翟麗麗 陳文靜 劉惠銘

【摘要】目的：探討Girdin在胃癌組織中的表達及其與胃癌血管生成、侵襲及轉移的關系。方法：通過免疫組織化學方法檢測Girdin蛋白在人胃癌組織中的表達情況，分析其和胃癌血管生成及患者臨床病理特征的關系及臨床意義。結果：胃癌組織中，Girdin表達和微血管密度（MVD）均顯著高于正常胃黏膜（P <0.05）。胃癌組織中，Girdin蛋白陽性產物主要定位于細胞核和（或）細胞質，且與胃癌的分化程度、臨床分期、Lauren分型及淋巴結轉移顯著相關（P <0.05）。胃癌組織中的 MVD與分化程度、臨床分期、Lauren 分型及淋巴結轉移顯著相關（P <0.05）。胃癌組織中，Girdin表達與微血管壁周細胞覆蓋率（MPI）呈反比（P <0.01），且隨著Girdin表達的增高，MVD逐漸增加，而 MPI則逐漸減少。結論：Girdin在胃癌侵襲和轉移過程中起重要作用。同時，Girdin的表達與胃癌的血管生成關系密切，而這種血管為不成熟血管，周細胞覆蓋率減低，其成為胃癌患者預后差的重要因素。

【關鍵詞】Girdin;胃癌;侵襲;轉移

【中圖分類號】R735.2【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-5249（2022）15-0189-05

胃癌的高死亡率與其侵襲和轉移關系密切，研究表明，腫瘤的血管生成在腫瘤的侵襲和轉移中起重要作用，腫瘤細胞通過新生血管提供氧氣及營養(yǎng)物質來促進自身的增殖并侵入血管實現(xiàn)遠處轉移。Girdin蛋白是一種能被 Akt/蛋白激酶B激活的肌動蛋白結合蛋白，在重塑肌動蛋白細胞骨架和腫瘤進展中發(fā)揮重要作用，包括腫瘤的遷移、侵襲、轉移和血管生成[1]。

本研究通過免疫組化方法檢測Girdin蛋白在人胃癌組織中的表達情況，分析其和胃癌血管生成及患者臨床病理特征的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取齊齊哈爾市第一醫(yī)院病理科2015年01月至2017年08月病理診斷為胃癌的石蠟標本60例，其中男性44例，女性16例，年齡35～76歲，中位年齡60歲。按第5版世界衛(wèi)生組織消化系統(tǒng)腫瘤分類標準[2]，組織學分級為高、中分化者41例，低分化和未分化者19例;臨床分期Ⅰ～Ⅱ期37例，Ⅲ～Ⅳ期23例;淋巴結轉移者37例，無轉移者23例。按1965年 Lauren 分型，腸型34例，彌漫型26例。同時收集20例相應的癌旁正常胃黏膜組織（距腫瘤邊緣>2 cm）作為對照組。所有病例術前均未行放、化療。

1.2 方法

標本均經(jīng)4%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4μm 厚連續(xù)切片，免疫組化采用EliVision法染Girdin蛋白及DouSPTM免疫組化雙染試劑盒染血管內皮細胞及血管周細胞，一抗分別為兔抗人Girdin多克隆抗體（稀釋度1∶200），購自于美國 Santa Cruz 公司，即用型鼠抗人 CD34單克隆抗體（克隆號：QB End/10）標記血管內皮細胞，即用型鼠抗人α-SMA 單克隆抗體（克隆號：1A4）標記血管周細胞，上述兩種試劑購自福州邁新生物技術開發(fā)公司。操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。所有指標的結果均由兩位高年資病理醫(yī)師經(jīng)雙盲法判定。

1.3 結果判定

（1） Girdin陽性產物主要定位于胃癌細胞核和（或細胞質，采用半定量積分法，根據(jù)陽性細胞數(shù)和著色強度判斷結果。陽性細胞所占百分比：0分為≤5%，1分為6%～25%，2分為26%～50%，3分為51%～75%，4分為>75%;染色深度：0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色，兩者相乘：≤4分為陰性，>4分為陽性;（2）微血管密度（MVD）的判定標準參照 Weidner 等的方法，微血管計數(shù)以 CD34標記的內皮細胞形成一獨立管腔即為一血管，只要結構不相連，其分支結構也計作1個血管;（3）高倍鏡下計數(shù)相應血管數(shù)及周細胞覆蓋血管數(shù)，并求其平均值，統(tǒng)計微血管壁周細胞覆蓋率（MPI）。

1.4 統(tǒng)計學分析

應用 SPSS 29.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗，以[ n （%）]表示，計量資料采用 t 檢驗，MVD以（ x（—）± s ）表示，Girdin與 MVD、MPI 的相關性分析采用Mann-Whitney U 檢驗。以 P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Girdin表達

Girdin在20例癌旁正常胃黏膜中僅有5例陽性，且均為弱陽性;而在60例胃癌組織中42例陽性，二者差異顯著（P<0.01），見表1。Girdin主要表達于胃癌細胞核和（或）細胞質（圖1～2），尤其是腫瘤浸潤的最前緣。應用抗α-SMA、CD34兩個第一抗體分別標記同一張切片上的周細胞與內皮細胞，其中內皮細胞胞漿及胞膜染成深紅色，周細胞胞漿出現(xiàn)紫黑色顆粒沉積（圖3～4），有些血管的管壁只由一層內皮細胞覆蓋，而無周細胞;而有些血管有兩層細胞：周細胞在內皮細胞外側，緊貼內皮細胞，在癌巢及其周圍的間質中均有較豐富血管分布，尤其在腫瘤浸潤的前緣最為密集。60例胃癌中 MVD 平均值是（46.8±9.97）個/HPF，而20例癌旁正常胃黏膜中 MVD 平均值是（24.82±4.45）個/HPF，差異顯著（P<0.01），見表1。

2.2 胃癌中Girdin、MVD、MPI及臨床各病理參數(shù)

Girdin及 MVD 隨著胃癌分化程度的降低、臨床分期的升高而增加（表2）。 MPI 與胃癌的分化程度呈正相關（P <0.01），與脈管內是否有癌栓呈負相關（P <0.01），與其他特征無關（P >0.05）。在60例胃癌組織中，42例Girdin陽性患者的 MVD 平均值為（54.23±10.95）個/HPF，而18例陰性患者的 MVD 平均值為（42.53±5.84）個/HPF，二者差異顯著（ P <0.01），且隨著Girdin表達的增多，MVD 亦逐漸增多。在60例胃癌組織中，Girdin陽性者的 MPI 平均值為（39.35±9.84）%，而陰性者的 MPI 平均值為（46.78±4.83）%，二者具有顯著的相關性（P<0.01），且隨著Girdin在胃癌組織中的表達增加，腫瘤間質不成熟血管增多。但MVD與MPI之間不存在相關性（P>0.05，見圖5）。

3 討論

胃癌是全球范圍內發(fā)病率最高的腫瘤之一，而我國是胃癌的高發(fā)區(qū)，年患病率和死亡率均是世界平均水平的2倍多。近30%患者在初診時已是晚期，40%局灶腫瘤患者在術后出現(xiàn)復發(fā)與轉移，10%～20%晚期胃癌患者對化療藥物如順鉑耐藥，且其他患者在化療6～15個月逐漸產生耐藥，從而導致腫瘤進展，預后極差[2-3]。胃癌發(fā)生、發(fā)展是一個多因素、多步驟參與的復雜過程，具有明顯的侵襲性。為了提高胃癌患者的生存質量，改善胃癌患者的預后，我們應尋找胃癌新的治療靶點。磷脂酰肌醇3-激酶/Akt 絲氨酸/蘇氨酸激酶系統(tǒng)通過大量下游底物的磷酸化調節(jié)多種細胞過程，現(xiàn)已被公認為癌癥侵襲和轉移的重要信號通路，但關于 Akt 在細胞遷移中的作用的信息相對較少，這是與癌癥侵襲和轉移直接相關的關鍵過程。Akt 結合蛋白Girdin（肌動蛋白絲束），也稱為 Akt 磷酸化增強劑、 Gα相互作用囊泡相關蛋白和 Hook 相關蛋白1，其由位于2號染色體上的Girdin基因表達，在哺乳動物細胞中普遍表達，其蛋白質產物由1870個氨基酸組成，相對分子質量為2.2×105～2.5×105[4]。Girdin蛋白由3個結構域構成：氨基末端、卷曲螺旋區(qū)域和羧基末端。氨基末端與 HOOK 蛋白家族分子結構類似并能夠與細胞內微管、Dynamin 以及 GISC1蛋白相結合，調節(jié)肌動蛋白結構的形成，參與細胞骨架的構建，對細胞的結構的完整以及運動起到至關重要的作用[5];中間為螺旋卷曲區(qū)域，其參與形成二聚體蛋白;羧基末端包括含質膜結合位點以及 AKT 磷酸化位點的 CT1結構域和含有肌動蛋白結合區(qū)、膜結合區(qū)以及 AKT磷酸化位點的CT2結構域，具有特異性結合多種配體的功能[6]。研究發(fā)現(xiàn)，Girdin蛋白通過自身的結構特征發(fā)揮生物學作用，影響微環(huán)境的變化，尤其對腫瘤的侵襲及轉移起到促進作用。通過下調 MEG3降低Girdin的水平，從而減少其與血管內皮細胞的作用，降低內皮細胞的破壞，使血管的完整性得以保存，從而抑制腫瘤細胞侵及脈管，降低腫瘤血道及淋巴道的轉移[7]，可見Girdin在腫瘤的淋巴及遠處轉移方面起到了一個正向推動作用;腫瘤的增殖需要持續(xù)的營養(yǎng)輸送，那么這就需要大量的新生血管運送養(yǎng)料，Lan 等[8]發(fā)現(xiàn)Girdin蛋白及其磷酸化產物能夠抑制血管內皮細胞衰老及促進新生血管的形成，對于這一發(fā)現(xiàn)，讓我們更加深入的了解了Girdin對腫瘤細胞增殖的促進作用。我們實驗發(fā)現(xiàn)Girdin蛋白高表達區(qū)域，MVD 密度增加，MPI 值降低，即Girdin蛋白與胃癌背景中的不成熟的血管的數(shù)量呈正相關，而這種不成熟血管的形成既利于腫瘤細胞的增殖，又利于腫瘤的侵襲與轉移。隨著胃癌分化程度的降低，侵襲能力的增加，Girdin蛋白表達率卻隨之增高，這可能與Girdin蛋白特殊的分子結構有關，其與胃癌細胞的某些結構發(fā)生相互作用，影響胃癌的分化，并通過改變胃癌細胞的結構域，影響其侵襲能力。眾所周知，細胞的運動離不開細胞內的微管系統(tǒng)，腫瘤細胞所進行的阿米巴運動，與腫瘤細胞內微管系統(tǒng)蛋白的表達密切相關，通過實驗建立3D 微膠原軌道模型，Girdin的敲低導致3D 膠原微軌跡遷移過程中的細胞速度降低。Girdin的缺失也會導致細胞形態(tài)和細胞方向的改變。此外，Girdin消耗會損害肌動蛋白組織和應力纖維形成，這可以通過上調 GTPase RhoA來恢復。RhoA的激活誘導肌動蛋白應力纖維形成，在沒有Girdin的情況下恢復3D 膠原微軌道中拉長的遷移細胞形狀和部分細胞遷移，以此證實腫瘤內Girdin蛋白通過自身的結構域直接與細胞極性蛋白 Par-3（Partitioning defective-3）相互作用參與細胞的極化，從而促進腫瘤細胞的遷移[9]。目前研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的遷移不僅僅是單個細胞的行為，而是以群體的形勢侵襲周圍基質，并且與周圍基質相互作用產生適合腫瘤細胞生存的微環(huán)境，在器官類型培養(yǎng)模型中，Girdin對于皮膚癌細胞系 A431在膠原凝膠上的集體遷移以及基質成纖維細胞領導的集體入侵是必不可少的[10]。腫瘤的增殖及遷移是個連續(xù)、復雜的過程，腫瘤通過增生及侵襲兩方面實現(xiàn)對機體的破壞，腫瘤細胞的不斷增生是腫瘤細胞浸潤的前提。腫瘤細胞通過促進血管的增生提供自身所需的營養(yǎng)，通過不成熟的血管形成及自身增生導致腫瘤組織內部壓力增高，趨向于向周圍基質浸潤及遠處轉移的發(fā)生，而在此過程中，Girdin對前緣肌動蛋白的重塑起至關重要的作用，磷酸化的Girdin在遷移細胞的前沿增多，而細胞內的絲氨酸被丙氨酸所取代，從而使細胞拉長變形，形成偽足，表現(xiàn)出遷移能力的增加[11]。為了證實Girdin在前沿肌動蛋白重塑中很重要，通過將 siRNA 引入細胞來抑制內源性Girdin表達。Girdin蛋白水平被Girdin siRNA 的轉染有效抑制，Girdin siRNA 的轉染導致具有粗糙皮質肌動蛋白絲的細胞數(shù)量增加，這表明Girdin可能對重塑外周肌動蛋白絲或細胞外基質粘連起關鍵作用。此外，當用 IGF-I 刺激細胞時，在Girdin siRNA 轉染的細胞中，前緣片狀偽足的廣泛延伸顯著減弱，進一步表明Girdin在遷移細胞外周片狀偽足中對肌動蛋白動力學的作用。Chen C[12]在紫外線誘導的 DNA 損傷作為放射治療的模型中，發(fā)現(xiàn)Girdin增加癌細胞對 UVC 介導的 DNA 損傷的敏感性，推測Girdin有可能干預腫瘤細胞周期，據(jù)報道，Girdin的消耗導致 DNA 合成減少，進而導致細胞凋亡增加[13]?，F(xiàn)陸續(xù)證實Girdin在胰腺癌[14]、結腸癌[15]、乳腺癌[16]、腎母細胞瘤[17]等腫瘤當中所起的作用，我們實驗也印證了Girdin促進胃癌血管生成、癌細胞的侵襲及轉移。相信，通過后續(xù)的實驗研究，Girdin有可能成為胃癌治療新靶點。

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