王 城，王玉潔,劉榮枝，薛常魯

(嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 嘉興 314001)

重金屬具有毒性、非生物降解性、持久性和生物累積性，當(dāng)其超過環(huán)境最大處理容量時(shí)，是一種對生態(tài)環(huán)境和人體健康危害極大的污染物[1-2]。浙江省以印染、皮革等行業(yè)為支柱產(chǎn)業(yè)，印染和皮革廢水中重金屬含量嚴(yán)重超標(biāo)，是環(huán)境保護(hù)規(guī)劃和整治的重點(diǎn)對象。

治理重金屬污染的方法有：物理修復(fù)法(包括吸附法、液膜法、電滲析法等)、化學(xué)修復(fù)法(包括化學(xué)沉淀法、氧化還原法、離子交換法等)、生物修復(fù)法等[3]。傳統(tǒng)的物理和化學(xué)修復(fù)法存在著成本大、能耗高、二次污染等不足[3-4]。生物修復(fù)法自20世紀(jì)90年代以來，因?yàn)槠渫顿Y小、運(yùn)行費(fèi)用低、對環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注[5]。微生物修復(fù)相對于其他生物，具有實(shí)施方便、高效、資源豐富等優(yōu)點(diǎn)，成為環(huán)境重金屬污染修復(fù)新技術(shù)探索中的熱點(diǎn)之一[4-5]。陳亞奎等[6]發(fā)現(xiàn)粘質(zhì)沙雷氏菌HB-4對水體中Cd2+具有高吸附性和高耐受性，該菌株能在 Cd2+濃度為 300 mg/L時(shí)正常生長，對 Cd2+的去除率達(dá)到50%以上。李同靈等[7]篩選出一株埃希氏菌P15菌株最高耐Pb濃度達(dá)1200 mg/L。

目前利用微生物進(jìn)行重金屬修復(fù)的主要集中菌種資源的開發(fā)[7,9-10]和對重金屬污染治理?xiàng)l件及機(jī)制[6,8,11-14]的實(shí)驗(yàn)室探索階段。本課題組獲得一株高產(chǎn)靈菌紅素的粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescensjx-1)，在前期研究的基礎(chǔ)上已發(fā)現(xiàn)該菌具有良好的抑菌、抑藻生物活性[16-17]。本研究旨在探討該菌株對Cu2+、Zn2+、Cr6+三種重金屬的耐受性和去除效果，從而為開發(fā)高效節(jié)能的微生物重金屬治理方法提供基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 菌 種

粘質(zhì)沙雷氏菌 (Serratiamarcescensjx-1)，實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 試 劑

銅標(biāo)準(zhǔn)液(1 mg/mL)，鋅標(biāo)準(zhǔn)液(1 mg/mL)，鉻標(biāo)準(zhǔn)液(1 mg/mL)，CuSO4·5H2O(AR)，ZnSO4·7H2O(AR)，K2Cr2O7(AR)。

1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨5.0 g/L，酵母粉3.0 g/L，葡萄糖1.0 g/L，pH 7.2。

液體培養(yǎng)基：蛋白胨13 g/L，甘油20 g/L，MgSO41.2 g/L，NaCl 5.0 g/L，甘氨酸2.0 g/L，pH 7.2。

1.4 儀 器

710-ES電感耦合等離子發(fā)射光譜儀，Varian公司；UV-1801紫外分光光度計(jì)，北分瑞利公司；VS-130超凈臺，蘇州安泰；HD-930恒溫震蕩培養(yǎng)箱，上海隆拓儀器設(shè)備有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 菌種活化

將從-70 ℃保存的菌種轉(zhuǎn)接于LB平板上培養(yǎng)12 h，挑選單菌落接種于液體LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 rpm/min培養(yǎng)12 h獲得種子液，控制種子液密度在OD600為0.8左右。

2.2 S.marcescens jx-1對重金屬Cu2+的耐受性研究

配置5 g/L的CuSO4母液，調(diào)節(jié)液體發(fā)酵培養(yǎng)基中Cu2+的濃度梯度為0、50、100、150、200 mg/L，接種后分別在37 ℃和28 ℃下，200 r/min培養(yǎng)60 h，每隔12 h取樣測OD600，考察S.marcescensjx-1在不產(chǎn)靈菌紅素(37 ℃培養(yǎng))和產(chǎn)靈菌紅素時(shí)(28 ℃培養(yǎng))對不同濃度重金屬Cu2+的耐受性。

(1)

2.3 S.marcescens jx-1對重金屬Zn2+的耐受性研究

配置5 g/L的ZnSO4母液，設(shè)置發(fā)酵液中Zn2+濃度梯度為0、50、100、150、200 mg/L，按照2.2實(shí)驗(yàn)方法考察S.marcescensjx-1對重金屬Zn2+的耐受性。

2.4 S.marcescens jx-1對單一重金屬的耐受性研究

配置5 g/L的K2Cr2O7母液，設(shè)置發(fā)酵液中Zn2+濃度梯度為0、50、100、150、200 mg/L，按照2.2實(shí)驗(yàn)方法考察S.marcescensjx-1對重金屬Cr6+的耐受性。

2.5 S.marcescens jx-1對重金屬的去除作用

根據(jù)2.2、2.3和2.4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置液體培養(yǎng)基中Zn2+、Cu2+、Cr6+的濃度分別為250 mg/L、100 mg/L、100 mg/L，接種后在28 ℃，200 r/min培養(yǎng)60 h，每隔12 h取樣，經(jīng)離心過濾后電感耦合等離子發(fā)射光譜方法測定重金屬的含量，計(jì)算重金屬的去除率，考察S.marcescensjx-1對不同重金屬的去除效果。

去除率 =(C0-Ce)/C0×100%

(2)

式中：C0為空白組的重金屬含量；Ce為實(shí)驗(yàn)組的重金屬含量。

3 結(jié)果與討論

3.1 S.marcescens jx-1對重金屬Cu2+的耐受性

根據(jù)2.2實(shí)驗(yàn)方法，分別考察37 ℃(不產(chǎn)靈菌紅素)和28 ℃(產(chǎn)靈菌紅素)條件下，不同濃度的Cu2+對S.marcescensjx-1生長的影響，結(jié)果如圖1和圖2所示。

圖1 37 ℃時(shí)Cu2+對S.marcescens jx-1生長影響Fig.1 The effect of Cu2+ to S.marcescens jx-1 at 37 ℃

圖2 28 ℃時(shí)Cu2+對S.marcescens jx-1生長影響Fig.2 The effect of Cu2+ to S.marcescens jx-1 at 28 ℃

由圖1可知，在37 ℃振蕩培養(yǎng)時(shí)，S.marcescensjx-1不產(chǎn)生靈菌紅素，菌體產(chǎn)量較低，Cu2+為50 mg/L時(shí)對菌體有明顯抑制，培養(yǎng)24 h時(shí)抑制率為43.3%，Cu2+為150 mg/L時(shí)表現(xiàn)出基本完全抑制，S.marcescensjx-1對Cu2+最高耐受濃度為100～150 mg/L。由圖2可知，在28 ℃振蕩培養(yǎng)時(shí)，S.marcescensjx-1產(chǎn)生靈菌紅素，菌體產(chǎn)量較高，Cu2+為50 mg/L時(shí)基本沒明顯抑制，培養(yǎng)24 h時(shí)抑制率僅為2.6%，Cu2+為100 mg/L時(shí)對菌體有明顯抑制，培養(yǎng)24 h時(shí)抑制率為63.4%，Cu2+為200 mg/L時(shí)表現(xiàn)出完全抑制，S.marcescensjx-1對Cu2+最高耐受濃度為150～200 mg/L。

3.2 S.marcescens jx-1對重金屬Zn2+的耐受性

根據(jù)2.3實(shí)驗(yàn)方法，分別考察37 ℃(不產(chǎn)靈菌紅素)和28 ℃(產(chǎn)靈菌紅素)條件下，不同濃度的Zn2+對S.marcescensjx-1生長的影響，結(jié)果如圖3和圖4所示。

圖3 37 ℃時(shí)Zn2+對S.marcescens jx-1生長影響Fig.3 The effect of Zn2+to S.marcescens jx-1 at 37 ℃

圖4 28 ℃時(shí)Zn2+對S.marcescens jx-1生長影響Fig.4 The effect of Zn2+to S.marcescens jx-1 at 28 ℃

由圖3可知，不產(chǎn)生靈菌紅素，在0～100 mg/L范圍內(nèi)，Zn2+對菌體生長無明顯影響；Zn2+在150 mg/L時(shí)對菌體有明顯抑制，培養(yǎng)24 h時(shí)抑制率為53%，250 mg/L時(shí)接近完全抑制，S.marcescensjx-1對Zn2+最高耐受濃度為200～250 mg/L。由圖4可知，產(chǎn)生靈菌紅素時(shí)，在0～100 mg/L范圍內(nèi)，培養(yǎng)24 h時(shí)Zn2+對菌體生長有一定促進(jìn)作用；Zn2+為100～250 mg/L時(shí)，對菌體有一定抑制，在250 mg/L時(shí)培養(yǎng)24 h，對S.marcescensjx-1抑制率為21.4%；從生長曲線上來看，抑制主要體現(xiàn)在延滯期延長和穩(wěn)定期菌體最高產(chǎn)量降低；在本實(shí)驗(yàn)設(shè)置的梯度范圍內(nèi)，S.marcescensjx-1沒有出現(xiàn)完全抑制的生長狀態(tài)，表現(xiàn)出對Zn2+較高的耐受性。

3.3 S.marcescens jx-1對重金屬Cr6+的耐受性

根據(jù)2.4實(shí)驗(yàn)方法，分別考察37℃(不產(chǎn)靈菌紅素)和28 ℃(產(chǎn)靈菌紅素)條件下，不同濃度的Cr6+對S.marcescensjx-1生長的影響，結(jié)果如圖5和圖6所示。

圖5 37 ℃時(shí)Cr6+對S.marcescens jx-1生長影響Fig.5 The effect of Cr6+to S.marcescens jx-1 at 37 ℃

圖6 28 ℃時(shí)Cr6+對S.marcescens jx-1生長影響Fig.6 The effect of Cr6+to S.marcescens jx-1 at 28 ℃

由圖5可知，不產(chǎn)生靈菌紅素時(shí)，50 mg/LCr6+對菌體表現(xiàn)出明顯抑制，培養(yǎng)24 h時(shí)抑制率為52.1%，100 mg/L時(shí)完全抑制，S.marcescensjx-1對Cr6+最高耐受濃度為50～100 mg/L。由圖6可知，產(chǎn)靈菌紅素時(shí)，Cr6+為50 mg/L時(shí)，對S.marcescensjx-1表現(xiàn)出一定抑制，培養(yǎng)24 h時(shí)抑制率為20.2%，Cr6+為100 mg/L時(shí)培養(yǎng)24 h抑制率達(dá)到65.4%，最高的耐受濃度在150～200 mg/L，與伍迪等[15]相比，耐受性更強(qiáng)。

3.4 S.marcescens jx-1對重金屬的去除作用

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法2.5，對發(fā)酵液中剩余重金屬含量進(jìn)行測定，考察S.marcescenjx-1對重金屬的去除作用，結(jié)果如圖7所示。

圖7 S.marcescens jx-1對重金屬的去除作用Fig.7 The removal effect of S.marcescens jx-1 to heavy metal

由圖7可知，S.marcescensjx-1對三種重金屬的去除效果表現(xiàn)為 Zn2+>Cr6+>Cu2+，48 h內(nèi)的最大去除率分別為63.3%、44.5%、32.3%，這與耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Zn2+> Cu2+>Cr6+不完全一致。從3.1～3.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，相較于100 mg/L的Cr6+和Cu2+，菌體對250 mg/LZn2+的耐受性最好，菌體生長性能最佳，通過吸附、絡(luò)合、主動吸收等機(jī)制[3,15]達(dá)到去除Zn2+的效果也相對最好，24 h內(nèi)達(dá)到最大去除率63.3%。100 mg/L的Cr6+和Cu2+對菌體生長的抑制較為接近，24 h的抑菌率分別為63.4%和65.4%， Cr6+的去除率高于Cu2+，這可能與菌體去除重金屬的機(jī)制有關(guān)。有研究表明，Cr6+能通過與粘質(zhì)沙雷氏菌的胞外代謝產(chǎn)物靈菌紅素發(fā)生粘連而去除發(fā)酵液中的Cr6+[13]，細(xì)菌對Cu2+的去除一般通過靜電引力和代謝吸收[15]為主，去除率會受到菌體表面帶的負(fù)電荷量和代謝效率的影響。

4 結(jié) 論

(1)S.marcescensjx-1對Cu2+、Zn2+、Cr6+具有良好的耐受性，耐受性表現(xiàn)為Zn2+> Cu2+>Cr6+。不產(chǎn)靈菌紅素時(shí)，Cu2+、Zn2+、Cr6+最大耐受濃度分別為100～150 mg/L、200～250 mg/L、50～100 mg/L；產(chǎn)靈菌紅素時(shí)，Cu2+、Zn2+、Cr6+最大耐受濃度分別為150～200 mg/L、>250 mg/L、150～200 mg/L。

(2)S.marcescensjx-1的代謝產(chǎn)物靈菌紅素，有助于增加菌體對重金屬的耐受性。首先S.marcescensjx-1在28 ℃培養(yǎng)時(shí)，靈菌紅素合成酶基因得到表達(dá)，產(chǎn)生靈菌紅素，對菌體的生長性能有促進(jìn)作用，菌體最高產(chǎn)量比37 ℃培養(yǎng)時(shí)提高200%左右，菌體細(xì)胞密度增加，每個菌細(xì)胞受到的重金屬損傷程度降低，因此菌體細(xì)胞表現(xiàn)出更高的耐受性。其次，有研究表明粘質(zhì)沙雷氏菌的次級代謝產(chǎn)物靈菌紅素能通過絡(luò)合重金屬來減少重金屬對菌體的傷害，從而提高菌體的耐受性[13]，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

(3)S.marcescensjx-1對三種重金屬的去除效果表現(xiàn)為 Zn2+>Cr6+> Cu2+，與耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果不完全一致，可能與菌體的吸附機(jī)制有關(guān)，48 h內(nèi)的最大去除率分別為63.3%、44.5%、32.3%。