楊璐?李云軒?宋婉紅?王文倩?黃云龍

摘要：目的 以腸道定植碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細(xì)菌（carbapenem resistance Enterobacteriaceae， CRE）與同一患者后期感染細(xì)菌的關(guān)系為出發(fā)點，同源性檢測和耐藥基因篩查為中心，從重癥醫(yī)學(xué)科（intensive care unit， ICU）患者腸道CRE的定植情況、CRE腸道定植與后期感染的關(guān)系層次上，進(jìn)行CRE防治的應(yīng)用基礎(chǔ)研究，從而為臨床及時有效的抗感染治療提供一定指導(dǎo)。方法 收集2018—2019年來自ICU病房及由其他科室轉(zhuǎn)入ICU的共11位患者的臨床資料，分別分離同一患者腸道定植CRE菌株和后期其他感染部位的菌株，對所有菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗和耐藥基因攜帶情況檢測，采用多位點序列分析（MLST）、脈沖場凝膠電泳（PAGE）試驗的方法對定植CRE菌株和后期其他感染部位的菌株進(jìn)行同源性分析。結(jié)果 95位ICU患者中有19位患者腸道CRE篩查陽性，定植率為20.00%。其中發(fā)生后期其他部位感染的患者11位，目標(biāo)菌株耐碳青霉烯酶基因檢測結(jié)果顯示22株菌株中有21株檢出耐藥基因，占95.45%（21/22）。其中19株檢出KPC-2耐藥基因，陽性率為86.36%（19/22）；2株檢出NDM-1耐藥基因，陽性率為9.09%（2/22）。其他碳青霉烯酶基因檢測均為陰性。22株目標(biāo)菌的MLST分型共分為3個型，主要為ST11型，11位患者中除了1位患者的后期感染菌株與定植菌株差異明顯外，其余患者的腸道定植菌株與后期感染菌株均為相同的ST型；PAGE檢出22株菌的分型可分為A群和B群，共7個型別，其中7位患者的腸道定植菌株與后期感染菌株之間條帶位置與數(shù)目相同，視為同一克隆型，3位患者的腸道定植菌株與后期感染菌株條帶有2～3個差異，同源性極高，視為高度相關(guān)菌株；1位患者的腸道定植菌株與后期感染菌株的條帶異超過7條，視為不相關(guān)菌株。結(jié)論 ICU患者定植率高，應(yīng)加強入院CRE定植篩查；ICU患者部位檢出的定植及感染CRE菌株MIC值高，為高耐藥性菌株；ICU患者發(fā)生CRE感染的菌株與自身定植的菌株有極高的同源性。

關(guān)鍵詞：耐碳青霉烯類腸桿菌科；同源性分析；脈沖場凝膠電泳；多位點序列分析

中圖分類號：R978.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

The relationship between carbapenem-resistant Enterobacteriaceae （CRE） colonized in intestinal tract and pathogenic bacteria of infection

Yang Lu， Li Yun-xuan， Song Wan-hong， Wang Wen-qian， and Huang Yun-long

（The Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Kunming 650000）

Abstract Objective Starting from the relationship between intestinal colonized carbapenem-resistant Enterobacteriaceae （CRE） and later infected bacteria in the same patient， our study focused on homology detection and drug resistant gene screening. From the level of intestinal CRE colonization in Intensive Care Unit （ICU） patients and the relationship between intestinal CRE colonization and late infection， basic applied research on the prevention and treatment of CRE was carried out， so as to provide certain guidance for timely and effective clinical anti-infection treatment. Methods A total of 11 patients in ICU between 2018 and 2019 were retrospectively included. CRE colonized in intestinal tracts of ICU patients and bacterial strains in other sites of later infections were isolated to test the homology， drug sensitivity， and drug-resistant genes using multi locus sequence analysis （MLST） and pulsed field gel electrophoresis （PAGE）. Results Positive intestinal CRE was identified in 19/95 （20.00%） ICU patients. Among 19 patients， 11 had later infections of other sites. A total of 22 strains were isolated from the 19 patients. Carbapenem-resistant genes were detected in 21/22（95.45%） strains， including KPC-2-resistant gene detected in 19/22（86.36%） strains and NDM-1 resistant gene detected in 2/22（9.09%） strains. Other carbapenem-resistant genes were negative. According to the MLST typing， 22 target strains were divided into three types， and they mainly belonged to the ST11 type. Among the 11 patients， the intestinal colonization and colonization strains all belonged to the same ST type， except for one patient where obvious difference between the late infection strains and colonization strains was found. According to the PAGE results， 22 strains could be divided into group A and B. There were seven types in group A and group B. Among them， seven strains of colonization in intestinal tracts and late infections in ICU patients with the same number of stripe locations were viewed as the same cloning. Three strains of colonization in intestinal tracts of ICU patients with late infections with two or three different stripe locations， showing an extremely high homology， were treated as highly related strains. The intestinal colonization strains of one patient， which differed from the late infection strains by more than 7 bands， were irrelevant strains. Conclusion The colonization rate of ICU patients is high， and the screening of CRE in admission should be highlighted. The MIC values of colonized and infected CRE strains detected in ICU patients are high， indicating high risk of drug resistance. The strains of CRE infection in ICU patients are highly homologous to the self-colonized strains.

Key words Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae; Homology analysis; Pulsed field gel electrophoresis; Multilocus sequence typing

腸桿菌科細(xì)菌是院內(nèi)感染的常見菌，碳青霉烯類抗菌藥物是目前針對革蘭陰性桿菌感染治療最強效的抗生素。耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌（carbepenem-resistant Enterobacteriaceae， CRE）尤其是克雷伯菌屬的耐藥率從2009年低于5%升至2017年大于20%[1-4]，常引起下呼吸道、泌尿道、血流感染[5]。因CRE的高致死率以及其給臨床用藥帶來的挑戰(zhàn)，其院內(nèi)預(yù)防與控制越來越受到關(guān)注[6]。在美國疾病預(yù)防控制中心于2015年更新發(fā)布的CRE預(yù)防與控制指南中，建議對CRE感染的高風(fēng)險人群進(jìn)行主動篩查[7]。但我國尚缺乏對主動篩查的必要性和效果觀察。為了解臨床耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌的耐藥情況及腸道定植菌與腸道外感染菌株的同源性，此次試驗中采用多位點序列分析（MLST）、脈沖場凝膠電泳（PAGE）試驗探索同一病人腸道定植CRE菌株與后期腸道外感染部位菌株的同源性，以證實兩者關(guān)系，幫助臨床實現(xiàn)對CRE的預(yù)防和控制，減少CRE引起的院內(nèi)感染。

1 材料和方法

1.1 試驗菌株收集

菌株納入標(biāo)準(zhǔn)：患者入院前未檢出CRE感染，轉(zhuǎn)入ICU后48h內(nèi)采集大便或直腸拭子標(biāo)本。標(biāo)本培養(yǎng)后挑取其中腸桿菌科細(xì)菌，檢測其藥敏濃度，根據(jù)抗微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)（CLSI M100 29th），若亞胺培南、美羅培南的最低抑菌濃度（MIC）≥4 mg/L，或厄他培南MIC≥2 mg/L則判定為腸道定植CRE菌株。觀察這些CRE篩選陽性患者，收集其后期感染部位菌株。腸道定植CRE以“KB”字母開頭編號，后期感染部位檢出的菌株編以相同的數(shù)字編碼，僅字母不同以示樣本來源區(qū)別（B：大便；T：痰；X：血液；Y：引流液；N：尿液）。

1.2 儀器和試劑

法國梅里埃VITEK 2全自動微生物分析儀；K30干式恒溫器，XO-1旋渦振蕩器，TGL-16B高速離心機，ABI 9700PCR擴增儀。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（購自BioFlux）；2×T5 Super PCR Mix試劑（購自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司）；引物合成和目的基因擴增及測序送由昆明擎科生物科技有限公司完成。

1.2.1 PCR擴增管家基因

運用煮沸法提取菌株DNA模板，PCR擴增以下管家基因：gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB。引物序列來源于https：//bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/primers_used.html。PCR反應(yīng)體系為50? μL：金牌Mix45 μL，DNA1 μL，上下游引物各2 μL；反應(yīng)條件為：98°C預(yù)變性2 min，98°C變性20 s，退火10 s，72°C，上下游引物各2 μL；98℃預(yù)變性2 min，98℃變性20 s，退火10 s，72℃ 5 min，共40個循環(huán)。

1.2.2 PCR擴增耐藥基因

運用煮沸法提取菌株DNA模板，PCR擴增以下耐藥基因：blaKPC、blaIMP、blaIMI、blaGIM、blaVIM、blaSME、blaOXA-48、blaGES、blaNDM和blaSPM。引物序列參照相關(guān)文獻(xiàn)[29-31]。PCR擴增體系：2×T5 Super PCR Mix 25 μL，上下游引物各1，DNA模板2A，加無菌雙蒸水至50。98℃預(yù)變性70 s， 98℃變性10 s，退火10 s，72℃ 2 min，共35個循環(huán)。

1.3 多位點序列分析（multilocus sequence typing， MLST）

對管家基因完成測序后，將結(jié)果在線提交到MLST分析網(wǎng)站，查詢相應(yīng)等位基因號，所有管家基因編號組合（gapA-infB-mdh-pgi-phoE-rpoB-tonB）后查詢出菌株的序列型（sequence type，ST）[3]。

1.4 脈沖場凝膠電泳（plused field gel electrophoresis， PFGE）實驗

使用含蛋白酶K的細(xì)胞裂解液（CLB）對實驗菌株進(jìn)行消化后用內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，將經(jīng)孵育的膠塊在電泳儀中進(jìn)行脈沖場電泳后使用核酸染料染色。在讀膠儀中成像并識別圖像條帶，經(jīng)統(tǒng)一的分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行聚類，構(gòu)建聚類樹。

2 結(jié)果

2.1 ICU住院患者腸道CRE菌株定植率

收集2018年1月—2019年1月就診于昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院ICU，符合入選標(biāo)準(zhǔn)的患者共95位，在其入院48 h內(nèi)采集大便或直腸拭子標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)，檢出腸桿菌科細(xì)菌進(jìn)行藥敏實驗，收集其中腸道定植有CRE的菌株19株。ICU住院患者腸道CRE菌株定植率為20.00%。

2.2 ICU住院期間發(fā)生CRE感染患者腸道定植菌株與后期感染菌株的耐藥情況

2.2.1 ICU住院期間發(fā)生CRE感染患者腸道定植菌株與后期感染菌株的藥敏試驗結(jié)果

收集的19株腸道定植CRE菌株對頭孢唑啉耐藥率均為100.00％，對哌拉西林、阿莫西林/克拉維酸等及氨曲南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和呋喃妥因也存在較高耐藥率（≥89.47%）；對阿米卡星、慶大霉素以及四環(huán)素的耐藥率相對較低（分別為78.95%、78.95%、63.16%）。如表1所示。

觀察收集的19株腸道定植菌株患者信息，其中后期發(fā)生其他部位感染者11位，留取這11位患者后期感染部位分離的菌株。篩選出的11株后期其他部位感染的腸桿菌科細(xì)菌，對碳青霉烯類抗菌藥的耐藥率為90.90%，其中KT0007號尿液標(biāo)本的厄他培南MIC值為≤0.5 μg/ml，亞胺培南和美洛培南的MIC值分別為≤1 μg/ml、≤0.25 μg/ml；對β-內(nèi)酰胺類藥物如阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林、等及氨曲南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和呋喃妥因耐藥率均為90.90%，對阿米卡星和慶大霉素的耐藥率相對較低，均為81.82%；四環(huán)素和復(fù)方磺胺甲惡唑敏感度相比于其他抗生素更高，分為45.45%和72.73%。如表2所示：

2.2.2 ICU住院期間發(fā)生CRE感染患者腸道定植菌株與后期感染菌株的耐藥基因檢測

經(jīng)檢測碳青霉烯酶基因結(jié)果顯示，11株腸道定植菌和對應(yīng)的腸道外感染菌共22株菌均為肺炎克雷伯菌，其中有21株檢出耐藥基因，占95.45%（21/22）。其中有19株檢出KPC-2耐藥基因，陽性率為86.36%（19/22）；2株檢出NDM-1耐藥基因，陽性率為9.09%（2/22）。22株目標(biāo)菌中blaGES、blaIMI、blaSME、blaVIM、blaIMP、blaGIM、blaSPM和blaOXA-48碳青霉烯酶基因檢測均為陰性，見表3。

2.3 同源性檢測

2.3.1 住院期間發(fā)生CRE感染患者腸道定植菌株與后期感染菌株MLST結(jié)果

22株住院期間發(fā)生CRE感染患者腸道定植菌株及后期感染菌株經(jīng)16S rDNA鑒定分析結(jié)果均為肺炎克雷伯菌。對22株目標(biāo)菌的7個管家基因（管家基因查詢來源https：//bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/primers_used.html）分別進(jìn)行測序后，結(jié)果提交至MLST網(wǎng)站，結(jié)果顯示，86.36%的菌株為ST11型（19/22），9.10%的菌株為ST101型（2/22），4.55%為ST2995型（1/22），這與我國流行菌株型別相符合，除KT0007分型為2995型，與KB0007號菌株差異較明顯，其余患者腸道定植的CRE菌株與后期感染部位檢出的CRE菌株都是相同的ST型，同源性較高。11位患者定植與后期感染部位的菌株MLST查詢結(jié)果如表4。

2.3.2 住院期間發(fā)生CRE感染患者腸道定植菌株與后期感染菌株P(guān)AGE試驗結(jié)果

PFGE圖像導(dǎo)入BioNumerics（Version7.1，Applied maths， Inc.）軟件包進(jìn)行處理，識別圖像條帶，經(jīng)統(tǒng)一的分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校準(zhǔn)，標(biāo)定條帶位置，必要時進(jìn)行手工校正，＜20.5 kb的條帶忽略不計。每兩個圖像之間的相似性系數(shù)用Dice系數(shù)（Dice coefficients，SD）表示，SD=2nxy/（nx+ny），其中nx是菌株x的總條帶數(shù)，ny是菌株y的總條帶數(shù)，nxy是菌株x和菌株y共有的條帶數(shù)。SD值反映不同菌株P(guān)FGE圖像之間的相似性程度，范圍在0～1之間，0代表完全不一樣，1代表完全相同。出現(xiàn)不同條帶即判定為不同的型別，對每一個型別都進(jìn)行命名。根據(jù)每兩個圖像之間的相似性系數(shù)，用非加權(quán)配對算術(shù)平均法進(jìn)行聚類，構(gòu)建聚類樹。

22株目標(biāo)菌的DNA圖像經(jīng)BioNumerics軟件處理后做出聚類分析圖如圖1所示，22株菌可分為2個群（A和B群），A群分為A1、A2型，B群分為B1、B2、B3、B4、B5型，A1、B1、B3、B5型分別有密不可分的帶型，11例患者中有7例來源于消化道定植的CRE菌株（KB0094、KB0092、KB0073、KB0081、KB0032、KB0030和KB0082）與后期分離的菌株（KN0094、KY0092、KY0073、KT0081、KY0032、KX0030、KT0082）分別為同一克隆菌株；74號患者消化道定植的CRE菌株（KB0074）電泳條帶為B2型，其后期引流液中檢出的菌株（KY0074）為B3型，差異在4個條帶，同源性極高，視為高度相關(guān)菌株；56號及77號患者消化道定植的CRE菌株（KB0056和KB0077）與后期感染部位檢出的菌株 （KY0056和KN0077）電泳條帶為B4型，差異在2～3個條帶，同源性極高，視為高度相關(guān)菌株；7號患者來源于消化定植的CRE菌株（KB0007）電泳條帶為A2型，后期痰液中檢出的菌株（KT0007）電泳條帶為B4型，兩者條帶差異超過七條，同源性差異較為明顯，視為不相關(guān)菌株。

3 討論

由于臨床治療中對碳青霉烯類抗生素的不合理應(yīng)用，CRE的檢出率逐年提高，耐藥菌的種類也趨于多樣性[9]，本研究收集的腸道定植菌株及后期感染菌株全部被鑒定為肺炎克雷伯菌，與相關(guān)報道一致[10]。

CRE最常見的耐藥機制是產(chǎn)碳青霉烯酶[11]。本次研究對腸道定植菌株與后期感染菌株的耐藥基因進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)22株肺炎克雷伯菌中有21株檢出耐藥基因，占95.45%（21/22）。其中以KPC-2耐藥基因檢出為主。目前發(fā)現(xiàn)的碳青霉烯酶包括Ambler A、B、D。Ambler A類為KPC型，KPC是我國肺炎克雷伯菌株產(chǎn)生臨床耐藥的最主要原因，其具有質(zhì)粒介導(dǎo)的絲氨酸活性，能水解多種β-內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)，因同時常與其他耐藥基因同時出現(xiàn)，因此對其他非β-內(nèi)酰胺類藥物也具有耐藥性[12-13]。Ambler B類又稱金屬酶，依靠鋅離子水解β-內(nèi)酰胺類抗菌藥，常見GIM、IND、IMP、VIM和NDM型[14]。在本研究中發(fā)現(xiàn)兩株菌株帶有NDM-1耐藥基因，NDM-1型酶屬于B類金屬金屬β-內(nèi)酰胺酶，于2009年首先在印度新德里檢出[27]。因其能夠水解臨床上使用的大多數(shù)抗生素，表現(xiàn)出超強的耐藥性，因此應(yīng)該高度重視產(chǎn)NDM-1細(xì)菌的監(jiān)測，進(jìn)而做好院內(nèi)感染控制的有效措施，避免NDM-1基因的傳播。

本次研究發(fā)現(xiàn)本院重癥醫(yī)學(xué)科患者中的CRE定植率為20.00%。陳美戀等[10]在2017年對北大人民醫(yī)院ICU調(diào)查顯示CRE定植率為10.9%。美國芝加哥各綜合醫(yī)院住院患者CRE平均定植率為30%，不同醫(yī)院CRE定植率處于10%～60%[28]。對22株目標(biāo)菌進(jìn)行MLST分型發(fā)現(xiàn)本次收集菌株多為ST11型，占比86.36%（19/22）。據(jù)相關(guān)報道顯示，亞洲地區(qū)尤其是中國，ST11型為主要流行株[21]。CRE的易感人群主要為長期住院患者，而ICU是CRE感染發(fā)生的高風(fēng)險科室，ICU患者住院時間長，多有免疫力下降或菌群失調(diào)，接觸到醫(yī)院內(nèi)病原體的機會越多。醫(yī)務(wù)人員手衛(wèi)生狀況、醫(yī)院環(huán)境清潔與消毒情況和侵入性操作時的無菌操作不當(dāng)均容易引起CRE的定植轉(zhuǎn)移從而導(dǎo)致其他部位的感染。

由CRE感染引發(fā)的病死率可高達(dá)25.20%[25]，不同菌屬的CRE菌株對常用抗生素耐藥率也居高不下，致使CRE實行有效治療較為棘手，因此，控制耐藥菌株的感染及播散成為臨床亟待解決的公共健康問題。目前主要通過流行病學(xué)的監(jiān)測達(dá)到遏制細(xì)菌的目的，本實驗通過多位點序列分析、脈沖場凝膠電泳分析進(jìn)行耐藥菌株基因序列分型，了解CRE感染的菌株來源，進(jìn)一步為臨床提供依據(jù)采取有效措施控制耐藥菌株的自身感染。臨床上患者發(fā)生CRE的感染并非單一因素所致，也可能是多重因素疊加的結(jié)果，與年齡、入住科室、患者免疫能力等息息相關(guān)，需在臨床醫(yī)院感染控制中對多因素進(jìn)行管理。

參 考 文 獻(xiàn)

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收稿日期：2021-04-06

基金項目：昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院院內(nèi)科技計劃項目（No. 2018yk015）

作者簡介：楊璐，女，生于1988年，主管技師，研究方向為臨床微生物學(xué)，E-mail： ylcoolly@hotmail.com

*通訊作者，? E-mail： carlgout@163.com.