廖黎?魯蘭?楊晨?劉昆?趙玉婷

摘要：目的? ? 通過生物信息學探究銅綠假單胞菌生物被膜形成的差異表達基因及可能作用機制。方法? ? 通過GEO數(shù)據(jù)庫篩選獲得銅綠假單胞菌生物被膜數(shù)據(jù)芯片GSE120760， GEO2R工具篩選出銅綠假單胞菌浮游狀態(tài)和生物被膜狀態(tài)的差異表達基因；差異表達基因通過String數(shù)據(jù)庫和Cytoscape3.7.1軟件中構建靶點PPI網(wǎng)絡圖， 并在DAVID和KOBAS數(shù)據(jù)庫中對差異表達基因進行GO生物富集和KEGG通路分析。用銅綠假單胞菌體外生物被膜模型測定5種氨基酸（D/L型）的抗生物被膜作用效果。結果? ? 由芯片GSE120760篩選得到556個差異表達基因， 其中上調(diào)基因143個， 下調(diào)基因413個；從差異表達基因中篩選到62個關鍵基因， 這些基因主要與30S和50S核糖體蛋白相關；GO功能富集得到40個條目；KEGG 富集到44條通路， 主要涉及代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、氨基酸生物合成通路、多種氨基酸代謝、群體感應、氨酰tRNA生物合成通路等；體外驗證試驗中，D-氨基酸對銅綠假單胞菌生物被膜有抑制作用， 而L-氨基酸對其形成無影響。結論? ? 通過生物信息學挖掘出銅綠假單胞菌生物被膜形成的關鍵基因與靶點， 并與代謝途徑、氨基酸合成和代謝、群體感應、氨酰tRNA生物合成通路等相關， 為銅綠假單胞菌生物被膜的靶向抗感染藥物的研發(fā)提供思路。

關鍵詞：銅綠假單胞菌；生物被膜；生物信息學；差異表達基因；D-氨基酸；L-氨基酸

中圖分類號：R9文獻標志碼：A

Bioinformatics analysis of Pseudomonas aeruginosa biofilm on gene expression

Liao Li， Lu Lan， Yang Chen， Liu Kun， and Zhao Yu-Ting

（Antibiotics Research and Re-evaluation Key Laboratory of Sichuan Province， Sichuan Industrial Institute of Antibiotics， School of Pharmacy， Chengdu University， Chengdu 610106）

Abstract Objective? ? The aim of study is to investigate differentially expressed genes （DEGs） in the biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa （PA） and its possible mechanism through bioinformatics analysis. Methods? Data chip GSE120760 of biofilm in? Pseudomonas aeruginosa was obtained in GEO database. The DEGs in planktonic status and biofilm status of PA were identified by GEO2R. The PPI network map of DEGs was constructed by string database and Cytoscape 3.7.1 software. In David and Kobas database， GO bioaccumulation and KEGG pathway analysis were carried out on DEGs. The anti-biofilm effects of five amino acids （D/L） were determined by the in vitro biofilm model of PA. Results? ? Five hundred and fifty-six DEGs were selected from GSE120760， including 143 up-regulated genes and 413 down-regulated genes. Sixty-two key genes were screened out from DEGs， which were mainly related to 30S and 50S ribosomal proteins. Forty items were enriched in GO function. In KEGG pathway analysis， forty-four pathways were obtained， which were mainly related to metabolic pathway， biosynthesis of secondary metabolites， biosynthesis of amino acid， amino acid metabolism， quorum sensing， aminoacyl-tRNA biosynthesis. In vitro， D-amino acids had inhibitory effects on PA biofilm formation， while L-amino acids had no effect on PA biofilm formation. Conclusion? ? Key genes in PA biofilm formation were identified by bioinformatics analysis， which was related to metabolic pathway， biosynthesis and metabolism of amino acid， aminoacyl-tRNA biosynthesis. Our findings would provide ideas for the development of anti-infective drugs targeting biofilm in PA.

Key wordsPseudomonas aeruginosa; Biofilm; Bioinformatics; Differentially expressed genes; D-amino acids; L-amino acids

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa， PA）是臨床常見條件致病菌，當人體的組織屏障破壞、進行有創(chuàng)醫(yī)療操作或免疫功能低下時，可引起人體組織局部化膿性炎癥及全身感染，如呼吸道感染、肺炎、敗血癥等[1]。人體感染銅綠假單胞菌后，導致的慢性感染和反復感染很難完全治愈，這與其形成生物被膜（biofilm， BF）有關[2]。臨床數(shù)據(jù)顯示，銅綠假單胞菌在肺囊性纖維化（cystic fibrosis， CF）中形成對耐藥生物被膜而阻礙抗生素療效[3]。另外，傷口慢性感染、慢性鼻竇炎、慢性中耳炎等也與銅綠假單胞菌生物被膜生成有關[4]。生物被膜是附著在惰性或活性表面，由細菌及其分泌胞外多糖等物質(zhì)形成結構化膜狀細菌群體[5]。研究發(fā)現(xiàn)，高達80%的人類細菌感染與其生物被膜形成有關[6]，此外成熟生物被膜細菌耐藥性比浮游菌高500～5000倍[7]。這可能與生物被膜阻止藥物進入、限制細菌營養(yǎng)供給、減緩細菌生長、降低其對抗生素的敏感性、逃逸宿主免疫系統(tǒng)作用等相關[8]。

本研究通過生物信息學技術，篩選與銅綠假單胞菌生物被膜形成有關的功能基因，并與浮游菌比較獲得差異表達基因（DEGs）[9]，再對這些差異表達基因進行富集功能及通路分析，探討銅綠假單胞菌形成生物被膜機制，為實驗與臨床抑制銅綠假單胞菌生物被膜提供理論依據(jù)和新思路。

1 材料與方法

1.1 公共數(shù)據(jù)收集

美國國立生物技術信息中心（NCBI）基因表達綜合數(shù)據(jù)庫GEO （http：//www.ncbi.nlm.gov/geo/）是高通量基因表達，芯片和微陣列數(shù)據(jù)的功能基因組學數(shù)據(jù)庫[10]。從數(shù)據(jù)庫篩選出銅綠假單胞菌在慢性創(chuàng)面滲出物中的表達分析數(shù)據(jù)芯片GSE120760（芯片信息：Affymetrix? Pseudomonas aeruginosa array，GPL84）。該芯片以3株浮游銅綠假單胞菌及3株生物被膜銅綠假單胞菌為研究對象。

1.2 數(shù)據(jù)篩選處理

GEO數(shù)據(jù)庫自帶在線分析工具GEO2R（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）是一個交互式網(wǎng)頁工具，它可以比較GEO系列中的兩個或多個數(shù)據(jù)集，確定實驗條件下的差異表達基因[11]，用其篩選浮游銅綠假單胞菌和生物被膜銅綠假單胞菌中的差異表達基因，篩選標準為P＜0.05，log FC >1或log FC <-1，log FC >1的基因為上調(diào)差異表達基因，log FC<-1的基因為下調(diào)差異表達基因。繪制差異表達基因火山圖并進行后續(xù)分析。

1.3 差異表達基因相互作用分析和核心基因篩選

將差異表達基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫（http：//string-db.org/），設置種屬銅綠假單胞菌，去除無連接靶點，minimum required interaction score設置為0.9，預測蛋白相互作用。再將分析結果導入Cytosacpe3.7.1軟件構建蛋白交互網(wǎng)絡圖（protein-protein interaction，PPI）。使用CytoHubba插件對其網(wǎng)絡進行關聯(lián)度分析[12]，根據(jù)節(jié)點度大小篩選核心基因。

1.4 基因本體與通路富集分析

將差異表達基因分別在DAVID數(shù)據(jù)庫（http：//david.ncifcrf.gov/）中進行基因本體（gene ontology，GO）生物富集分析，以P<0.05作為篩選標準，用生物學過程（biological process，BP）、細胞組分（cell component，CC）、分子功能（molecular function，MF），繪制GO注釋圖；在KOBAS數(shù)據(jù)庫（http：//kobas.cbi.pku.edu.cn/）中進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路注釋分析，以P<0.05作為標準篩選，繪制KEGG分析圖。

1.5 D/L-氨基酸體外對銅綠假單胞菌生物被膜作用試驗

1.5.1 材料和儀器

D-色氨酸（BTSJ20200906）、D-絲氨酸（BTSJ20200701）、D-纈氨酸（BTSJ20201021）、D-丙氨酸（BTSJ20201004）、D-酪氨酸（BT8J19XBQ）、L-色氨酸（BTSJ20200714）、L-絲氨酸（BTSJ20200114）、L-纈氨酸（BTSJ20200902）、L-丙氨酸（BTSJ20200516）、L-酪氨酸（BTSJ20200309），均購于成都潤澤本土化工有限公司；近期收集的臨床分離致病銅綠假單胞菌10株，來源于四川抗菌素工業(yè)研究所；胰酪大豆瓊脂培養(yǎng)基 TSA（批號：8063172），美國BD公司；營養(yǎng)肉湯 NB（批號：20200512），北京奧博星生物技術有限責任公司；生理鹽水（批號：M0080204C），四川科倫藥業(yè)股份有限公司；結晶紫（批號：9301041），北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇（批號：2019121801），成都市科龍化工試劑廠；無菌96孔板（批號：010617A005）， NEST公司；麥氏比濁管（批號：075870），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；Multiskan FC型酶標儀，賽默飛世爾上海儀器有限公司；GNP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設備有限公司；Sartorius BS124S型電子天平，德國Sartorius公司。

1.5.2 方法

（1）銅綠假單胞菌產(chǎn)生物被膜菌株篩選

取銅綠假單胞菌10株，于TSA平板復蘇過夜，挑取單個菌落于無菌生理鹽水，調(diào)至麥氏比濁度1.0，滅菌營養(yǎng)肉湯稀釋20倍備用。取96孔板于第2～11列，每列第2～7行6個復孔中分別加入稀釋好的10株菌液200 μL，其余孔加入無菌生理鹽水200 μL，置37℃恒溫培養(yǎng)72 h。

取出96孔板，倒掉剩余培養(yǎng)液，用無菌生理鹽水小心洗滌2次，去除浮游菌，加入2%結晶紫溶液250 μL染色10 min，再用無菌生理鹽水緩慢洗去多余結晶紫，加入250 μL無水乙醇溶解，最后用酶標儀測定96孔板各孔在 570 nm處A值[14]。

（2）D/L-氨基酸體外對銅綠假單胞菌生物被膜形成抑制作用試驗

取篩選出產(chǎn)膜能力強的銅綠假單胞菌1株于TSA平板復蘇過夜，挑取單個菌落于無菌生理鹽水，調(diào)至麥氏比濁度1.0，滅菌營養(yǎng)肉湯稀釋10倍備用。取96孔板，在第1～2列加入無菌營養(yǎng)肉湯100 μL，作為菌對照；第3～12列中分別加入D-酪氨酸、L-酪氨酸、D-色氨酸、L-色氨酸、D-丙氨酸、L-丙氨酸、D-絲氨酸、L-絲氨酸、D-纈氨酸、L-纈氨酸各200 mmol/L的營養(yǎng)肉湯100 μL[13]，每列6個復孔。再在第1～12列的6個復孔中加入稀釋好的菌液100 μL，其余孔加入無菌生理鹽水200 μL，置37℃恒溫培養(yǎng)72 h。按“1.5.2（2）”項下的結晶紫染色方法處理，并測定其在570 nm 處A值。

1.5.3 統(tǒng)計學分析

結果用平均數(shù)±標準差（x±s）表示。使用Prism-graph 8.0對銅綠假單胞菌試驗數(shù)據(jù)進行分析和統(tǒng)計圖繪制。各組間的比較進行單因素方差分析，并進行統(tǒng)計學分析的Tukey's測試。P＜0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 銅綠假單胞菌中差異表達基因分析

GSE120760芯片中的3株浮游銅綠假單胞菌設為control組，3株生物被膜銅綠假單胞菌設為biofilm組，利用GEO2R工具共篩選出556個差異表達基因，其中143個為上調(diào)基因，413 個為下調(diào)基因，見圖1，紅色代表上調(diào)基因，綠色代表下調(diào)基因，灰色代表無顯著差異表達基因。

2.2 蛋白交互PPI網(wǎng)絡圖構建及核心基因分析

通過String數(shù)據(jù)庫和Cytosacpe3.7.1構建556個差異表達基因間的蛋白交互網(wǎng)絡。去除無交集蛋白，得到428個點，2537條邊。通過CytoHubba對網(wǎng)絡進行分析，根據(jù)節(jié)點degree值大小排名，其中degree值越大，表明其在網(wǎng)絡圖中相互作用程度越高，取degree值大于30的基因，得到62個關鍵基因，部分信息見表1，多數(shù)基因為30S核糖體蛋白和50S核糖體蛋白。將這62個關鍵基因用String數(shù)據(jù)庫和Cytosacpe3.7.1軟件構建蛋白交互網(wǎng)絡圖（PPI），見圖2。根據(jù)每個節(jié)點degree值大小確定其大小顏色，得到邊線數(shù)1668條，聚類系數(shù)為0.924，平均節(jié)點degree值為53.806，表明基因連通性好。

2.3 差異表達基因GO生物富集和KEGG通路分析結果

利用DAVID數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行GO生物富集分析，得到生物學過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）條目共40個，見圖3，其中BP主要富集于翻譯、TCA循環(huán)、IMP生物合成過程、ATP合成與質(zhì)子電子傳輸耦合、吩嗪生物合成過程、次生代謝產(chǎn)物生物合成過程、吡哆醇生物合成過程、蘇氨酸、組氨酸、精氨酸生物合成過程、糖酵解、有氧呼吸等；CC主要富集于胞漿大小核糖體亞單位、細胞質(zhì)、核糖體等；MF主要富集于核糖體結構組成、RNA結合、鎂離子結合、ATP結合、氧化還原酶活性、細胞色素c氧化酶活性等。

通過KOBAS數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行KEGG通路分析，得到44條通路，見圖4，差異表達基因通路主要富集于代謝途徑、抗生素生物合成、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、氨基酸生物合成、不同環(huán)境中的微生物代謝、群體感應、甘氨酸、絲氨酸及丙氨酸等多種氨基酸代謝、賴氨酸、酪氨酸及纈氨酸等多種氨基酸生物合成、TCA循環(huán)、糖酵解、銅綠假單胞菌生物被膜形成、氨酰tRNA生物合成、DNA復制、D-丙氨酸代謝、陽離子抗菌肽（CAMP）耐藥性等。

2.4 D/L-氨基酸對銅綠假單胞菌生物被膜形成影響

KEGG通路中，L型氨基酸色氨酸、絲氨酸、纈氨酸、丙氨酸、酪氨酸參與代謝途徑，氨基酸生物合成，氨酰tRNA生物合成，為了驗證這些D型氨基酸與L型氨基酸競爭參與上述通路而對銅綠假單胞菌生物被膜形成起到抑制作用，通過D/L氨基酸體外對銅綠假單胞菌生物被膜形成抑制作用試驗。首先采用結晶紫染色法檢測近期收集的10株臨床分離銅綠假單胞菌產(chǎn)生生物被膜的水平，見圖5，由結果篩選出銅綠假單胞菌1809產(chǎn)膜能力強，用于后續(xù)試驗。

D/L-氨基酸對銅綠假單胞菌1809生物被膜形成影響作用如表2與圖6所示。各氨基酸在96孔板終濃度為100 mmol/L時，D-酪氨酸、D-色氨酸、D-丙氨酸、D-絲氨酸、D-纈氨酸與對照組比較，各組吸光度均顯著降低（P＜0. 05或P＜0. 01），表明其抑制銅綠假單胞菌生物被膜形成。L-酪氨酸、L-色氨酸、L-丙氨酸、L-絲氨酸、L-纈氨酸與對照組比較，各組吸光度無顯著變化，表明其對銅綠假單胞菌生物被膜形成無明顯影響。

3 討論

隨著抗生素大量應用，臨床耐藥銅綠假單胞菌分離率逐年增高，其耐藥形勢嚴峻，已成為臨床治療其感染難題[15]。銅綠假單胞菌耐藥機制復雜多變，生物被膜形成是其產(chǎn)生耐藥的重要途徑，也是導致院內(nèi)長期和反復感染的原因之一[16]。針對臨床銅綠假單胞菌的生長及代謝特點，研發(fā)新的抗感染藥物及建立新的治療模式非常迫切。生物信息學以基因芯片研究為基礎，從基因芯片中得到大量、復雜生物信息數(shù)據(jù)，運用序列比對、統(tǒng)計分析、生物分子網(wǎng)絡、通路分析及可視化作圖等方法，對生物信息數(shù)據(jù)進行挖掘[17]，從而全面對銅綠假單胞菌生物被膜進行系統(tǒng)研究。本研究通過分析GEO數(shù)據(jù)庫中GSE120760芯片篩選生物被膜銅綠假單胞菌和浮游銅綠假單胞菌間有顯著差異表達基因556個，其中上調(diào)基因143個，下調(diào)基因413個。

通過String數(shù)據(jù)庫和Cytosacpe3.7.1構建差異表達基因間的PPI網(wǎng)絡圖，利用CytoHubba插件得到62個關鍵基因，包括50S核糖體蛋白（rplB、rplD、rplM、rplC和rplE等）、30S核糖體蛋白（rpsE、rpsK、rpsS、rpsC和rpsM等）及其他（rpoB、secY和frr等），而核糖體是蛋白質(zhì)合成主要場所，核糖體、氨基酸、蛋白質(zhì)與銅綠假單胞菌生物被膜形成、發(fā)展密切相關。GO富集分析表明，差異表達基因富集在翻譯、TCA循環(huán)、ATP合成與質(zhì)子電子傳輸耦合、蘇氨酸、組氨酸、精氨酸生物合成過程、糖酵解、有氧呼吸等生物過程。KEGG通路分析表明，差異表達基因富集于與代謝途徑、次生代謝產(chǎn)物生物合成、氨基酸生物合成、群體感應、甘氨酸、絲氨酸及丙氨酸等多種氨基酸代謝、TCA循環(huán)、銅綠假單胞菌生物被膜形成、氨酰tRNA生物合成、D-丙氨酸代謝等。生物體通常選擇L-氨基酸作為合成多肽基本單元和關鍵代謝中間體，參與蛋白質(zhì)合成[18] ，蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)也依靠 L-立體專一性氨基酰-tRNA合成酶區(qū)分L/D型氨基酸，并將L-氨基酸摻入到合成的蛋白質(zhì)鏈中，如酪胺酰-tRNA合成酶（TyrRS）無法區(qū)分L-酪氨酸和D-酪氨酸，從而造成D-酪氨酸對細菌潛在毒性[19]。

此外，D-氨基酸還可通過改變生物被膜細胞肽聚糖層結構，干擾蛋白質(zhì)合成等造成細胞外基質(zhì)構象疏松，使生物被膜整體結構塌陷[5]。文獻報道，D型氨基酸能抑制細菌生物被膜形成，如D-纈氨酸（75 mmol/L）能抑制牙齦卟啉單胞菌生物被膜的形成并分散成熟的生物被膜，而L-纈氨酸能促進生物被膜的形成[20]。D-亮氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸和D-酪氨酸在毫摩爾甚至微摩爾數(shù)量級下能分散枯草芽孢桿菌形成的生物被膜，從而破壞其生物被膜，而相應的L-型氨基酸對其生物被膜無影響[21]。D-酪氨酸能顯著抑制銅綠假單胞菌生物被膜，聯(lián)合丁胺卡那霉素可提高其抗銅綠假單胞菌生物被膜效果，增強其抑制銅綠假單胞菌生物被膜菌群的活性[22]。這些發(fā)現(xiàn)均表明一些D-氨基酸在抑制生物被膜形成和分散成熟生物被膜中具有的潛力[23-24]。

KEGG通路中，L型氨基酸色氨酸、絲氨酸、纈氨酸、丙氨酸、酪氨酸等都參與代謝途徑，氨基酸生物合成，氨酰tRNA生物合成。D型氨基酸與L型氨基酸空間構型的不同，是否D型氨基酸能與L型氨基酸在生物合成反應中存在競爭關系，從而阻斷這些通路來抑制銅綠假單胞菌生物被膜形成，值得我們探索。因此，本研究選用上述D/L-氨基酸進行體外抗銅綠假單胞菌生物被膜作用比較試驗。結果得到這些D-氨基酸在濃度為100 mmol/L時，能顯著抑制銅綠假單胞菌生物被膜形成，而L-氨基酸對其生物被膜形成無明顯影響，從而推測D型氨基酸可能通過與L型氨基酸競爭參與代謝途徑，氨基酸生物合成，氨酰tRNA生物合成和氨基酸代謝通路對銅綠假單胞菌生物被膜形成起到抑制作用。

綜上所述，本研究通過生物信息學挖掘銅綠假單胞菌生物被膜相關基因芯片數(shù)據(jù)，并分析其差異表達基因、關鍵靶點、通路，通過這些信息我們將進一步認識銅綠假單胞菌形成生物被膜過程及可能作用機制，并通過體外試驗驗證D型氨基酸對銅綠假單胞菌生物被膜形成的抑制作用及可能作用機制，為以銅綠假單胞菌生物被膜為靶點的靶向抗感染藥物的研發(fā)提供思路。

參 考 文 獻

劉傳玲， 王佳賀. 中藥抗耐藥銅綠假單胞菌機制的研究進展[J]. 中國醫(yī)藥導報， 2019， 16（3）： 40-43.

Girard G， Bloemberg G V. Central role of quorum sensing in regulating the production of pathogenicity factors in Pseudomonas aeruginosa[J]. Future Microbiol， 2008， 3（1）： 97-106.

Moreau-Marquis S， Coutermarsh B， Stanton B A. Combination of hypothiocyanite and lactoferrin （ALX-109） enhances the ability of tobramycin and aztreonam to eliminate Pseudomonas aeruginosa biofilms growing on cystic fibrosis airway epithelial cells[J]. J Antimicrob Chemother， 2015， 70（1）： 160-166.

Sanchez Z， Tani A， Kimbara K. Extensive reduction of cell viability and enhanced matrix production in Pseudomonas aeruginosa PAO1 flow biofilms treated with a D-amino acid mixture[J]. Appl Environ Microbiol， 2013， 79（4）： 1396-1399.

齊華， 王鶴齡， 李保勝， 等. D-氨基酸對生物膜抑制作用的研究進展[J]. 現(xiàn)代口腔醫(yī)學雜志， 2017， 31（4）： 242-244.

Wood T K， Hong S H， Ma Q. Engineering biofilm formation and dispersal[J]. Trends Biotechnol， 2011， 29（2）： 87-94.

何年安， 王文平. 超聲在細菌生物膜相關感染治療中的應用[J]. 中華超聲影像學雜志， 2012（9）： 815-817.

Peeters E， Nelis H J， Coenye T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates[J]. J Microbiol Methods， 2008， 72（2）： 157-165.

邱潔萍， 孫夢雨， 左瑞東， 等. 基于GEO數(shù)據(jù)庫的胃癌差異表達基因的生物信息學分析[J]. 中國免疫學雜志， 2020， 36（19）： 2394-2399.

Ma C， Xu T， Sun X， et al. Network pharmacology and bioinformatics approach reveals the therapeutic mechanism of action of baicalein in hepatocellular carcinoma[J]. Evid Based Complement Alternat Med， 2019（2）： 224-238.

Li Z， Liu J， Wang W， et al. Investigation of hub genes involved in diabetic nephropathy using biological informatics methods[J]. Ann Transl Med， 2020， 8（17）： 1087-1098.

Chin C H， Chen S H， Wu H H， et al. CytoHubba： Identifying hub objects and sub-networks from complex interactome[J]. BMC Systems Biol， 2014， 8（S4）： S11.

KolodkinGal I， Romero D， Shugeng C， et al. D-Amino acids trigger biofilm disassembly[J]. Science， 2010， 328（5978）： 627-629.

程強， 曾銘， 魯蘭， 等. 四季青水煎液對銅綠假單胞菌生物被膜生成、毒力因子分泌的抑制作用及機制研究[J]. 中藥藥理與臨床， 2019， 35（4）： 111-116.

胡付品， 郭燕， 朱德妹， 等. 2018年CHINET中國細菌耐藥性監(jiān)測[J]. 中國感染與化療雜志， 2020， 20（1）： 1-10.

郭孝蘭， 李永偉. 銅綠假單胞菌耐藥機制與生物被膜相關性研究進展[J]. 新發(fā)傳染病電子雜志， 2017， 2（3）： 188-191.

郁樂， 張軼雯， 辛文秀， 等. 基于GEO芯片數(shù)據(jù)的肝癌特征基因生物信息學及預后關聯(lián)性分析[J]. 中國現(xiàn)代應用藥學， 2019， 36（17）： 2177-2182.

薛二淑， 吳昊， 宋倩倩， 等. 細菌中D-氨基酸生物合成及調(diào)控作用研究進展[J]. 中國生物工程雜志， 2019， 39（4）： 106-113.

紀芳， 陳博磊， 梁勇. D-氨基酸在細菌生理中的結構性能和調(diào)節(jié)功能的研究進展[J]. 微生物學報， 2018， 58（12）： 2078-2086.

張慧彥， 李保勝， 張震陽， 等. D/L-纈氨酸對牙齦卟啉單胞菌及其生物膜的作用[J]. 口腔醫(yī)學研究， 2020， 36（7）： 648-653.

Romero D， Vlamakis H， Losick R， et al. An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms[J]. Mol Microbiol， 2011， 80（5）： 1158-1168.

She P， Chen L， Liu H，， et al. The effects of D-Tyrosine combined with amikacin on the biofilms of Pseudomonas aeruginosa[J]. Microb Pathog， 2015， 86（6）： 38-44.

Cava F， Lam H， Miguel A， et al. Emerging knowledge of regulatory roles of D-amino acids in bacteria[J]. Cell Mol Life Sci， 2011， 68（5）： 817-831.

佘鵬飛， 陳麗華， 許歡， 等. D-氨基酸在生物膜分散中的作用研究進展[J]. 中國病原生物學雜志， 2015， 10（4）： 377-380.

收稿日期：2021-03-29

基金項目：國家自然科學基金（No. 81803812）

作者簡介：廖黎，女，生于1987年，在讀碩士研究生，研究方向為中藥藥理及機理，E-mail： 493993621@qq.com

*通訊作者，E-mail： 345747278@qq.com