葉爽，王丹，陳雪，章慧，劉開泰，周重昌，葉棟

喉癌是全球最常見的頭頸部惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均較高[1]。喉癌治療失敗的主要原因是局部復(fù)發(fā)，術(shù)后復(fù)發(fā)患者預(yù)后較差，構(gòu)建喉癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型尤為重要[2-3]。細(xì)胞凋亡又稱細(xì)胞程序性死亡，是基因介導(dǎo)的細(xì)胞自主且有序的死亡。壞死性凋亡是最新提出的一種新型的細(xì)胞程序性死亡，在經(jīng)典凋亡途徑受抑時(shí)其以替補(bǔ)方式被激活[4]。研究證實(shí)，多種腫瘤發(fā)生發(fā)展與壞死性凋亡途徑相關(guān)，包括黑色素瘤[5]，結(jié)腸癌[6]等。壞死性凋亡的觸發(fā)在結(jié)腸癌和血液系統(tǒng)腫瘤治療中有一定效果[7]。本研究通過癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫獲得喉癌患者壞死性凋亡相關(guān)基因的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，建立復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型，來評(píng)估壞死性凋亡基因組成的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型對(duì)喉癌患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測價(jià)值。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集與處理 利用TCGA 數(shù)據(jù)庫（https://portal.gdc.cancer.gov ）下載111 例喉癌樣本的RNA-seq數(shù)據(jù)及患者的臨床信息。利用基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（GEO）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）下載GSE27020 數(shù)據(jù)集109 例喉癌樣本的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)。研究入組病理確診為喉癌的患者，排除沒有完整臨床資料的患者。TCGA 隊(duì)列為訓(xùn)練集，GEO 隊(duì)列為驗(yàn)證集。

1.2 壞死性凋亡基因差異表達(dá)分析通過檢索與閱讀文獻(xiàn)，篩選獲得67 個(gè)壞死性凋亡相關(guān)基因，使用“l(fā)imma”軟件包篩選喉癌組織和正常組織之間差異表達(dá)的壞死性凋亡基因用于下一步分析。

1.3 單因素Cox 回歸分析及LASSO 回歸分析 利用“survival”包對(duì)差異表達(dá)的壞死性凋亡基因進(jìn)行單因素Cox 回歸分析，篩選出與喉癌復(fù)發(fā)相關(guān)的壞死性凋亡基因。利用“glmnet”軟件包對(duì)復(fù)發(fā)相關(guān)的壞死性凋亡基因進(jìn)行LASSO 回歸分析。采用10 倍交叉驗(yàn)證來確定模型中 值，最優(yōu) 值為選擇偏似然偏差最小 值。確定關(guān)鍵基因后構(gòu)建預(yù)測模型并計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=0.3232×FADD的表達(dá)水平+（－ 0.4492）×ZBP1 的表達(dá)水平+（－0.4454）×TRAF2的表達(dá)水平+（－0.3687）×STUB1 的表達(dá)水平+0.4924×IDH1的表達(dá)水平+0.5242×APP 的表達(dá)水平。計(jì)算喉癌復(fù)發(fā)患者風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，利用風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中位數(shù)值分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，建立喉癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型。

1.4 復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型評(píng)價(jià)和Kaplan-Meier（K-M）生存分析 利用“survival”軟件包對(duì)低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組行無復(fù)發(fā)生存（RFS）的K-M 生存分析。利用“survival ROC”軟件包建立喉癌患者1 年、3年和5年RFS的ROC曲線，并計(jì)算AUC值以評(píng)估其復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測效果，當(dāng)AUC值＞0.7 時(shí)，說明預(yù)測模型的準(zhǔn)確率優(yōu)良。結(jié)合患者臨床信息，對(duì)該模型進(jìn)行多因素Cox 回歸分析，評(píng)估該模型在預(yù)測喉癌復(fù)發(fā)方面的獨(dú)立作用。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)使用R軟件（4.0.3）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并繪制圖像。采用t 檢驗(yàn)或2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本情況 匯總符合納入標(biāo)準(zhǔn)的TCGA 數(shù)據(jù)庫中111 例喉癌患者臨床基線資料，其中男91例，女20例；年齡≤60歲47 例，＞60 歲64 例；病理分化程度為1 期8 例，2～3 期99 例，未知4 例；T 分期1～2 期19 例，3～4 期79 例，未知13 例；N 分期0 期39 例，1～3 期53 例，未知19 例；M 分期0 期40 例，1期9 例，未知62 例；臨床分期I～I(xiàn)I期13例，III～I(xiàn)V期85 例，未知13 例；死亡50例，生存61 例；復(fù)發(fā)42 例，未復(fù)發(fā)69 例。

2.2 與喉癌復(fù)發(fā)相關(guān)的壞死性凋亡基因的確定 結(jié)合患者相對(duì)應(yīng)的臨床信息，通過單因素Cox回歸分析，初步篩選出6 個(gè)復(fù)發(fā)相關(guān)的壞死性凋亡基因，包括FADD、ZBP1、TRAF2、STUB1、IDH1和APP，見表1。其中FADD、IDH1 和APP為喉癌復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，ZBP1、TRAF2和STUB1 是喉癌復(fù)發(fā)的保護(hù)因子。通過LASSO回歸明確這6 個(gè)壞死性凋亡基因均是關(guān)鍵基因，見封三彩圖1。

表1 6 個(gè)壞死性凋亡相關(guān)基因的詳細(xì)信息

2.3 喉癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型的構(gòu)建和效果評(píng)價(jià) K-M 無復(fù)發(fā)生存分析顯示，低風(fēng)險(xiǎn)組患者無復(fù)發(fā)生存時(shí)間較高風(fēng)險(xiǎn)組長（P ＜0.00，封三彩圖2a）。ROC 曲線顯示（封三彩圖2b），患者1 年、3 年和5 年無復(fù)發(fā)生存率的AUC 值分別為0.767、0.827 和0.765，表明該模型對(duì)喉癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測效果良好。在GEO驗(yàn)證集中驗(yàn)證了該模型預(yù)測喉癌復(fù)發(fā)的有效性，K-M生存分析顯示，低風(fēng)險(xiǎn)組患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)低（P=0.025，封三彩圖2c）。患者1 年、3 年和5 年無復(fù)發(fā)生存率的AUC 值分別為0.631、0.664 和0.671（封三彩圖2d）。多因素Cox 回歸分析結(jié)果顯示，該復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型為獨(dú)立的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測因子（HR=3.235，95%CI 1.777～5.888，P ＜0.01），見圖1。

圖1 多因素Cox 回歸分析風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與無復(fù)發(fā)生存時(shí)間關(guān)系的森林圖

圖1 基因LASSO Cox 回歸模型

圖2 喉癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型

3 討論

治療后復(fù)發(fā)是喉癌患者術(shù)后最常見的死亡原因之一[2]。但對(duì)于喉癌復(fù)發(fā)患者，目前仍缺乏可靠的預(yù)測模型，本研究構(gòu)建并驗(yàn)證一種基于壞死性凋亡基因的喉癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型，高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較高，ROC曲線證實(shí)了該模型在喉癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測方面的良好效果。因此，對(duì)于高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分患者應(yīng)該采取更徹底的治療。

細(xì)胞凋亡是生物體內(nèi)常見的一種細(xì)胞死亡方式。Degterev 等[4]首次報(bào)道一種新型細(xì)胞死亡模式，既壞死性凋亡。研究認(rèn)為腫瘤細(xì)胞對(duì)經(jīng)典細(xì)胞凋亡途徑具有抗性時(shí)可能對(duì)壞死性凋亡途徑敏感[7]。本研究構(gòu)建并驗(yàn)證了基于壞死性凋亡基因的喉癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型，該模型由壞死性凋亡相關(guān)基因FADD、ZBP1、TRAF2、STUB1、IDH1 和APP 組成。FADD基因拷貝數(shù)變異和蛋白表達(dá)是口腔鱗狀細(xì)胞癌潛在的預(yù)后標(biāo)志物，F(xiàn)ADD拷貝數(shù)擴(kuò)增和蛋白表達(dá)高的患者無病生存時(shí)間最短[8]。FADD 基因高表達(dá)喉癌患者的死亡率較高，預(yù)后較差[9]。在乳腺癌腦轉(zhuǎn)移患者中，ZBP1高表達(dá)患者預(yù)后好于低表達(dá)患者[10]。抑制ZBP1的表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移的增加[11]。上述結(jié)果表明ZBP1 是乳腺癌的保護(hù)因子，但ZBP1 在喉癌中作用尚不明確。

研究表明，STUB1 在口腔癌組織中的表達(dá)被異常抑制，其低表達(dá)與口腔癌患者較差的無復(fù)發(fā)生存相關(guān)[12]。關(guān)于IDH1/2 突變的研究多集中在腦膠質(zhì)瘤等中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，目前有關(guān)于IDH1在喉癌中作用的研究較少。研究表明，包括APP 在內(nèi)的80 個(gè)基因被鑒定為預(yù)測喉癌復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物[13]，但目前仍缺乏直接證據(jù)表明APP 在喉癌中的作用。目前涉及上述6 個(gè)壞死性凋亡基因在喉癌復(fù)發(fā)中預(yù)測作用尚未被發(fā)現(xiàn)。

綜上所述，筆者構(gòu)建并驗(yàn)證了一種壞死性凋亡基因相關(guān)的喉癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型，高危險(xiǎn)評(píng)分患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高于低危險(xiǎn)評(píng)分患者，但需更多的臨床研究來驗(yàn)證這一模型在預(yù)測喉癌復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)中的作用。