李曉娜，何苗，梁洪玥，史瑞雪，付鈺，顧宇婧，李艾凝，郭鳳

（中國醫(yī)科大學(xué) 1.附屬第四醫(yī)院藥學(xué)部，沈陽 110032；2.藥學(xué)院藥物毒理學(xué)教研室，沈陽 110122）

癲癇是由大腦神經(jīng)元異常放電引發(fā)的慢性腦部疾病，是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一。癲癇本質(zhì)上是“離子通道病”，即電壓門控和配體門控離子通道功能突變引發(fā)癲癇［1］。鈉、鉀、鈣等經(jīng)典離子通道在癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用早已被證實(shí)，隨著越來越多離子通道的結(jié)構(gòu)和功能被解析，研究者對新型離子通道研究也越來越深入，這為癲癇機(jī)制與治療的研究提供了新思路。

瞬時(shí)受體電壓（transient receptor potential，TRP）通道是位于細(xì)胞膜上的一組非選擇性陽離子通道。TRP通道的Melastatin亞家族，特別是瞬時(shí)受體電位通道7（transient receptor potential melastatin 7，TRPM7），在神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)。已有大量文獻(xiàn)表明，神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默?。?］、帕金森?。?］和肌萎縮側(cè)索硬化癥［4］等的發(fā)生和發(fā)展都與TRPM7介導(dǎo)的病理過程有關(guān)。然而，目前對TRPM7在癲癇中的變化尚未闡明，在匹魯卡品（pilocarpine，PILO）誘導(dǎo)的癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠模型中發(fā)現(xiàn)TRPM7蛋白表達(dá)增加，抑制TRPM7可以減少神經(jīng)細(xì)胞死亡［5］。

細(xì)胞凋亡是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3（caspase-3）介導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡［6］，其是神經(jīng)疾病中神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要發(fā)病機(jī)制［7］。研究［8-9］發(fā)現(xiàn)TRPM7參與調(diào)控凋亡以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生與發(fā)展。截至目前為止，TRPM7 是否參與PILO誘導(dǎo)的癲癇體外模型凋亡尚無報(bào)道。因此，本研究旨在闡明TRPM7在PILO誘導(dǎo)的癲癇模型凋亡中的作用，為癲癇發(fā)病機(jī)制靶點(diǎn)的探尋提供新角度與新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：小鼠腦神經(jīng)瘤細(xì)胞（Neuro-2A細(xì)胞），由中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所提供。

1.1.2 試劑：PILO購自美國APE*BIO公司；CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒和TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自中國碧云天生物技術(shù)研究所；GAPDH上下游引物和TRPM7上下游引物購自上海生工生物工程股份有限公司；TRPM7 siRNA和GPtransfect-Mate轉(zhuǎn)染試劑購自蘇州吉瑪基因股份有限公司；擴(kuò)增、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；兔抗caspase-3、兔抗Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、兔抗細(xì)胞色素C蛋白（cytochrome C，Cyt C）、兔抗β肌動(dòng)蛋白（β-actin）和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購自美國 Abcam 公司。

1.1.3 儀器：電泳儀購自美國Bio-Rad公司；凝膠成像分析儀購自以色列DNR生物影像系統(tǒng)有限公司；酶標(biāo)儀購自美國BIOTEK公司；熒光定量基因擴(kuò)增儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司；CO2培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司；倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：

1.2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 接種Neuro-2A細(xì)胞于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，5%CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%以上時(shí)進(jìn)行消化傳代。

1.2.1.2 siRNA轉(zhuǎn)染 以1×105/孔 的細(xì)胞密度將Neuro-2A細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)按照GP-transfect-Mate說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。設(shè)置對照組、PILO模型組和PILO+siRNA組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中對照組和PILO模型組轉(zhuǎn)染無序序列，PILO+siRNA組轉(zhuǎn)染TRPM7 siRNA。轉(zhuǎn)染48 h后，應(yīng)用終濃度為20 mmol·L-1的PILO處理PILO模型組和PILO+siRNA組，對照組加入等量培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。siRNA無序序列（NC-siRNA）：上游 5’-UUCUUCGAACGUGUCA CGUTT-3’，下 游 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAT T-3’；TRPM7 siRNA序列：上游5’-GGAGUAAGCAU GCAUAAAUTT-3’，下游5’-AUUUAUGCAUGCUUAC UCCTT-3’。

1.2.2 CCK-8法檢測細(xì)胞毒性：取處于對數(shù)生長期Neuro-2A細(xì)胞，消化后調(diào)整細(xì)胞濃度為 4×104/mL，接種100 μL 細(xì)胞懸液到 96 孔板于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用不同濃度的PILO（0、2、4、16、64和128 mmol·L-1）處理24 h。細(xì)胞毒性活力（%）=［吸光度（加藥）-吸光度（空白）］/ ［吸光度（對照）-吸光度（空白）］ ×100。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平：將Neuro-2A細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)進(jìn)行給藥處理。藥物處理結(jié)束后，RIPA試劑提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。以30 μg/孔進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳條件為70 V恒壓30 min，110 V恒壓120 min；用濕轉(zhuǎn)法將分離的目標(biāo)蛋白完全轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，轉(zhuǎn)膜條件為300 mA恒流120 min；并于5%脫脂奶粉封閉1.5 h。分別加入caspase-3（1 ∶1 000）、Bax（1 ∶10 000）、Cyt C（1 ∶5 000）和 β-actin（1 ∶10 000）一抗，4 ℃孵育過夜。加相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，4 ℃孵育1.5 h。加化學(xué)發(fā)光試劑，避光顯影，曝光拍照。以β-actin作為內(nèi)參，采用 Image J 圖像分析軟件分析各條帶灰度值。

1.2.4 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測基因表達(dá)：將Neuro-2A細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)進(jìn)行給藥處理。藥物處理結(jié)束后，應(yīng)用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，并應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測RNA純度，以光密度（optical density，OD）260/OD280值在1.8～2.2為合格。按照PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ說明書以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件及參數(shù)為95℃預(yù)變性60 s；95 ℃變性15 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，應(yīng)用 2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。相關(guān)序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of different primers

1.2.5 TUNEL染色：將Neuro-2A細(xì)胞接種于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)按1.2.1.2進(jìn)行處理。給藥結(jié)束后，嚴(yán)格按照TUNEL染色明書進(jìn)行染色，DAPI復(fù)染細(xì)胞核。在熒光顯微鏡下觀察成像，TUNEL陽性細(xì)胞為綠色，隨機(jī)選取4個(gè)視野觀察凋亡情況。采用 Image J 圖像分析軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 6 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以表示，2組比較采用t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PILO能夠抑制Neuro-2A細(xì)胞存活率

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的PILO作用于Neuro-2A細(xì)胞24 h后，隨著藥物濃度升高，細(xì)胞存活率下降，并通過計(jì)算得到PILO的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為18.27 mmol·L-1，見圖1。應(yīng)用20 mmol·L-1的PILO進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同濃度PILO對Neuro-2A細(xì)胞活力的影響Fig.1 Cell viability in different concentrations of PILO-treated Neuro-2A cells

2.2 PILO誘導(dǎo)Neuro-2A細(xì)胞出現(xiàn)凋亡

應(yīng)用20 mmol·L-1PILO處理Neuro-2A細(xì)胞24 h后，與對照組相比，凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、Bax和Cyt C表達(dá)水平明顯升高（P＜ 0.05），見圖2。提示應(yīng)用20 mmol·L-1PILO處理Neuro-2A細(xì)胞24 h后，凋亡發(fā)生。因此，應(yīng)用20 mmol·L-1PILO處理Neuro-2A細(xì)胞24 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 PILO處理Neuro-2A細(xì)胞不同時(shí)間后凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.2 The expression of apoptotic-related proteins in Neuro-2A cells induced by PILO at different times through Western blotting

2.3 PILO誘導(dǎo)Neuro-2A細(xì)胞中TRPM7高表達(dá)

應(yīng)用PILO處理24 h后，與對照組（7.285%±1.587%）相比，PILO模型組TRPM7mRNA表達(dá)（16.700%±1.587%）顯著增加（P＜ 0.000 1），見圖3。提示PILO處理Neuro-2A細(xì)胞24 h后，TRPM7表達(dá)增加。

圖3 PILO處理Neuro-2A細(xì)胞中TRPM7 mRNA表達(dá)Fig.3 The mRNA expression of TRPM7 in the PILO-treated group

2.4 干擾TRPM7表達(dá)抑制PILO誘導(dǎo)的細(xì)胞模型出現(xiàn)凋亡

應(yīng)用PILO處理Neuro-2A細(xì)胞24 h后，與PILO模型組相比，PILO+siRNA組凋亡相關(guān)蛋白caspase-3，Bax和Cyt C表達(dá)顯著下降（均P＜ 0.05），見圖4，表明敲除TRPM7基因后，凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)下調(diào)。

圖4 干擾TRPM7對PILO誘導(dǎo)的細(xì)胞模型凋亡相關(guān)蛋白的影響Fig.4 Effect of interference with TRPM7 on apoptotic-related proteins in the PILO-treated cell model

2.5 干擾TRPM7表達(dá)對PILO誘導(dǎo)的細(xì)胞模型凋亡形態(tài)學(xué)的影響

應(yīng)用TUNEL染色后，與對照組相比，PILO誘導(dǎo)Neuro-2A細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜ 0.01）；與PILO模型組相比，PILO+siRNA組細(xì)胞凋亡率顯著減少（P＜0.05），見圖5。

圖5 干擾TRPM7對PILO誘導(dǎo)的細(xì)胞模型凋亡形態(tài)學(xué)的影響Fig.5 Effect of interference with TRPM7 on the apoptotic morphology of the cell model induced by PILO by TUNEL staining

3 討論

癲癇是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其具體發(fā)生機(jī)制仍未可知。研究［1］表明，離子通道參與癲癇的發(fā)生并發(fā)揮重要作用。TRPM7是非選擇性陽離子通道，介導(dǎo)多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生與發(fā)展。目前，許多離子通道都被證明參與了癲癇的發(fā)生，而TRPM7在癲癇中的作用研究較少。TRPM7抑制劑降低了癲癇發(fā)作誘導(dǎo)的TRPM7過度表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)鋅積累和活性氧生成；氧化應(yīng)激、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化和血腦屏障破壞也受到抑制。此外，TRPM7抑制劑可顯著降低癲癇發(fā)作后的凋亡神經(jīng)元死亡［5］。然而，TRPM7在癲癇體外模型中對細(xì)胞死亡的作用尚未報(bào)道。

凋亡是一種經(jīng)典的細(xì)胞死亡方式，是帕金森病、阿爾茨海默病和亨廷頓病等慢性神經(jīng)退行性疾病中神經(jīng)細(xì)胞死亡的主要原因［7］。研究［10］發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用特異性siRNA敲除TRPM7或采用TRPM7非特異性抑制劑2-氨基乙基聯(lián)苯基硼酸酯和釓（Gd3+）作用于高糖處理的NS20Y神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞后，凋亡受到抑制；而過表達(dá)TRPM7基因后，凋亡增加；這表明TRPM7參與凋亡發(fā)生。在帕金森病模型中應(yīng)用TRPM7特異性microRNA（miR-22）抑制TRPM7表達(dá)會(huì)減少細(xì)胞凋亡［3］。到目前為止，癲癇體外模型中TRPM7與凋亡的關(guān)系仍不清楚。

本研究首次表明TRPM7參與介導(dǎo)PILO體外模型的凋亡。采用蛋白質(zhì)印跡法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)PILO誘導(dǎo)的體外癲癇模型導(dǎo)致凋亡相關(guān)蛋白（caspase-3、Bax和Cyt C）和TRPM7基因表達(dá)上調(diào)，而沉默TRPM7引起凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)下降，表明TRPM7參與介導(dǎo)PILO體外模型的凋亡。本研究為癲癇機(jī)制的闡明與治療提供了新靶點(diǎn)，但在癲癇狀態(tài)下，TRPM7調(diào)控凋亡的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。