趙新一， 董 坤， 宋賀明， 官小玉， 王任其， 陳詠梅*

(1.陜西科技大學 輕工科學與工程學院, 陜西 西安 710021; 2.西安交通大學 化學學院, 陜西 西安 710049)

0 引言

高分子水凝膠生物材料在應用過程中不可避免地會與人體體液或組織接觸而發(fā)生蛋白質(zhì)吸附，因此研究高分子水凝膠材料表面蛋白質(zhì)吸附行為對于評價其生物相容性、細胞親和性等性能尤為重要.

生物化學法和現(xiàn)代儀器分析法是目前研究蛋白質(zhì)吸附的主要方法，如光波導模式光譜[1-3]、橢圓偏振儀[1-3]、全內(nèi)反射熒光光譜法[4,5]等，具有較高的靈敏性和準確度，可實時動態(tài)檢測，但得到的信息比較單一，只能反映蛋白質(zhì)吸附的某一個特性.頻率-耗散聯(lián)用石英晶體微天平(QCM-D)技術能獲得蛋白質(zhì)吸附的多種信息，可動態(tài)檢測蛋白質(zhì)在生物材料表面的吸附質(zhì)量和厚度[1-3]，并反映蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化[6]以及蛋白質(zhì)在生物材料表面吸附后的黏彈性變化[7]等信息.它利用石英晶體的壓電效應而建立起石英共振頻率與吸附質(zhì)量的關系.其應用基礎是德國科學家Guenter Sauerbrey提出的Sauerbrey公式[8-10]，該公式利用簡單的線性關系表述了石英晶體表面吸附質(zhì)量和頻率變化之間的關系.

(1)

式(1)中：Δm為石英微晶天平工作電極表面的沉積物質(zhì)量變化，可代表蛋白質(zhì)吸附量的變化.ΔFn是晶體振動頻率的變化，可根據(jù)其變化直觀反映蛋白質(zhì)吸附的過程.

(2)

式(2)中：耗散因子(D)是指當驅(qū)動石英晶體振蕩的電路斷開后，晶體頻率降低到0的時間快慢.間接反映蛋白質(zhì)的吸附量，即吸附量越多，D值越大.Glost是指晶體在一次振蕩周期中能量損耗，Gstore是指晶體在一次振蕩周期中存儲的全部能量.

在高分子薄膜/液相吸附界面研究體系中，高分子薄膜以及被吸附物質(zhì)的質(zhì)量、黏彈性、結(jié)構(gòu)、含水量等因素都包含在QCM-D數(shù)據(jù)處理提供的頻率變化和耗散因子兩個參數(shù)中.將水凝膠材料成功修飾于石英晶片表面是使用QCM-D技術監(jiān)測水凝膠吸附蛋白質(zhì)的前提.目前報道的方法有兩種：一是物理吸附方法[11-14]，將旋轉(zhuǎn)涂覆于石英晶片表面的親水性高分子薄膜烘干后近似看作水凝膠，該方法中石英晶片能夠反復利用，節(jié)約實驗成本，但構(gòu)成該薄膜的高分子鏈沒有被交聯(lián)形成三維水凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，從而會缺失水凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)對蛋白質(zhì)吸附性能的影響；二是化學接枝方法[15-20]，即通過共價鍵反應在石英晶片表面修飾活性雙鍵，然后將親水性單體表面原位引發(fā)接枝于石英晶片表面形成水凝膠網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，該方法雖然保持了水凝膠三維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)，但石英晶片不能反復利用，增加了實驗成本.故而，嘗試通過微凝膠吸附方法在石英晶片表面制備一層水凝膠薄膜進而監(jiān)測微凝膠材料表面蛋白質(zhì)吸附過程.

1 實驗部分

1.1 實驗原料

N,N′-二甲基丙烯酰胺，分析純，TOKYO KASEI公司；2-丙烯酰胺基-2-甲基丙磺酸鈉，分析純，山東省煜化學有限公司；甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨，分析純，Alfa Aesar公司；N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺，國藥集團化學試劑有限公司；α-酮戊二酸，分析純，上?？曝S化學試劑有限公司；牛血清白蛋白(BSA)，北京奧博星生物技術有限公司.

1.2 實驗儀器

電子天平，BS224S，德國Sartourius公司；紫外燈，365 nm/40 W，Philips公司；攪拌機，MJ-250BP02A，廣東美的生活電器制造有限公司；納米激光粒度儀，Nano ZS 90，MALVERN公司；頻率-耗散聯(lián)用石英微晶天平，Q-SenseE4，瑞典Q-Sense公司；鍍金石英晶片，AT切，5MHz，瑞典Q-Sense公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 高分子水凝膠的制備

三種乙烯類單體通過光引發(fā)反應合成高分子水凝膠材料，其中2-丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸鈉(NaAMPS)作為陰離子單體，N,N′-二甲基丙烯酰胺(DMAAm)作為中性單體，甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨(METAC)作為陽離子單體.具體操作步驟如下：將單體配制成1 mol/L的水溶液，以單體濃度為參比加入交聯(lián)劑N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺(MBAA).待單體和交聯(lián)劑完全溶解后再以單體濃度為參比加入0.1 mol%引發(fā)劑α-酮戊二酸，并通入氮氣30 min.將該溶液加入潔凈玻璃夾具間，用波長為365 nm紫外光照射12 h.最后將制備的水凝膠材料取出,浸泡在去離子水中溶脹，每天換水2次持續(xù)一周，保證水凝膠中未反應的成分被充分置換并達到溶脹平衡.最后浸泡在磷酸緩沖液(PBS)中交換溶脹，每天更換PBS溶液兩次，持續(xù)三天使其與人體組織保持等滲狀態(tài).

1.3.2 微凝膠的制備

將PBS溶液中溶脹平衡的高分子水凝膠材料放于PBS溶液中，攪拌5 min后獲得微凝膠溶液.靜置24 h待沉析完成后取上層清液，獲得穩(wěn)定的微凝膠溶液.利用納米激光粒度儀分析微凝膠粒徑大小及分布情況.

1.3.3 石英晶片及微凝膠表面蛋白質(zhì)吸附過程

利用QCM-D技術監(jiān)測石英晶片表面蛋白質(zhì)吸附過程.在37 ℃(體溫)、150 uL /min進樣速率下，通入PBS溶液，待石英晶片振動頻率穩(wěn)定后，將該頻率記錄為測試零點.通入PBS溶液3 min后更換通入BSA溶液，待石英晶片振動頻率穩(wěn)定后，依次從低濃度到高濃度更換BSA溶液，記錄石英晶片振動頻率變化(ΔFn)及耗散因子變化(ΔDn)隨時間的變化，n取值為1、3、5、7、9和11.選取ΔF3及ΔD3作為歸一化值，用以數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析.

利用QCM-D技術監(jiān)測三種微凝膠材料表面蛋白質(zhì)吸附過程.在37 ℃(體溫)、150 uL/min進樣速率下，通入PBS溶液，待石英晶片振動頻率穩(wěn)定后，將該頻率記錄為測試零點.通入PBS溶液3 min后更換通入微凝膠溶液，待石英晶片振動頻率穩(wěn)定后，依次從低濃度到高濃度更換通入BSA溶液，記錄石英晶片振動頻率變化(ΔFn)及耗散因子變化(ΔDn)穩(wěn)定隨時間的變化，n取值為1、3、5、7、9和11.選取ΔF3及ΔD3作為歸一化值用以數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 三種高分子微凝膠的粒徑分布

圖1、2、3分別為不同交聯(lián)密度的PMETAC、PNaAMPS及PDMAAm三種高分子微凝膠粒徑分布圖，其橫坐標為粒徑大小，縱坐標為微凝膠溶液中某一粒徑微凝膠數(shù)所占整個微凝膠總數(shù)量的比例.從圖中可以看出，三種微凝膠不同交聯(lián)密度粒徑分布相對較為均勻，PMETAC微凝膠粒徑分布在600～700 nm，PDMAAm微凝膠粒徑分布在800～1 000 nm，PNaAMPS微凝膠粒徑分布在400～700 nm.由于三種微凝膠材料粒徑分布均勻，因此在后期物理吸附研究中不考慮其粒徑對吸附性能的影響.

圖2 不同交聯(lián)密度PNaAMPS微凝膠粒徑分布

2.2 石英晶片表面蛋白質(zhì)吸附過程

利用QCM-D技術監(jiān)測三種微凝膠材料表面蛋白質(zhì)吸附過程，必須確定潔凈石英晶片表面蛋白質(zhì)吸附情況，并在計算微凝膠表面BSA吸附量時扣除潔凈晶片表面吸附量.圖4為石英晶片表面吸附BSA過程中，石英晶片振動頻率ΔF3和相應耗散因子ΔD3隨時間變化曲線.由圖可以看出，隨著BSA吸附時間的增加，ΔF3略微降低，ΔD3略微增大，最后達到平衡，且隨著BSA濃度的提高，ΔF3及ΔD3的變化均增大.說明石英晶片表面有微量的蛋白吸附.

圖4 潔凈晶片表面蛋白質(zhì)吸附過程頻率及耗散因子隨時間變化曲線

2.3 微凝膠表面蛋白質(zhì)吸附過程

2.3.1 PMETAC微凝膠表面蛋白質(zhì)吸附過程

以相同實驗方法獲得不同交聯(lián)密度的正電荷PMETAC微凝膠，其表面BSA吸附過程中，石英晶片振動頻率ΔF3和相應耗散因子ΔD3隨時間變化曲線如圖5～7所示.從圖中可以看出，通入微凝膠溶液后ΔF3隨時間增加不斷降低，ΔD3隨時間增加不斷增大，最終達到吸附平衡，表明微凝膠顆粒能夠在振子表面發(fā)生物理吸附.當微凝膠吸附達到平衡后，再用PBS沖洗時，ΔF3和ΔD3的變化均非常微小，由此推斷，微凝膠在石英晶片表面的吸附非常穩(wěn)定.當通入2 mg/mL BSA溶液后，ΔF3隨時間增加顯著降低，ΔD3隨時間增加而增大，最終達到吸附平衡.此外，不同BSA濃度環(huán)境下，雖然ΔF3隨時間增加不斷降低，ΔD3隨時間增加不斷增大，但在BSA濃度從4 mg/mL升高至10 mg/mL過程中，每次BSA濃度的提高所引起的ΔF3和ΔD3的變化趨勢相對2 mg/mL時變化非常緩和.不同交聯(lián)密度的PMETAC微凝膠表面BSA吸附量近似.

圖5 2mol%PMETAC在BSA吸附過程中頻率及耗散因子隨時間變化曲線

圖6 4mol%PMETAC在BSA吸附過程中頻率及耗散因子隨時間變化曲線

圖7 10mol%PMETAC在BSA吸附過程中頻率及耗散因子隨時間變化曲線

2.3.2 PDMAAm微凝膠表面蛋白質(zhì)吸附過程

以相同實驗方法獲得不同交聯(lián)密度的中性PDMAAm微凝膠，其表面BSA吸附過程中，石英晶片振動頻率ΔF3和相應耗散因子ΔD3隨時間變化曲線如圖8～10所示.從圖中可以看出，隨著微凝膠溶液和BSA溶液的通入，ΔF3隨時間增加不斷降低，ΔD3隨時間增加不斷增大，并最終達到穩(wěn)定值.表明微凝膠顆粒能夠在振子表面發(fā)生物理吸附.當微凝膠吸附達到平衡后，再用PBS沖洗時，ΔF3和ΔD3的變化均非常微小，由此推斷，微凝膠在石英晶片表面的吸附非常穩(wěn)定.當通入2 mg/mL BSA溶液后，ΔF3隨時間增加顯著降低，ΔD3隨時間增加而增大，最終達到吸附平衡.此外，不同BSA濃度環(huán)境下，雖然ΔF3隨時間增加不斷降低，ΔD3隨時間增加不斷增大，但是隨著BSA濃度從4 mg/mL升高至10 mg/mL過程中，每次BSA濃度的提高所引起的ΔF3和ΔD3的變化趨勢相對2 mg/mL時的變化非常緩和.PDMAAm微凝膠表面BSA吸附過程與PMETAC微凝膠相同，但ΔF變化較小，根據(jù)Sauerbrey公式可得，PDMAAm表面的BSA吸附量小于PMETAC.不同交聯(lián)密度的PDMAAm微凝膠表面BSA吸附量近似.

圖8 2mol%PDMAAm在BSA吸附過程中頻率及耗散因子隨時間變化曲線

2.3.3 PNaAMPS微凝膠表面蛋白質(zhì)吸附過程

以相同實驗方法獲得不同交聯(lián)密度的負電荷PNaAMPS微凝膠，其表面BSA吸附過程中，PNaAMPS微凝膠溶液的通入并未使石英晶片振動頻率ΔF3和耗散因子ΔD3發(fā)生變化.因此推斷，石英晶片表面羥基在水中電離后與PNaAMPS表面帶有的負電荷基團發(fā)生電荷排斥作用，使PNaAMPS微凝膠顆粒未在石英晶片表面發(fā)生吸附.為獲得PNaAMPS微凝膠表面BSA吸附數(shù)據(jù)，我們通過層層自組裝的方法在石英晶片表面形成一層穩(wěn)定的PMETAC微凝膠膜，用PBS進行沖洗，再通入PNaAMPS微凝膠溶液，獲得一層PNaAMPS微凝膠薄膜，進而監(jiān)測其表面BSA吸附情況.

圖11～13為PNaAMPS薄膜表面吸附BSA過程中石英晶片振動頻率ΔF3和耗散因子ΔD3隨時間的變化曲線.當石英晶片表面PMETAC(2 mol%)吸附平衡后，用PBS沖洗過程中ΔF3和ΔD3并不發(fā)生變化，當通入PNaAMPS微凝膠溶液后，ΔF3顯著降低，ΔD3顯著增高.對比PMETAC及PDMAAm微凝膠吸附過程可知，PNaAMPS微凝膠顆粒在PMETAC薄膜表面發(fā)生了吸附作用，即利用異種電荷間相互吸引作用在石英晶片表面通過層層自組裝可以形成一層PNaAMPS微凝膠薄膜，并且該薄膜非常穩(wěn)定(PBS沖洗未發(fā)生頻率及耗散因子變化)，從而保證了QCM-D技術監(jiān)測BSA在PNaAMPS表面吸附情況的可行性.

圖11 2mol%PNaAMPS在BSA吸附過程中頻率及耗散因子隨時間變化曲線

圖12 4mol%PNaAMPS在BSA吸附過程中頻率及耗散因子隨時間變化曲線

圖13 10mol%PNaAMPS在BSA吸附過程中頻率及耗散因子隨時間變化曲線

隨著BSA溶液的通入，ΔF3隨時間增加不斷降低，ΔD3隨時間增加不斷增大.相對于PMETAC和PDMAAm微凝膠表面BSA吸附變化，PNaAMPS微凝膠表面BSA吸附過程中ΔF3及ΔD3變化量非常小，推測可能BSA在PNaAMPS表面吸附量較低.不同交聯(lián)密度的PNaAMPS微凝膠表面BSA吸附量近似.

2.4 微凝膠表面BSA吸附性能分析

|ΔD/ΔF|描述振子表面的表觀吸附層的粘彈性,其值越小則表示該吸附層的剛性越好.圖14為潔凈晶片表面BSA吸附過程中D-F曲線圖.從圖中可以看出，隨著ΔF3的降低，ΔD3不斷增加，且呈簡單線性變化關系，說明在潔凈石英晶片表面BSA有微量吸附.

圖14 潔凈晶片表面耗散因子隨頻率變化趨勢

相同的處理方法，對三種微凝膠表面BSA吸附過程中的|ΔD3/ΔF3|關系進行作圖，從而獲得其吸附性能初步分析.圖15～17所示分別為PMETAC、PDMAAm及PNaAMPS三種微凝膠吸附中耗散因子隨頻率變化曲線.

從圖15和圖16可以看出，當BSA濃度為2 mg/mL時，PMETAC及PDMAAm兩種微凝膠表面BSA吸附過程中ΔD3隨ΔF3呈線性變化趨勢，且其線性變化斜率小于相應微凝膠吸附過程中斜率，該現(xiàn)象表明在2 mg/mL BSA液相環(huán)境下，BSA在PMETAC及PDMAAm兩種微凝膠表面吸附形成一層更致密薄膜.而當BSA濃度再次提高，ΔD3隨ΔF3變化劇烈增高，已經(jīng)不呈現(xiàn)線性關系，即當BSA濃度大于2 mg/mL時，耗散因子的增加遠大于頻率變化，即BSA濃度的提高僅僅增大了系統(tǒng)粘彈性，而吸附質(zhì)量并沒有多大改變，由此推測，PMETAC及PDMAAm兩種微凝膠表面在BSA濃度為2 mg/mL時即發(fā)生飽和吸附.圖17中PNaAMPS微凝膠表面BSA吸附過程中ΔD3隨ΔF3降低明顯增大，說明其材料耗散變化遠大于頻率變化，即BSA在PNaAMPS表面形成一層松散且有粘彈性的的膜層.

圖15 PMETAC微凝膠吸附及其表面BSA吸附過程中耗散因子隨頻率變化趨勢

圖16 PDMAAm微凝膠吸附及其表面BSA吸附過程中耗散因子隨頻率變化趨勢

圖17 PNaAMPS微凝膠吸附及其表面BSA吸附過程中耗散因子隨頻率變化趨勢

3 結(jié)論

發(fā)展了微凝膠吸附方法在石英晶片表面獲得一層水凝膠薄膜，并采用石英微晶天平技術(QCM-D)分析了帶正電荷的PMETAC、中性的PDMAAm及帶負電荷的PNaAMPS表面蛋白質(zhì)吸附行為.得到以下結(jié)論：

(1)通過物理分散獲得的微凝膠溶液能夠在石英晶片表面吸附形成一層致密薄膜，該方法具有切實可行的操作性，為利用QCM-D技術監(jiān)測水凝膠材料表面蛋白質(zhì)吸附性能提供了基礎.

(2)利用QCM-D技術監(jiān)測了三種不同電荷微凝膠材料表面BSA吸附行為.單位質(zhì)量微凝膠表面BSA吸附質(zhì)量順序為PDMAAm>PMETAC >PNaAMPS，交聯(lián)密度并不影響水凝膠材料表面BSA吸附量.

(3)三種微凝膠表面在BSA濃度為2 mg/mL時即達到飽和吸附，BSA濃度的繼續(xù)提高也僅提高了體系粘彈性.