺癌。

近年來，研究者們致力于利用缺氧相關(guān)標(biāo)志物評(píng)估腫瘤的預(yù)后。例如，3個(gè)缺氧相關(guān)基因（PDSS1、CDCA8和SLC7A11）被用于構(gòu)建肝細(xì)胞癌的預(yù)后、復(fù)發(fā)和診斷模型［3］。基于缺氧相關(guān)基因，開發(fā)了缺氧風(fēng)險(xiǎn)模型來評(píng)估膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后［4］。這些缺氧相關(guān)預(yù)后獨(dú)立模型的建立對(duì)癌癥患者的綜合治療做出了重大貢獻(xiàn)。本研究旨在為甲狀腺癌患者的綜合治療提供新的、可靠的預(yù)后標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 缺氧相關(guān)基因的獲得

甲狀腺癌樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)從腫瘤與癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）網(wǎng)站下載，其中，包括510份甲狀腺癌樣本數(shù)據(jù)和58份癌旁樣本數(shù)據(jù)，以供進(jìn)一步分析。根據(jù)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05和| log2FC |＞1，獲得2 215個(gè)差異表達(dá)基因，結(jié)合從hypoxiaDB數(shù)據(jù)庫（此數(shù)據(jù)庫為人類缺氧相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白的研究提供了一個(gè)完整的最新數(shù)據(jù)庫）下載的差異表達(dá)基因，共獲得了373個(gè)差異表達(dá)的缺氧相關(guān)基因。

1.2 功能分析

為進(jìn)一步了解基因本身的功能，以及基因可能參與的通路，采用clusterProfiler進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）分析及京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析，以研究差異表達(dá)的缺氧相關(guān)基因之間的功能相關(guān)性。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將缺氧相關(guān)基因映射至STRING數(shù)據(jù)庫，以創(chuàng)建一個(gè)交互網(wǎng)絡(luò)來闡明差異表達(dá)基因之間的關(guān)聯(lián)。隨后，采用Cytoscape軟件對(duì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了可視化處理。

1.4 缺氧相關(guān)標(biāo)志物預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建與驗(yàn)證

用Cox單因素回歸分析鑒定與總生存時(shí)間相關(guān)的差異表達(dá)缺氧相關(guān)基因，并結(jié)合每個(gè)基因特定回歸系數(shù)（β），構(gòu)建患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=β（基因1）×表達(dá)量（基因1）+β（基因2）×表達(dá)量（基因2）+……+β（基因n）×表達(dá)量（基因n）。

從整個(gè)甲狀腺癌TCGA數(shù)據(jù)庫中隨機(jī)選擇50%甲狀腺癌樣本（n=255）作為實(shí)驗(yàn)組，其余50%甲狀腺癌樣本（n=255）作為驗(yàn)證組，在2組根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分公式，以中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分為臨界點(diǎn)，將患者分為低危組和高危組。用Kaplan-Meier分析評(píng)估2組的生存差異，并用log-rank統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行比較。受試者操作特 征（receiver operating characteristic，ROC）曲線和Harrell一致性指數(shù)用于評(píng)估模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。最后，采用單變量Cox回歸分析來確定風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、年齡、腫瘤TNM分期以及性別之間的獨(dú)立預(yù)后功能。

1.5 預(yù)測(cè)模型的內(nèi)部驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證該模型的預(yù)測(cè)能力，從整個(gè)甲狀腺癌TCGA數(shù)據(jù)庫中隨機(jī)選擇了50%甲狀腺癌樣本作為內(nèi)部驗(yàn)證數(shù)據(jù)集（n=255）。采用C指數(shù)評(píng)估所建立模型的性能。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用R語言分析TCGA數(shù)據(jù)庫。繪制Kaplan-Meier生存曲線，并通過log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行比較。多因素Cox回歸分析用于建立缺氧相關(guān)基因的預(yù)后預(yù)測(cè)模型。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用R語言進(jìn)行。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)缺氧相關(guān)基因的鑒定

從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲得2 215個(gè)差異表達(dá)的甲狀腺癌基因，結(jié)合hypoxiaDB數(shù)據(jù)庫，共獲得373個(gè)差異表達(dá)的缺氧相關(guān)基因。圖1A、1B所示為373個(gè)差異表達(dá)的缺氧相關(guān)基因中的前30個(gè)基因。其中，只有1個(gè)上調(diào)基因（CCND1），而下調(diào)基因有29個(gè)。采用箱氏圖來總結(jié)甲狀腺癌和癌旁組織之間30個(gè)差異表達(dá)的缺氧相關(guān)基因的表達(dá)模式，見圖1C。

圖1 缺氧相關(guān)基因的差異表達(dá)Fig.1 Differentially expressed hypoxia-related genes

2.2 差異表達(dá)的缺氧相關(guān)基因的功能富集分析

對(duì)差異表達(dá)的缺氧相關(guān)基因進(jìn)行功能富集分析有助于理解其生物學(xué)作用。GO富集分析的前10個(gè)生物學(xué)過程和KEGG富集分析的前10個(gè)通路分析如圖2所示。差異基因的生物學(xué)過程主要涉及“細(xì)胞外結(jié)構(gòu)組織”“含有膠原的細(xì)胞外基質(zhì)”和“細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)成分”（圖2A）。而差異基因的通路分析主要涉及“PI3K-Akt信號(hào)通路”“細(xì)胞因子-細(xì)胞因子-受體相互作用”和“MAPK信號(hào)通路”（圖2B）。

圖2 差異表達(dá)的缺氧相關(guān)基因的功能富集分析Fig.2 Functional enrichment of differentially expressed hypoxia-related genes

2.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與重要基因模塊

為了充分了解缺氧相關(guān)基因的差異表達(dá)，利用Cytoscape軟件構(gòu)建了一個(gè)交互式蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。采用Cytoscape軟件中的分子復(fù)合物檢測(cè)（MCODE）工具來識(shí)別重要的基因模塊（hub genes），并篩選出3個(gè)重要的基因模塊。

2.4 缺氧相關(guān)基因的鑒定與預(yù)后

采用單變量Cox回歸分析確定與甲狀腺癌患者預(yù)后相關(guān)的缺氧相關(guān)基因。森林圖顯示有23個(gè)基因在甲狀腺癌患者中具有顯著的預(yù)后價(jià)值（P＜ 0.05，圖3A）。進(jìn)一步的多變量Cox回歸分析共鑒定出11個(gè)基因（P＜ 0.05，圖3B）。

圖3 差異表達(dá)基因的單因素和多因素分析Fig.3 Univariate and multivariate analysis of differentially expressed genes

2.5 多因素Cox回歸分析預(yù)測(cè)公式的建立

根據(jù)以下公式建立基因風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分：遺傳風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=0.792 6×SLC6A8+0.806 4×STC1+0.7867×PTGIS-1.057×SLC24A3-0.349 2×DPP4-0.749 2×ANK2-1.204 0×APOE+0.521 1×PIM1+3.085 0×PHKG1+0.547 3×AKR1C3+1.171 4×NDRG1。根據(jù)缺氧相關(guān)基因的預(yù)后公式，在實(shí)驗(yàn)組和驗(yàn)證組中分別確定了這些基因在不同風(fēng)險(xiǎn)人群中的分布以及患者的生存率。為了確定11個(gè)缺氧相關(guān)基因在預(yù)測(cè)甲狀腺癌患者臨床預(yù)后中的作用，進(jìn)一步繪制了Kaplan-Meier生存曲線，以分析實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中高危組和低危組的不同生存時(shí)間。Kaplan-Meier 分析結(jié)果顯示，高危組患者的生存率明顯低于低危組，見圖4。

圖4 基于缺氧相關(guān)基因的甲狀腺癌預(yù)后指標(biāo)驗(yàn)證Fig.4 Verification of prognostic indicators for thyroid cancer based on hypoxia-related genes

采用11個(gè)與缺氧相關(guān)的基因構(gòu)建了2組甲狀腺癌患者1年、3年和5年生存率的ROC曲線，來評(píng)估模型的預(yù)測(cè)性能（圖5）。在實(shí)驗(yàn)組中，ROC曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.943（1年）、0.897（3年）和0.831（5年）。而在驗(yàn)證組中，AUC分別為0.944（1年）、0.964（3年）和0.992（5年）。

圖5 基于缺氧相關(guān)基因的預(yù)后指標(biāo)顯示出良好的預(yù)測(cè)性能Fig.5 Prognostic indicators based on hypoxia-related genes showed good predictive performance

對(duì)甲狀腺癌患者的臨床數(shù)據(jù)（包括風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分）的預(yù)后價(jià)值進(jìn)行單因素Cox回歸分析（表1），結(jié)果顯示，構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分在預(yù)后評(píng)估中具有較高的預(yù)測(cè)價(jià)值。

表1 甲狀腺癌患者潛在標(biāo)志物的單變量分析Tab.1 Univariate analyses of potential markers for thyroid cancer patients

3 討論

近年來，甲狀腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，對(duì)人類健康構(gòu)成了重大威脅。在美國，男性和女性甲狀腺癌的檢出率均有所上升，從1975年的每10萬人中可檢出4.9例上升至2014年的每10萬人中14.3例［4］。同時(shí)，由于5年特異性生存率差的低分化甲狀腺癌的存在［5］，對(duì)甲狀腺癌的預(yù)后研究更為關(guān)鍵。

隨著對(duì)缺氧引起的腫瘤微環(huán)境變化的深入了解以及TCGA和hypoxiaDB數(shù)據(jù)庫的完善，學(xué)者們將更多的目光放在了通過缺氧相關(guān)基因來預(yù)測(cè)腫瘤的預(yù)后［6-7］，近來新興的證據(jù)都在強(qiáng)調(diào)免疫及炎癥微環(huán)境在甲狀腺癌中的重要性［8-9］。然而，還沒有一項(xiàng)研究致力于通過缺氧相關(guān)基因來對(duì)甲狀腺癌患者進(jìn)行預(yù)后分析。

目前，對(duì)甲狀腺癌缺氧微環(huán)境的研究大多集中在單個(gè)基因上［10-12］。本研究中鑒定的11個(gè)缺氧相關(guān)基因中，部分基因已被證實(shí)與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)。研究［13］顯示，CrT（SLC6A8）基因的敲除導(dǎo)致肌酸攝取不足，同時(shí)損害抗腫瘤T細(xì)胞的免疫功能。補(bǔ)充肌酸可顯著抑制腫瘤生長，并與PD-1/PD-L1阻滯劑協(xié)同抑制腫瘤生長［14］。載脂蛋白E作為高脂血癥的主要病因，被證明在高脂血癥模型中，可通過運(yùn)動(dòng)改善腫瘤的缺氧微環(huán)境，同時(shí)減緩原發(fā)性和繼發(fā)性EO771乳腺腫瘤的形成［15］。

此外，PTGIS和DPP4在生物信息學(xué)研究中也得到了證實(shí)。在先前與肝細(xì)胞肝癌相關(guān)的新生物標(biāo)志物研究中，PTGIS是通過mRNA表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析確定的21個(gè)核心基因之一，可能是抑制肝細(xì)胞肝癌的潛在治療靶點(diǎn)［16］，而DPP4也被證明是NF-κB 15的靶基因［17］。

STC1、PIM1和NDRG1這3種基因在癌癥中的研究更加成熟。由于STC1可能通過Bcl-2的失調(diào)在缺氧性胃癌中發(fā)揮致癌作用，因此被視為可能的胃癌潛在治療靶點(diǎn)［18］。在缺氧微環(huán)境下，miR-124和miR-144的下調(diào)可通過減弱PIM1的抑制作用使細(xì)胞發(fā)生缺氧，而增加患前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)［19］。NDRG1作為調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵基因可促進(jìn)乳腺癌的侵襲性。因NDRG1與乳腺癌預(yù)后不良之間的關(guān)系密切，故NDRG1成為了乳腺癌中一種有前途的治療靶點(diǎn)［20］。

總之，本研究基于對(duì)差異表達(dá)的缺氧相關(guān)基因表達(dá)譜和相應(yīng)臨床特征的綜合分析，確定了多種甲狀腺癌的預(yù)后標(biāo)志物。并通過構(gòu)建一個(gè)新的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型，以有效地評(píng)估甲狀腺癌患者的預(yù)后。本研究的局限性在于其為回顧性研究，今后應(yīng)該進(jìn)行更多的前瞻性研究，以驗(yàn)證缺氧相關(guān)基因的預(yù)后功能。當(dāng)然，這也需要多中心數(shù)據(jù)來證實(shí)本研究的發(fā)現(xiàn)。