李琳?劉菊?王愛利?肖方喜?戴朝博?李秀娟

摘要：目的 觀察人源抗菌肽LL-37對慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠輔助性T細胞17（Th17）/調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）平衡、炎癥反應的影響，并探討可能機制。方法 40只Wistar大鼠隨機分為正常組、COPD組、LL-37組、LL-37聯(lián)合DAPT（Notch1/Jagged1信號通路抑制劑）組。正常組室溫下正常喂養(yǎng)，COPD組、LL-37組、LL-37聯(lián)合DAPT組采用煙熏法建立COPD模型。LL-37組大鼠經(jīng)鼻滴入LL-37（10 μg） 50 μL，LL-37聯(lián)合DAPT組大鼠經(jīng)鼻滴入總體積50 μL的LL-37（10 μg）+DAPT（10 μg）。正常組、COPD組大鼠分別經(jīng)鼻滴入等體積的生理鹽水。檢測外周血Th17、Treg細胞占比；檢測肺泡灌洗液（BALF）中白介素-8（IL-8）、白三烯B4（LTB4）含量；HE染色檢測氣道重塑指標；Western Blot法檢測肺組織Notch1、Jagged1、發(fā)狀分裂相關增強子1（Hes1）蛋白表達量。結果 與COPD組比較，LL-37組外周血Th17占比和Th17/Treg、BALF中IL-8、LTB4含量、管壁厚度/外徑（MT%）及管壁面積/氣管總面積（MA%）均降低，Treg占比升高（P＜0.05）；與LL-37組比較，LL-37聯(lián)合DAPT組外周血Th17占比和Th17/Treg、BALF中IL-8、LTB4含量、MT%及MA%均升高，Treg占比降低（P＜0.05）。與COPD組比較，LL-37組Notch1、Jagged1、Hes1蛋白表達量升高（P＜0.05）；與LL-37組比較，LL-37聯(lián)合DAPT組Notch1、Jagged1、Hes1蛋白表達量降低（P＜0.05）。結論 人源抗菌肽LL-37可調(diào)節(jié)COPD大鼠外周血Th17/Treg失衡，抑制炎癥反應及氣道重塑，激活Notch1/Jagged1信號通路可能是其發(fā)揮治療作用的機制之一。

關鍵詞：慢性阻塞性肺疾?。蝗嗽纯咕腖L-37；輔助性T細胞17；調(diào)節(jié)性T細胞

中圖分類號：R563文獻標志碼：A

Effect of human antimicrobial peptide LL-37 on Th17/Treg balance and inflammatory reaction in COPD rats

Li Lin， Liu Ju， Wang Ai-li， Xiao Fang-xi， Dai Chao-bo， and Li Xiu-juan

（Wuhan No.1 Hospital， Wuhan 430022）

Abstract Objective To observe the effect of human antimicrobial peptide LL-37 on the balance of T helper 17 （Th17）/regulatory T cells （Treg） and inflammatory response in chronic obstructive pulmonary disease （COPD） rats， and to explore the possible mechanism. Methods Forty Wistar rats were randomly divided into normal group， the COPD group， the LL-37 group， and the LL-37 combined with DAPT （Notch1/Jagged1 signaling pathway inhibitor） group. The normal group was fed normally at room temperature， and the COPD group， the LL-37 group， and the LL-37 combined with DAPT group were treated using the smoking method to establish the COPD model. Rats in the LL-37 group were injected with 50 μL of LL-37 （10 μg） by nasal instillation， while rats in the LL-37 combined with DAPT group were injected with 50 μL of LL-37 （10 μg） + DAPT （10 μg） by nasal instillation. Rats in the normal group and the COPD group were instilled with an equal volume of normal saline through the nose. The proportion of Th17 and Treg cells in peripheral blood was detected; the contents of interleukin-8 （IL-8） and leukotriene B4 （LTB4） in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） were detected; HE staining was used to detect airway remodeling indexes. Western blot was used to detect expressions of Notch1， Jagged1， and hairy division-related enhancer 1 （Hes1） proteins in lung tissue. Results Compared with the COPD group， the proportion of Th17 in peripheral blood， Th17/Treg， IL-8， LTB4 content in BALF， wall thickness/outer diameter （MT%）， and wall area/trachea total area （MA%） in the LL-37 group both decreased， and the proportion of Treg increased （P<0.05）. Compared with the LL-37 group， peripheral blood Th17 proportion， Th17/Treg， IL-8， LTB4 content in BALF， MT%， and MA% increased in the LL-37 combined with DAPT group， and the proportion of Treg decreased （P<0.05）. Compared with the COPD group， the protein expressions of Notch1， Jagged1， and Hes1 in the LL-37 group increased （P<0.05）; compared with the LL-37 group， the protein expressions of Notch1， Jagged1， and Hes1 in the LL-37 combined with DAPT group decreased （P<0.05）. Conclusion Human antimicrobial peptide LL-37 can regulate the imbalance of Th17/Treg in peripheral blood of COPD rats. Inhibition of the inflammatory response and airway remodeling and activation of the Notch1/Jagged1 signaling pathway may be one of the mechanisms for its therapeutic effect.

Key words Chronic obstructive pulmonary disease; Human antimicrobial peptide LL-37; Helper T cell 17; Regulatory T cell

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種以持續(xù)性、不完全可逆氣流受限為主要特征的肺部炎癥性疾病，在全球死因中位居第四，且發(fā)病率呈上升趨勢[1]。克拉霉素、羅紅霉素、阿奇霉素等大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是治療COPD的常用抗生素，可抑制細菌定植于氣道，阻滯病情發(fā)展，但不良反應較多，且易產(chǎn)生耐藥性[2]。LL-37是cathelicidin肽Hcap-18的C末端切割產(chǎn)物，是一種由機體免疫防御體系生成的抗菌肽，能直接殺死細菌、真菌和病毒。LL-37還可以通過趨化免疫細胞、調(diào)節(jié)炎性促進因子/抑制因子的分泌、協(xié)調(diào)天然免疫和獲得性免疫等功能，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。LL-37可作用于血管內(nèi)皮細胞和上皮細胞，刺激血管生成和促進損傷修復。LL-37具有廣譜抗菌、減輕炎癥反應的作用，且不易導致耐藥性，可能成為有潛力的新型抗菌藥物[3]。有國外學者將LL-37應用于大鼠膿毒癥模型的治療，結果顯示其可通過抑制巨噬細胞調(diào)亡、刺激中性粒細胞釋放抗菌微泡來改善膿毒癥病情、提高大鼠存活率，表明其具有抗菌和抑炎作用[4]。然而，目前對人源LL-37治療COPD的體內(nèi)研究尚少。鑒于此，本研究通過建立COPD大鼠模型，并采用人源LL-37干預，觀察其對該疾病模型的治療效果，以期為臨床應用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級Wistar大鼠40只，雄性，6周齡，體質(zhì)量（190±20） g，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0010。

1.2 藥物、主要試劑、儀器

人源抗菌肽LL-37（規(guī)格5 mg，批號53017ES08）購自翌圣生物科技股份有限公司；Notch1/Jagged1信號通路抑制劑DAPT（規(guī)格10 mg，批ab120633），購自美國Abcam公司；白介素-8（Interleukin8，IL-80）酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（規(guī)格96T，批號LB3051B）、白三烯B4（leukotriene B4，LTB4）ELISA試劑盒（規(guī)格96T， 批號LB3107B），購自武漢力博瑞生物科技有限公司；HE染色試劑盒（規(guī)格3×10 mL，批號G1120-10），購自北京Solarbio科技有限公司；兔抗鼠一抗CD4＋（規(guī)格50 mL，批號bs-0647R）、白介素-17（interleukin-17，IL-17）（規(guī)格50 mL，批號bs1183R），購自北京博奧森生物技術有限公司；叉狀頭/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子（forkhead/winged helix transcription factor，F(xiàn)oxp3）（規(guī)格10 mL，批號ab215206）、Notch1（規(guī)格10 mL，批號ab52627）、Jagged1（規(guī)格10 mL，批號ab109536）、發(fā)狀分裂相關增強子1（hairy and enhancer of split 1，Hes1）（規(guī)格10 mL ，批號ab108937）、GADPH（規(guī)格10 mL，批號ab181602），購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗IgG（H+L）（規(guī)格1 mL，批號A0208），購自上海碧云天生物技術有限公司。

大鼠煙熏箱（上海玉研科學儀器有限公司）；Accuri C6流式細胞儀（美國BD公司）；酶標GENios Pro儀（瑞士Tecan公司）。

1.3 構建COPD模型[5-6]

40只Wistar大鼠隨機分為正常組、COPD組、LL-37組、LL-37聯(lián)合DAPT組，每組各10只。經(jīng)煙熏法建模，將大鼠置入煙熏箱，每次放進10只點燃的香煙，持續(xù)煙熏30 min，3 次/d，連續(xù)90 d。正常組室溫下正常喂養(yǎng)。以實驗結束后HE染色結果出現(xiàn)COPD病理變化為建模成功標準。

1.4 干預方式

煙熏完成后次日，LL-37組大鼠經(jīng)鼻滴入LL-37（10 μg） 溶解液50 μL，LL-37聯(lián)合DAPT組大鼠經(jīng)鼻滴入總體積50 μL的LL-37（10 μg）+DAPT（10 μg），正常組、COPD組大鼠經(jīng)鼻滴入50 μL生理鹽水，1次/d，干預2周。

1.5 組織取材

末次干預后4 h頸椎脫臼處死大鼠，開胸，手術線結扎、固定右肺；左肺經(jīng)37℃生理鹽水2 mL灌洗左肺3次，回收后（回收率＞80%）離心收集肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）上清，冷凍保存?zhèn)溆?；取右肺上葉，PBS沖洗干凈，留取右肺門組織塊（1 mm3），固定于4%多聚甲醛中24 h，順垂直支氣管走向最大橫徑位置切取厚度4 mm的組織，酒精梯度脫水、透明和包埋，切片機切片。其余右肺組織冷凍保存，用于Western blot檢測蛋白。

1.6 檢測外周血輔助性T細胞17（T helper cell 17，Th17）、調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cell，Treg）占比

末次給藥后，給予戊巴比妥鈉麻醉，采集腹主動脈血5 mL置于抗凝管，分離淋巴細胞，取96孔板，加入細胞懸液100 μL/孔，加入刺激劑0.5 μL/孔，培養(yǎng)60 min，阻斷劑0.5 μL阻斷，5% CO2、37℃、飽和濕度下孵育12 h；將細胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，加入CD4抗體0.5 μL，常溫遮光孵育20 min，洗滌后，加入PBS重懸，加入固定破膜工作液，振蕩5 s混合均勻，4℃遮光孵育40 min，加入破膜緩沖工作液2 mL，離心后洗滌細胞，棄上清，加入PBS重懸，分別在測定管中加入IL-17抗體0.7 μL、Foxp3抗體5 μL，將等量、同型對照抗體加入對照管中，4℃遮光孵育40 min，洗滌后棄上清，加入4%多聚甲醛重懸，4℃遮光保存，24 h內(nèi)使用流式細胞儀檢測Th17、Treg細胞占比。

1.7 檢測BALF中IL-8、LTB4含量

取冷凍保存BALF，采用ELISA法檢測IL-8、LTB4含量，嚴格按照試劑盒說明書設計實驗操作步驟，經(jīng)酶標儀檢測570 nm波長位置吸光度值，根據(jù)標準曲線計算IL-8、LTB4含量。

1.8 HE染色檢測氣道重塑指標、觀察肺組織病理學改變

取肺組織切片，常規(guī)脫蠟、HE染色，中性樹膠封片。每張切片隨機選取5個不相鄰視野，數(shù)碼相機拍照，測量直徑750～1100 μm，長徑/短徑≥0.7 μm的膜性細支氣管管壁厚度、外徑、面積，氣管總面積，計算管壁厚度/外徑（MT%），管壁面積/氣管總面積（MA%）；光學顯微鏡下觀察肺組織病理學改變。

1.9 Western blot法檢測肺組織Notch1、Jagged1、Hes1蛋白表達量

取40 μg待測樣本按比例混合上樣緩沖液，電泳分離，濕轉(zhuǎn)至膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入兔抗大鼠Notch1、Jagged1、Hes1一抗孵育過夜，加入二抗室溫孵育2 h后，暗室曝光，計算目的蛋白/內(nèi)參GAPDH條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計學分析

采用IBM SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，以單因素方差分析檢驗，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05表明差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 外周血Th17/Treg平衡

與正常組比較，COPD組外周血Th17占比、Th17/Treg升高，Treg占比降低（P＜0.05）；與COPD組比較，LL-37組外周血Th17占比、Th17/Treg降低，Treg占比升高（P＜0.05）；與LL-37組比較，LL-37聯(lián)合DAPT組外周血Th17占比、Th17/Treg升高，Treg占比降低（P＜0.05）。見表1。

2.2 BALF中IL-8、LTB4含量比較

與正常組比較，COPD組BALF中IL-8、LTB4含量升高（P＜0.05）；與COPD組比較，LL-37組BALF中IL-8、LTB4含量降低（P＜0.05）；與LL-37組比較，LL-37聯(lián)合DAPT組BALF中IL-8、LTB4含量升高（P＜0.05）。見表2。

2.3 MT%和MA%比較

與正常組比較，COPD組MT%、MA%升高（P＜0.05）；與COPD組比較，LL-37組MT%、MA%降低（P＜0.05）；與LL-37組比較，LL-37聯(lián)合DAPT組MT%、MA%升高（P＜0.05），見表3。

2.4 肺組織病理學改變

正常組肺組織形態(tài)正常，無支氣管黏膜上皮變形或脫落，未觀察到腺體增生、炎性細胞聚集；模型組支氣管黏膜上皮細胞大量脫落、增生（黑色箭頭），大量炎性細胞浸潤（藍色箭頭），血管壁增厚（紅色箭頭），肺泡間隔增加，氣腔壁厚度明顯增加，部分肺泡發(fā)生融合、擴張；LL-37組有少量支氣管上皮細胞脫落（黑色箭頭），血管周圍聚集有少量炎性細胞，相較于模型組肺泡間隔及氣腔壁厚度減少，病理學變化有所減輕；LL-37聯(lián)合DAPT組支氣管黏膜上皮細胞脫落、增生（黑色箭頭），有炎性細胞浸潤（藍色箭頭），血管壁增厚（紅色箭頭），相較于模型組病理學變化有所減輕，相較于LL-37組有所加重。見圖1。

2.5 肺組織Notch1、Jagged1、Hes1蛋白表達量

與正常組比較，COPD組肺組織Notch1、Jagged1、Hes1蛋白表達量降低（P＜0.05）；與COPD組比較，LL-37組Notch1、Jagged1、Hes1蛋白表達量升高（P＜0.05）；與LL-37組比較，LL-37聯(lián)合DAPT組Notch1、Jagged1、Hes1蛋白表達量降低（P＜0.05）。見表4和圖2。

3 討論

目前關于COPD的發(fā)病機制眾說紛紜，多認為與氧化應激、固有免疫、炎癥介質(zhì)、彈力蛋白酶/抗彈力蛋白酶失衡等有關[7]。Th17細胞主要通過釋放炎性因子IL-17介導免疫應答，通過募集、活化中性粒細胞增高氣道反應性，改變肺組織彈性。Treg細胞可抑制抗原提呈細胞及T細胞功能，減少炎性細胞因子及抗體產(chǎn)生，從而維持自身免疫耐受及免疫內(nèi)環(huán)境平衡。Th17/Treg失衡引發(fā)的免疫抑制或應答過度是COPD重要的免疫學發(fā)病機制之一[8]。氣道重塑是COPD病理特征之一，與炎癥介質(zhì)LTB4、IL-8等的釋放關系密切，且是導致氣道管腔狹窄、氣流受限、肺功能進行性下降的主要病理改變[9]。因此，探究有效的免疫調(diào)節(jié)、抗炎、氣道重塑抑制藥物及相關分子靶點對于改善COPD治療效果具有重大意義。

而LL-37屬cathelicidins家族，通常由上皮細胞與中性粒細胞分泌，其活性有賴于螺旋構象的分子結構，其作為一類多功能小分子抗菌肽，已被證實具有抗寄生蟲、抗病毒、抗真菌、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能等多種生物作用[10-11]。此外，LL-37可通過結合CD14與脂多糖中和內(nèi)毒素，并募集免疫細胞至感染部位以殺滅病原菌。研究發(fā)現(xiàn)LL-37應用于COPD的治療可在抗菌的同時調(diào)節(jié)機體免疫功能、抑制細菌與宿主介導的促炎因子分泌[12]。本研究結果顯示，與COPD組比較，LL-37組外周血Th17占比、Th17/Treg，BALF中IL-8、LTB4含量，MT%和MA%降低，Treg占比升高，提示LL-37可維持外周血Th17/Treg平衡，減輕炎癥反應及氣道重塑。Tatsuta等[13]研究也發(fā)現(xiàn)，LL-37可抵消香煙煙霧提取物誘導的跨上皮電阻降低，并防止occludin和ZO-1被破壞，從而減輕氣道上皮屏障功能障礙，對哮喘和COPD等呼吸系統(tǒng)疾病具有顯著益處，本研究結果與其具有相似性。

進一步探討LL-37引起COPD改變的分子機制，其中我們重點檢測Notch通路在COPD中的變化，目前發(fā)現(xiàn)Notch通路在決定器官形成與形態(tài)過程中起重要作用，其成員之一Notch1通過與相鄰細胞的表面配體Jagged1相互作用參與細胞分化、發(fā)育、調(diào)控，并激活下游堿性-螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄抑制因子Hes1，發(fā)揮生物學效應[14]。此外，Notch受體及配體表達于T細胞、巨噬細胞、抗原提呈細胞等多種成熟免疫細胞的表面，參與調(diào)節(jié)機體免疫功能[15]。Notch受體被激活后可促使淋巴前體細胞分化為T淋巴細胞，通過調(diào)節(jié)T淋巴細胞活性抑制其凋亡，從而影響機體免疫功能[16]。近年來研究發(fā)現(xiàn)[17]，Notch1/Jagged1信號通路與肺動脈高壓、肺間質(zhì)病變、COPD、哮喘和肺癌等呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生與發(fā)展，激活或阻斷該途徑可對其病理變化、預后造成明顯影響。Wu等[18]認為，相較于正常大鼠，COPD模型大鼠肺組織中Notch1及其靶基因的表達受到明顯抑制，且采用異硫氰酸烯丙酯干預后大鼠肺功能得以明顯改善，且可能依賴于Notch1信號通路，提示靶向Notch1信號通路可能是治療COPD的有效策略。此外，已有研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可能通過激活Notch1信號通路介導的自噬部分挽救香煙煙霧或Notch1 siRNA誘導的COPD肺內(nèi)皮細胞凋亡，發(fā)揮治療作用[19]。本研究中，與COPD組比較，LL-37組Notch1、Jagged1和Hes1蛋白表達量升高，且在LL-37干預COPD的基礎上聯(lián)合Notch1/Jagged1信號通路抑制劑DAPT將減弱LL-37對COPD的治療作用，提示該信號通路可能是LL-37發(fā)揮作用的通路之一。然而，也有學者認為Notch信號通路在COPD中被過度激活，Th1/Th2介導的促炎免疫是主要發(fā)病機制[20]。免疫應答及炎癥反應均是復雜的病理、生理過程，COPD病情嚴重程度不同，通路被激活、抑制的狀態(tài)也不同。因此，在今后研究中需對該通路在COPD中的表達情況進行進一步驗證：使用Notch1/Jagged1信號通路激動劑對LL-37的作用通路進行正向驗證；探尋有效的COPD模型嚴重程度分級標準，分層次研究通路表達情況；對該通路蛋白之間的相互作用進行深入研究，明確上下游基因關系，為臨床提供更為準確的實驗依據(jù)。

綜上所述，人源抗菌肽LL-37可調(diào)節(jié)COPD大鼠外周血Th17/Treg失衡，抑制炎癥反應及氣道重塑，激活Notch1/Jagged1信號通路可能是其發(fā)揮治療作用的機制之一。

參 考 文 獻

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收稿日期：2021-08-25

基金項目：武漢市衛(wèi)健委科研項目（No. WX20D25）

作者簡介：李琳，女，生于1988年，碩士，住院醫(yī)師，主要研究方向為老年內(nèi)科疾病，E-mail： lilin_198808@163.com

*通訊作者，E-mail： liuju1973@126.com