樊垚 王強(qiáng) 唐吉宏 婁青林 唐偉 顧劉寶
T2DM是一種復(fù)雜的多基因多因素疾病。近年來,越來越多的研究者在分子水平探討T2DM的發(fā)病機(jī)制并關(guān)注其早期診斷及預(yù)防。大量全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association studies,GWASs)發(fā)現(xiàn),有240余個(gè)易感基因與T2DM或其并發(fā)癥有關(guān)[1],然而這些易感基因只能解釋其中很小一部分原因[2-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn),在復(fù)雜疾病中,除基因組序列變異外,表觀遺傳調(diào)控也起到重要作用,因此有必要對糖尿病相關(guān)的表觀遺傳學(xué)等分子機(jī)制進(jìn)行深入研究[4]。
研究表明,糖尿病是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,糖尿病病人心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)較非糖尿病者增加2~4倍。DNA甲基化是一種重要的遺傳外修飾,是表觀遺傳學(xué)的重要組成部分,是調(diào)節(jié)基因組功能的重要手段。850K芯片可以檢測人全基因組約853 307個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。本研究使用850K Infinium Methylation Beadchip技術(shù)檢測老年T2DM病人外周血全基因組DNA甲基化修飾水平,旨在探討DNA甲基化修飾與老年T2DM病人心血管病死亡風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性,并尋找可能的干預(yù)靶點(diǎn),為早期防治糖尿病心血管并發(fā)癥提供依據(jù)。
1.1 研究對象 研究對象均來自南京醫(yī)科大學(xué)附屬老年醫(yī)院糖尿病分階段達(dá)標(biāo)管理(China Staged Diabetes Targeting Management,SDTM)項(xiàng)目注冊的T2DM病人。該項(xiàng)目為開放式隊(duì)列隨訪研究,自2010年開始招募入組對象,入組條件為簽署知情同意書且在本院就診的T2DM病人,病人均符合中國T2DM防治指南(2010年版)診斷標(biāo)準(zhǔn)。糖尿病??谱o(hù)士先對所有入組對象進(jìn)行電話訪談,以確認(rèn)每位病人的現(xiàn)狀,再通過當(dāng)?shù)丶膊】刂浦行南到y(tǒng)的居民數(shù)據(jù)庫對所有死亡數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究選取截至2017年12月底結(jié)局事件為心血管病死亡的病人12例為死亡組,年齡78~89歲,男10例,女2例。根據(jù)巢式病例對照設(shè)計(jì),按照性別、年齡進(jìn)行1:1匹配,采用傾向性評分法,卡鉗值設(shè)置為0.02,最終從數(shù)據(jù)庫中選取截至2017年12月底仍存活的12例病人為非死亡組,年齡78~90歲,男8例,女4例。本研究已通過南京醫(yī)科大學(xué)附屬老年醫(yī)院倫理委員會審核。
1.2 研究方法
1.2.1 生化指標(biāo)檢測:入組時(shí)采集病人清晨空腹靜脈血4 mL,以分離膠促凝劑保存,4000 r/min離心10 min,取上層血清,采用全自動(dòng)生化分析儀(雅培c1600)檢測TC、TG、HDL-C、LDL-C、UA、AST、ALT等生化指標(biāo)。
1.2.2 DNA提?。喝虢M時(shí)采集病人清晨空腹靜脈血2 mL以EDTA抗凝,放置于-80 ℃冰箱凍存。使用德國Qiagen公司血液組織DNA提取試劑盒提取外周血DNA。
1.2.3 DNA甲基化水平檢測:入組時(shí)使用Illumina公司850K Infinium Methylation Beadchip技術(shù),委托上海晶能生物技術(shù)有限公司檢測基因組DNA甲基化程度。850K芯片針對每個(gè)CpG位點(diǎn)設(shè)計(jì)2種探針,即signal A和signal B雙色熒光信號用于檢測非甲基化和甲基化的等位基因。使用R軟件minfi包對原始芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理,CpG位點(diǎn)的甲基化程度通過β值衡量,計(jì)算公式為:β=signal B/(signal A+signal B+100)。有效探針β值的區(qū)間為[0,1],0表示該CpG位點(diǎn)無甲基化,1表示該CpG位點(diǎn)完全甲基化。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
1.3.2 基因組甲基化差異分析:使用Beta MIxture Quantile dilation(BMIQ)法對β值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,利用R語言的limma包建立線性模型并計(jì)算每個(gè)CpG位點(diǎn)的P值。采用Benjamini & Hochberg法進(jìn)行多重檢驗(yàn)校正,根據(jù)校正后的P值進(jìn)行差異甲基化位點(diǎn)的篩選。差異甲基化位點(diǎn)的判斷標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05,︱βdifferencecase-control︱>0.1。采用R語言的pheatmap包繪制差異甲基化位點(diǎn)基因的熱圖。
1.3.3 生物信息學(xué)分析:將篩選出的差異甲基化位點(diǎn)通過DAVID基因功能分析平臺(https://david.ncifcrf.gov)完成基因本體(gene ontology,GO)功能分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號通路分析。采用Benjamini & Hochberg法進(jìn)行多重檢驗(yàn)校正,以P<0.05為差異甲基化位點(diǎn)基因在該條GO條目和KEGG通路上顯著富集。
2.1 2組基線一般資料和實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)比較 非死亡組HDL-C水平高于死亡組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其他人口學(xué)特征、實(shí)驗(yàn)室檢測指標(biāo)、疾病史和用藥史差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。
2.2 DNA甲基化檢測結(jié)果
2.2.1 Illumina Human Methylation 850 BeadChip芯片的評價(jià):芯片在雜交、洗滌、掃描步驟質(zhì)控良好,使用BMIQ法對β值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,β值均位于[0,1]區(qū)間,表示探針有效,所有數(shù)據(jù)均可用于后續(xù)分析。
2.2.2 差異甲基化位點(diǎn)分析:根據(jù)評判標(biāo)準(zhǔn)篩選出差異甲基化位點(diǎn)共303個(gè)。根據(jù)2組樣本在303個(gè)差異甲基化位點(diǎn)上的甲基化狀態(tài)繪制差異甲基化位點(diǎn)基因熱圖,見圖1。
注:Group A為非死亡組,Group B為死亡組;紅色為高甲基化,藍(lán)色為低甲基化圖1 差異甲基化位點(diǎn)基因熱圖
2.3 生物信息學(xué)分析結(jié)果
2.3.1 GO功能分析:GO功能可分為生物過程(biological process,BP)、細(xì)胞成分(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)3個(gè)部分。計(jì)算每個(gè)GO條目中差異甲基化位點(diǎn)基因富集程度的P值,結(jié)果提示差異甲基化位點(diǎn)基因生物學(xué)功能富集于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、細(xì)胞黏附分子、血糖穩(wěn)態(tài)和樹突發(fā)育正調(diào)控等生物過程;質(zhì)膜的組成成分、樹突和細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)細(xì)胞成分;鈣離子結(jié)合和序列特異性DNA結(jié)合分子功能。見圖2。
圖2 DNA差異甲基化位點(diǎn)基因參與的主要生物過程
2.3.2 通路分析(Pathway 富集分析):計(jì)算每個(gè)KEGG通路條目中差異甲基化位點(diǎn)基因富集程度的P值。結(jié)果顯示,差異甲基化位點(diǎn)基因顯著富集在細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)信號通路和炎癥介質(zhì)對瞬時(shí)受體電位離子(transient receptor potential, TRP)通道的調(diào)節(jié)通路。見圖3。
圖3 DNA差異甲基化位點(diǎn)基因參與的主要信號通路
有研究表明,約30%的T2DM病人有心血管并發(fā)癥,而70%的T2DM病人死因?yàn)樾难芗膊8]。本研究通過對老年T2DM心血管病死亡病人和非死亡病人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的全基因組甲基化芯片檢測,篩選出差異甲基化位點(diǎn)基因,初步為老年T2DM心血管病死亡風(fēng)險(xiǎn)的甲基化譜的建立奠定基礎(chǔ)。
TRP通道在多種心血管疾病的病理生理學(xué)中發(fā)揮重要作用[9]。TRPV1是哺乳動(dòng)物TRP離子通道7個(gè)亞家族之一。已有研究表明,TRPV1的缺失可能影響中性粒細(xì)胞的遷移,促使炎癥因子、趨化因子過度生成,造成心梗后炎癥過度活動(dòng)、不對稱心室重塑、心功能惡化[10]。TRPV1基因多態(tài)性與T2DM遺傳易感性及術(shù)中不良心血管事件的發(fā)生相關(guān)[11]。cAMP是胰高血糖素肽-1受體(glucogan like peptide-1 receptor,GLP-1R)的主要第二信使,其可活化一系列下游分子信號,從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激和抗凋亡等生物學(xué)作用[12]。目前大多數(shù)研究認(rèn)為,胰高血糖素肽-1(glucogan like peptide-1,GLP-1)的心血管保護(hù)作用獨(dú)立于血糖和血清胰島素水平等因素之外[13],發(fā)揮生物學(xué)作用的方式是與心臟和血管內(nèi)皮的GLP-1R相結(jié)合[14]。Flamez等[15]發(fā)現(xiàn),GLP-1與胰島B細(xì)胞膜上受體相結(jié)合,引起細(xì)胞內(nèi)cAMP水平上升,導(dǎo)致細(xì)胞膜電生理變化從而刺激胰島素分泌。Dozier等[16]研究發(fā)現(xiàn),GLP-1可通過cAMP/PKA通路抑制炎性反應(yīng),從而改善脂多糖誘發(fā)的內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。Liu等[17]對自發(fā)性高血壓大鼠予以2周西他列汀治療,發(fā)現(xiàn)大鼠的腎動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性舒張功能有所改善,腎功能血流恢復(fù),血壓降低,其機(jī)制可能是通過提高cAMP水平,從而進(jìn)一步激活蛋白激酶K(protein kinase A, PKA)、AMP依賴的蛋白激酶[Adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase, AMPK]、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)等分子而發(fā)揮作用。以上研究均表明,cAMP/PKA是GLP-1發(fā)揮多器官保護(hù)作用的一個(gè)非常重要的分子通路。
細(xì)胞黏附分子在細(xì)胞炎癥反應(yīng)、血栓形成等過程中發(fā)揮重要作用。本研究GO功能分析結(jié)果顯示,差異甲基化位點(diǎn)基因參與細(xì)胞黏附分子的生物學(xué)過程。季慧慧等[18]對T2DM病人和正常對照人群的DNA差異甲基化基因進(jìn)行GO功能分析,發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因參與細(xì)胞黏附分子生物過程。成淑英等[19]發(fā)現(xiàn)合并不同程度頸動(dòng)脈或下肢動(dòng)脈硬化的T2DM病人血清血管細(xì)胞黏附分子1水平顯著高于健康對照組。上述研究結(jié)果提示,DNA甲基化參與細(xì)胞黏附分子生物過程從而影響T2DM病人的心血管疾病進(jìn)展。
鈣離子結(jié)合在動(dòng)脈鈣化和動(dòng)脈粥樣硬化過程中起著至關(guān)重要的作用[20]。Liang等[21]的研究表明,鈣離子結(jié)合在糖尿病病人心血管疾病發(fā)展過程中被激活。結(jié)合本研究結(jié)果可以得出,DNA甲基化參與鈣離子結(jié)合分子功能從而影響T2DM病人的心血管疾病進(jìn)展。
綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化修飾圖譜在老年T2DM病人心血管病死亡組與非死亡組中存在顯著差異,差異甲基化位點(diǎn)基因顯著富集在cAMP信號通路和炎癥介質(zhì)對TRP通道的調(diào)節(jié)過程中,提示DNA甲基化作為基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制,可能通過參與以上生物學(xué)過程對T2DM病人心血管病死亡發(fā)揮一定作用。本研究采用850K Infinium Methylation Beadchip技術(shù),有較高的穩(wěn)定性,研究結(jié)果有一定參考價(jià)值。但由于本研究樣本量較小,同時(shí)缺少功能研究驗(yàn)證。因此,仍需更多研究來驗(yàn)證本結(jié)果的可靠性。