曾川 何源芳 劉佳偉 王琪 王領(lǐng)

金銀花中綠原酸為天然多酚類物質(zhì)，具有極強(qiáng)的抗氧化活性，能抵御紫外線對(duì)人體皮膚的傷害，保護(hù)膠原蛋白免受自由基攻擊，具有較高的美容開(kāi)發(fā)價(jià)值，但由于綠原酸的脂溶性差，不易透過(guò)人體角質(zhì)層，極大地限制了其應(yīng)用。為更好的利用金銀花，發(fā)掘金銀花綠原酸的新功效及其靶點(diǎn)，為金銀花綠原酸的護(hù)膚美容提供理論支持和現(xiàn)代科學(xué)依據(jù)。本研究以無(wú)水乙醇為溶劑，利用超聲提取法制備金銀花綠原酸磷脂復(fù)合物，使用離體小鼠皮膚模擬人體皮膚，在 Franz 擴(kuò)散池進(jìn)行體外透皮吸收實(shí)驗(yàn)，分別測(cè)定吸收池溶液的綠原酸含量及綠原酸磷脂復(fù)合物含量，比較分析透皮吸收率。結(jié)果顯示，0-10h 綠原酸溶液體外透皮吸收率大于該復(fù)合物，而10h 之后透皮率則明顯小于該復(fù)合物，表明綠原酸磷脂復(fù)合物可以提高綠原酸的生物利用率，為綠原酸后續(xù)研究及開(kāi)發(fā)利用提供了新的方向。

關(guān)鍵詞：綠原酸；磷脂復(fù)合物；體外透皮吸收

金銀花（honeysuckle） 又名忍冬花，屬忍冬科植物，為干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，是中國(guó)傳統(tǒng)的藥用品種，最早在《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載。金銀花富含揮發(fā)油、萜類、環(huán)烯醚萜苷類、三萜皂苷類、黃酮類、有機(jī)酸類、無(wú)機(jī)元素等多種化學(xué)成分[1]，具有較高的藥用價(jià)值。近代對(duì)于金銀花化學(xué)成分的研究以綠原酸為主，綠原酸是金銀花中典型的抗氧化功效成分，有著很強(qiáng)的藥理活性[2]。藥理學(xué)研究表明，綠原酸具有抑制葡萄糖-6-磷酸酶活性、降血脂、改善血液流動(dòng)情況、免疫調(diào)節(jié)、抗病菌病毒、抗炎等功效[3-6]。在皮膚美容功效方面，綠原酸的活性羥基可以形成具有抗氧化作用的氫自由基，可保護(hù)膠原蛋白不受活性氧等自由基傷害，有效防止紫外線對(duì)人體皮膚產(chǎn)生的傷害[7，8]，還能抑制酪氨酸酶和過(guò)氧化氫酶活性來(lái)清除細(xì)胞中的活性氧[9]，羅磊等人發(fā)現(xiàn)，綠原酸對(duì)于 DPPH 有較高的抑制率，抗氧化能力是抗壞血酸近3倍[10-11]。

綠原酸屬于多酚類化合物，脂溶性較差，不易透過(guò)皮膚角質(zhì)層或滯留于皮膚表面難以發(fā)揮其功效，因此大大影響了綠原酸在化妝品中的實(shí)際應(yīng)用，如果采用脂質(zhì)體技術(shù)將其包埋，將更有利于其透皮吸收而發(fā)揮功效。脂質(zhì)體是藥劑學(xué)中的一類常規(guī)釋藥系統(tǒng)，常常用作為難溶性藥物的給藥劑型，來(lái)提高其生物利用率。區(qū)別于傳統(tǒng)脂質(zhì)體，復(fù)合磷脂脂質(zhì)體是通過(guò)與磷脂雙分子層進(jìn)行排列作為外相來(lái)形成球型藥物載體，包裹著作為內(nèi)相的活性成分藥物，具有更好穩(wěn)定性，克服了傳統(tǒng)脂質(zhì)體包合率低和藥量偏低的問(wèn)題，更有效的提高活性成分的吸收與利用程度[12-13]。

根據(jù)范明輝等[14]人的研究，在脂質(zhì)體的制備中，膽固醇對(duì)脂質(zhì)體的物化性質(zhì)影響不大，所以在本次實(shí)驗(yàn)中采用了磷脂復(fù)合的制備工藝，使用大豆卵磷脂對(duì)綠原酸進(jìn)行包裹，參考趙安權(quán)等[15]人的實(shí)驗(yàn)方法，采用超聲提取的方式進(jìn)行復(fù)合物的制備并利用復(fù)合物極易溶于三氯甲烷，而綠原酸不溶于三氯甲烷的特性，將復(fù)合物分離。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)采用了正交試驗(yàn)方法，確定復(fù)合率較高的工藝，通過(guò)該工藝制備的綠原酸磷脂復(fù)合物再經(jīng)過(guò) Franz 擴(kuò)散池的體外透皮吸收實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行研究，以期提高生物利用率。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

綠原酸（分析純），西安首禾生物科技有限公司；無(wú)水乙醇，天津大貿(mào)化學(xué)試劑廠；大豆卵磷脂，日本富士和光株式會(huì)社；小鼠，山東中醫(yī)藥大學(xué)；三氯甲烷（分析純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；生理鹽水（注射級(jí)） 上海長(zhǎng)征富民藥業(yè)有限公司。

1.2儀器

SK5200H 高頻超聲波清洗儀，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司； SHZ- DIII 循環(huán)水式多用真空泵，?；ゼ褍x器設(shè)備有限公司；Franz 擴(kuò)散池，上海玉研科學(xué)儀器有限公司；佑科 UV1810S 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司；上海亞榮 RE-5220旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海壘固儀器有限公司；德國(guó) IKA 艾卡 EUROSTAR 20頂置式攪拌器，艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；DHP-9082BS-Ⅲ電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；德國(guó) IKA 艾卡 T25/T18 digital 數(shù)顯分散機(jī)，艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司；AB265-S/FACT 型電子天平，上海梅特勒托利多儀器有限公司；上海盧湘儀 TG16-WS 臺(tái)式高速離心機(jī)，上海坤權(quán)生物科技有限公司。

0 2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 綠原酸磷脂復(fù)合物制備

將一定量的大豆卵磷脂溶于300mL 無(wú)水乙醇之中，常溫?cái)嚢?h，v=450r/min。攪拌溶解之后用濾餅抽濾除去不溶物，收集濾液放入燒杯備用。燒杯中加入1.0g 綠原酸，超聲提取后得到綠原酸、大豆卵磷脂和綠原酸磷脂復(fù)合物混合物。將所得溶液加入圓底燒瓶進(jìn)行減壓旋蒸，除去全部乙醇。加入三氯甲烷溶解混合物，反復(fù)洗滌三次用濾紙過(guò)濾除去綠原酸。再次減壓濃縮除去溶劑，放入恒溫箱中繼續(xù)揮發(fā)剩余三氯甲烷即得綠原酸磷脂復(fù)合物。

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

精密稱量綠原酸0.0150g，加入無(wú)水乙醇溶解后轉(zhuǎn)移至250mL 容量瓶中，并加入無(wú)水乙醇定容至刻度線，搖晃均勻得到0.06mg/mL 綠原酸溶液。分別精密取出綠原酸溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL 加入25mL 量筒中，加入無(wú)水乙醇至20mL 刻度線后搖晃均勻，分別得到濃度為0.003mg/mL、0.006mg/mL 、0.009mg/mL、0.012mg/ mL、0.015mg/mL 綠原酸溶液。分別于330nm 處測(cè)量吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，作得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3復(fù)合率計(jì)算

精密稱量實(shí)驗(yàn)所得復(fù)合物0.1000g，加入50mL 乙醇溶解，以250mL 容量瓶定容，震蕩均勻后精密量取1.00mL 加入燒杯中，再加入50mL 去離子水進(jìn)行充分均質(zhì)，均質(zhì)條件為8000r/min，t=10min，吸取溶液3mL 進(jìn)行離心，離心條件為4000r/min，t=30min，強(qiáng)制分離綠原酸和卵磷脂。后取下清液于330nm 處測(cè)量吸光度，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算即得復(fù)合率。

2.4單因素考察

2.4.1反應(yīng)物質(zhì)量濃度的影響

以無(wú)水乙醇為反應(yīng)溶劑、綠原酸與磷脂投料比為1∶1、反應(yīng)溫度20℃、反應(yīng)時(shí)間2h，使用4.0、6.0、8.0、10mg/ mL 的綠原酸乳液進(jìn)行磷脂復(fù)合物制備，得到不同綠原酸濃度下的復(fù)合率，考察綠原酸濃度對(duì)復(fù)合率的影響。

2.4.2投料比的影響

以無(wú)水乙醇為反應(yīng)溶劑、反應(yīng)溫度20℃、反應(yīng)時(shí)間2h、綠原酸8mg/mL，使用投料比為1∶0.8、1∶1、1∶2、1∶3的綠原酸與磷脂進(jìn)行磷脂復(fù)合物制備，得到不同投料比下的復(fù)合率，考察綠原酸與磷脂的投料比對(duì)復(fù)合率的影響。

2.4.3反應(yīng)時(shí)間的影響

以無(wú)水乙醇為反應(yīng)溶劑、綠原酸與磷脂投料比為1∶1、反應(yīng)溫度20℃、綠原酸8mg/mL，反應(yīng)1、1.5、2、3 h 后，得到不同反應(yīng)時(shí)間下的復(fù)合率，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)復(fù)合率的影響。

2.4.4反應(yīng)溫度的影響

以無(wú)水乙醇為反應(yīng)溶劑、綠原酸與磷脂投料比為1∶1、反應(yīng)時(shí)間2h、綠原酸8mg/mL，在20、30、40、50℃時(shí)進(jìn)行磷脂復(fù)合物制備，得到不同反應(yīng)溫度下的復(fù)合率，考察反應(yīng)溫度對(duì)復(fù)合率的影響。

2.5正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素考察的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以反應(yīng)物的質(zhì)量濃度（A）、投料比（B）、反應(yīng)時(shí)間（C）和反應(yīng)溫度（D）為影響因素。以復(fù)合率為指標(biāo)，每個(gè)因素取3個(gè)水平，采用 L9（34）表進(jìn)行正交試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化這4個(gè)因素的最佳水平。

2.6皮膚樣品處理

用脫毛膏脫去小鼠腹部毛發(fā)后，脫頸致死，快速剝離腹部皮膚，取適宜大小鼠皮，小心剔除皮下脂肪，以生理鹽水反復(fù)浸泡沖洗至干凈無(wú)粘連物，并用濾紙吸干小鼠皮膚表面的生理鹽水，將清洗之后的小鼠皮膚切成1cm×1cm 小片，浸泡于生理鹽水中并放置于冰箱備用。

2.7體外透皮吸收實(shí)驗(yàn)

分別以無(wú)水乙醇配置濃度為0.1mg/mL 綠原酸溶液和磷脂復(fù)合物（以綠原酸計(jì)） 溶液備用。樣品池注水并排除氣泡，調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件，保持接收池內(nèi)溫度為37.0℃。擴(kuò)散池注滿生理鹽水，設(shè)置磁子攪拌轉(zhuǎn)速為200r/min。取兩塊小鼠皮分別固定于樣品池與接收池之間，角質(zhì)層面向樣品池。對(duì)照組加入綠原酸溶液，實(shí)驗(yàn)組加入復(fù)合物溶液，分別于0.25h、0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、10h、20h、24h 吸取反應(yīng)溶液1mL，后用生理鹽水補(bǔ)足至刻度線。將吸取溶液稀釋5倍后測(cè)量吸光度。按照下式計(jì)算透過(guò)率。

（μg ·mL-1）；Ci 為第i （i≤ n －1）個(gè)取樣點(diǎn)測(cè)得的藥物質(zhì)

量濃度（μg ·mL-1）；A 為擴(kuò)散池的有效透皮滲透面積；V 為接收液體積；Vi 為取樣體積。

3 結(jié)果與討論

3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線

以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸后，得到回歸線性方程 y=62.83x+0.0009（R2=0.9991），結(jié)果顯示，綠原酸0.003～0.015mg/mL 與吸光度呈良好線性關(guān)系。

3.2復(fù)合率

3.2.1綠原酸濃度對(duì)復(fù)合率的影響

綠原酸為4.0、6.0、8.0、10mg/mL 時(shí)，復(fù)合率分別為73.8％、79.3%、86.2%、82%（ n=3），復(fù)合率隨著綠原酸濃度的增加而提高，但當(dāng)綠原酸濃度大于8mg/mL 時(shí)，隨著綠原酸濃度的增加，復(fù)合率卻有所下降，因此綠原酸濃度不宜過(guò)高。

3.2.2綠原酸與磷脂的投料比對(duì)復(fù)合率的影響

綠原酸與磷脂的投料比為1：0.8、1：1、1：2、1：3時(shí)的復(fù)合率分別為71.3%、86.4%、74.8%、73%（ n =3）;在投藥比為1∶1時(shí)，復(fù)合率達(dá)到最高。

3.2.3反應(yīng)時(shí)間的影響

反應(yīng)1、1.5、2、3 h 后，復(fù)合率分別為77%、81.1%、85%、85.8%（ n =3）。隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，復(fù)合率提高，但是在2h 后復(fù)合率的提高并不明顯。

3.2.4反應(yīng)溫度對(duì)復(fù)合率的影響

20、30、40、50℃時(shí)綠原酸與磷脂的復(fù)合率分別為87.5%、86.4%、83.5%、78.5%（ n =3），隨著反應(yīng)溫度的升高，復(fù)合率逐漸下降，可能是由于綠原酸對(duì)熱不穩(wěn)定。

3.3正交試驗(yàn)

根據(jù)極差分析可知，表明各因素對(duì)綜合指標(biāo)影響大小為 B ＞ D ＞A ＞ C，即投料比影響最大，其次是反應(yīng)溫度，再次是反應(yīng)物質(zhì)量濃度，最后是反應(yīng)時(shí)間。以 A3B1C2D1為最佳，最終確定工藝為綠原酸和磷脂投料比為1：1，反應(yīng)溫度為20℃，反應(yīng)時(shí)間為2h，反應(yīng)物質(zhì)量濃度為8mg/mL。

采用最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次，結(jié)果見(jiàn)表3。驗(yàn)證試驗(yàn)與正交試驗(yàn)的結(jié)果一致，所得復(fù)合物的復(fù)合率不低于84.5%，說(shuō)明此優(yōu)化工藝穩(wěn)定可行。

3.4體外透皮吸收

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，大約在10h 之前，綠原酸磷脂復(fù)合物的透皮率低于綠原酸溶液的透皮率，而在10h 之后綠原酸的透皮率則顯著小于其復(fù)合物。這可能是由于綠原酸的分子量較小，而復(fù)合物的分子量較大，而且和皮膚親和力較好，所以減緩了復(fù)合物的釋放，因此前期綠原酸溶液透皮率更高。而10h 之后，復(fù)合物透過(guò)速率明顯高于綠原酸溶液，可能是因?yàn)槠つw開(kāi)始釋放復(fù)合物，故速率增大。同時(shí)，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，綠原酸溶液的透過(guò)速率有所減慢，可能是小鼠皮對(duì)于綠原酸的吸收方式主要通過(guò)滲透壓進(jìn)行，隨著壓差的降低，透過(guò)速率減慢，而透過(guò)速率減慢導(dǎo)致滲透的溶液比用來(lái)測(cè)量時(shí)吸取的溶液少，所以20h 后體外透皮吸收濃度下降。

鑒于綠原酸溶液與綠原酸磷脂復(fù)合物在透皮吸收時(shí)間上的差異性，在護(hù)膚品領(lǐng)域應(yīng)用中，可充分利用時(shí)間差異性對(duì)配方進(jìn)行調(diào)整，采用合適的添加比例，最大程度的發(fā)揮綠原酸溶液和綠原酸磷脂復(fù)合物在抗菌抗氧化、清除自由基、抗衰老方面的協(xié)同作用。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用超聲提取的方式制備了綠原酸和卵磷得到了復(fù)合率較高的磷脂復(fù)合制備工藝，再經(jīng)過(guò)體外透皮吸收實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。研究結(jié)果表明，0～10h 綠原酸溶液體外透皮吸收率大于該復(fù)合物，而10h 之后透皮率則明顯小于該復(fù)合物，綠原酸的脂溶性得到了顯著提高。以磷脂復(fù)合物為載體能增強(qiáng)綠原酸的透皮率，可以提高綠原酸的生物利用度，為綠原酸進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)利用提供了更多的可能性。

參考文獻(xiàn)

[1] 夏遠(yuǎn) ， 李弟灶 ， 裴振昭 ， 等 . 金銀花化學(xué)成分的研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)現(xiàn)代中藥 2012，4：26-32.

[2] 劉豪 ， 張冬青 ， 劉碩 ， 等 . 金銀花不同提取物抗氧化活性的研究 [J]. 食品研究與開(kāi)發(fā) 2016，37（01），48-52.

[3] 劉雪輝 ， 李覓路 ， 譚斌 ， 等 . 紫甘薯莖葉中綠原酸及異綠原酸對(duì)α葡萄糖苷酶的抑制作用 [J]. 現(xiàn)代食品科技 ，2014，30（3）： 103-107.

[4] FENG R T， LU Y J， BOWMAN L L， et al. Inhibition of activator rotein-1， NF-κB， a nd MAPKs and induction of phase 2 detoxifying enzyme activity by chlorogenic acid[J].Journal of Biological Chemistry， 2005， 280 （30） ：27888-27895.

[5] ZHENG G D， QIU Y Y， ZHANG Q F， et al. Chlorogenic acid and caffeine in combination inhibit fat accumulation by regulating hepatic lipid metabolism-related enzymes in mice[J].British Journal of Nutrition， 2014， 112 （6） ：1034-1040.

[6] Rajasekharan S K， Ramesh S， Satish A S， et al. Antibiofilm and anti-β-lactamase activities of burdock root extract and chlorogenic acid against Klebsiella pneumoniae[J].J MicrobioBiotechnol，2017，27（3）：542-551.

[7] PELLATI F， BENVENUTI S， MAGRO L， et al .Analysis of phenoliccompounds and radical scavenging activity of Echinacea spp.[J].JPharm Biomed Anal， 2004， 35：289-301.

[8] IWAI K， KISHIMOTO N， KAKINO Y， et al. In vitro antioxidative effectsand tyrosinase inhibitory activities of seven hydroxycinnamoylderivatives in green coffee beans[J].J Agric Food Chem， 2004，52：4893-4898.

[9] FENG R T， LU Y J， BOWMAN L L， et al. Inhibition of activatorprotein-1， NF-κ B， and MAPKs and induction of phase 2 detoxifyingenzyme activity by chlorogenic acid[J].Journal of BiologicalChemistry， 2005， 280（30）：27888-27895.

[10]汪洪濤.綠原酸應(yīng)用開(kāi)發(fā)研究進(jìn)展[J].江蘇調(diào)味副食品 ，2020（02）：1-3+17.

[11]羅磊 ， 郭曉園.金銀花提取液抗氧化活性研究[J].食品科學(xué) ，2009，30（21）：63-65.

[12]娜娜 ， 陸兔林 ， 陳軍 ， 等.莪術(shù)油復(fù)合磷脂脂質(zhì)體的制備工藝[J]．中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志 ，2010，16（18）：14-17.

[13]曾誠(chéng) ， 黃偉 ， 何承輝 ， 等.復(fù)合磷脂脂質(zhì)體的研究進(jìn)展[J].國(guó)際藥學(xué)研究雜志2015，42（01），91-95.

[14]范明輝 ， 許時(shí)嬰.膽固醇對(duì)紅景天苷脂質(zhì)體的制備及物化穩(wěn)定性的影響[J].食品科學(xué) ，2008（02）：59-63.

[15]趙安權(quán) ， 王倩倩 ， 李佳 ， 等.綠原酸磷脂復(fù)合物制備工藝的研究[J].華西藥學(xué)雜志 ，2015，30（02）：155-157.