張琪?何建?楊曉艷?辛有全?靳娟?李勝?熊浩明?楊建國?代瑞霞

摘要：目的 觀察左氧氟沙星不同注射時(shí)間治療實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鼠疫的療效。方法 參照《中國藥典》成人劑量，用施新猷動(dòng)物折算系數(shù)法計(jì)算豚鼠每日所需注射劑量。實(shí)驗(yàn)設(shè)立24 h治療組和48 h治療組及對(duì)照組，每組10只豚鼠。30只實(shí)驗(yàn)豚鼠均于鼠鼷部皮下注射菌量為1×107 cfu/mL鼠疫菌141株，24 h治療組和48 h治療組分別于染毒后24 h和48 h開始注射左氧氟沙星進(jìn)行治療，12 mg/d，

1日1次，連續(xù)治療9日再觀察9日。結(jié)果 左氧氟沙星24 h、48 h治療組治愈率分別為100%和70%，對(duì)照組動(dòng)物全死亡。結(jié)論 左氧氟沙星治療實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鼠疫療效顯著，可用于鼠疫臨床一線治療。

關(guān)鍵詞：鼠疫；左氧氟沙星；治療；豚鼠；療效觀察

中圖分類號(hào)：R978.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Effect of levofloxacin injection time on plague in experimental animals

Zhang Qi1， He Jian1， Yang Xiao-yan1， Xin You-quan1， Jin Juan1， Li Sheng1， Xiong Hao-ming2，

Yang Jian-guo2， and Dai? Rui-xia1

（1 Specialized Laboratory of? Yersinia pestis， Qinghai Institute for Endemic Disease Prevention and Control， Xi'ning 811602;

2 Department of Plague， Qinghai Institute for Endemic Disease Prevention and Control， Xi'ning 811602）

Abstract Objective To observe the efficacy of levofloxacin in the treatment of experimental plague in guinea pigs. Methods According to China pharmacopoeia， the daily dose of levofloxacin were converted into the guinea pig dose by using the method of Shixinyou animal conversion coefficient. A 24 h treatment group， a 48 h treatment group， and a control group were set up， with 10 guinea pigs in each group. Thirty guinea pigs were injected subcutaneously with 141 strains of Yersinia pestis of 1×107 cfu/mL on the mouse surface. Levofloxacin was injected 12 mg/d at 24 h

and 48 h in the treatment group， respectively， once a day for nine consecutive days and nine days of observation. Results The cure rates of levofloxacin in 24 h and 48 h treatment groups were 100% and 70%， respectively， and all the animals in control group died. Conclusion Levofloxacin has a significant therapeutic effect on plague in experimental animals and can be used in the first-line clinical treatment of plague.

Key words Plague; Levofloxacin; Treatment; Guinea pigs; Clinical observation on

鼠疫（Plague）是由鼠疫耶爾森菌（Yersinia pestis，? ?Y. pestis）引起的一種自然疫源性傳染病，發(fā)病急、傳染性強(qiáng)且該傳染病死率極高，屬國際檢疫傳染病，是我國《中國傳染病防治法》第三條中規(guī)定的甲類傳染病之一。歷史上曾有過多次鼠疫大流行，感染者死亡總?cè)藬?shù)接近2億[1]。隨著青霉素及其他抗生素的廣泛應(yīng)用，鼠疫全球性的大流行再未出現(xiàn)，也未造成病例的大量死亡[2]。但是最近幾年鼠疫卷土重來，其中比較嚴(yán)重的2017年非洲馬達(dá)加斯加鼠疫疫情，確診病例超過了2600例，超過半數(shù)病例為肺鼠疫[3]。我國自進(jìn)入21世紀(jì)后，鼠疫疫情呈現(xiàn)局灶性與散發(fā)性分布，多發(fā)于西北部的青海省和西藏自治區(qū)，主要由于青壯年主動(dòng)進(jìn)入鼠疫疫區(qū)或者接觸了患有鼠疫的宿主動(dòng)物，因此被鼠疫菌感染[4]。2019年我國北京市出現(xiàn)2例從內(nèi)蒙古輸入的肺鼠疫病例[5]，之后內(nèi)蒙古又出現(xiàn)2例腺鼠疫患者[6-7]，這一事件為我們敲響了警鐘，提示我國鼠疫防控形勢(shì)仍然嚴(yán)峻，防控工作不容松懈[8]。

目前國內(nèi)外鼠疫的治療一線方案中仍一致選用鏈霉素，只是各國在選用的治療劑量上有所不同而已[9]，這與鼠疫菌種屬的遺傳特征和對(duì)抗生素的敏感性不同有關(guān)，但鏈霉素屬于氨基糖苷類抗生素，其安全范圍窄，不良反應(yīng)明顯，具有一定的耳毒性和腎毒性[10]。近年來陸續(xù)有鼠疫耐藥菌株的報(bào)道，其中馬達(dá)加斯加報(bào)道了一株多重耐藥性鼠疫菌，不僅耐鏈霉素而且對(duì)磺胺類藥物也出現(xiàn)耐藥[11-13]。氟喹諾酮類藥物在體外試驗(yàn)中對(duì)鼠疫菌顯示良好的抗菌活性，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也取得了良好效果。目前美國FDA已經(jīng)批準(zhǔn)左氧氟沙星為鼠疫治療中的主要抗生素[14]，但是我國還未確定其為鼠疫患者一線治療藥物或替代治療藥物。本試驗(yàn)旨在觀察左氧氟沙星不同注射時(shí)間治療感染鼠疫動(dòng)物的療效，從而為是否能將左氧氟沙星作為替代藥物納入我國鼠疫的治療方案中提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、菌株、培養(yǎng)基及藥物

SPF級(jí)豚鼠30只，雌性，體重250～300 g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供。鼠疫菌強(qiáng)毒株141及試驗(yàn)用赫氏培養(yǎng)基（購自北京陸橋股份有限公司）均由青海省地方病預(yù)防控制所鼠疫菌專業(yè)實(shí)驗(yàn)室提供。注射用甲磺酸左氧氟沙星，山東羅欣藥業(yè)集團(tuán)有限公司，0.2 g，國藥準(zhǔn)字H20051882。

1.2 主要儀器

意大利泰尼百斯公司動(dòng)物負(fù)壓隔離籠，賽默飛世爾公司Ⅱ級(jí)B2型生物安全柜，美國紐埃爾公司換籠工作臺(tái)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

將30只、體重為250～300 g的SPF級(jí)雌性豚鼠完全隨機(jī)地分配至24 h治療組、48 h治療組和對(duì)照組，每組10只，實(shí)驗(yàn)前編號(hào)、稱重。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)感染

取強(qiáng)毒鼠疫菌141株37℃ 24 h培養(yǎng)物，比濁稀釋為濃度約為1×107 cfu/mL的菌懸液于豚鼠鼠鼷部，采用皮下注射方式感染，染毒劑量為1 mL/只。

1.3.3 治療

左氧氟沙星用量參照《中國藥典》成人劑量，用施新猷等[15-16]動(dòng)物折算系數(shù)法換算豚鼠用藥劑量。左氧氟沙星為40 mg/kg/ d，豚鼠給藥量=40 mg/（kg·d） ×0.3 kg=12 mg/d，24 h和48 h治療組均通過皮下注射給藥，對(duì)照組不治療。

1.3.4 治愈標(biāo)準(zhǔn)

按常規(guī)量用左氧氟沙星治療感染動(dòng)物9 d，經(jīng)醫(yī)學(xué)觀察9 d未死亡，處死解剖，各臟器均未分離到鼠疫菌，同時(shí)具備上述兩項(xiàng)條件判定為豚鼠鼠疫治愈。如治療期間豚鼠死亡，解剖后取臟器壓印培養(yǎng)后如果分離到鼠疫菌則判定為鼠疫治療無效，動(dòng)物屬特異性死亡。

1.3.5 觀察

對(duì)實(shí)驗(yàn)期間死亡動(dòng)物解剖后取材做壓印鼠疫細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)，并觀察其組織臟器病理改變。存活動(dòng)物于停藥后第9天全部處死，解剖取材后進(jìn)行細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)和組織臟器病理觀察。

1.3.6 實(shí)驗(yàn)操作

涉及高生物安全風(fēng)險(xiǎn)的實(shí)驗(yàn)步驟，例如鼠疫菌培養(yǎng)、動(dòng)物染毒和解剖培養(yǎng)等均在青海省地方病預(yù)防控制所生物安全三級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 治療組療效觀察

表1結(jié)果顯示，左氧氟沙星于感染后24 h開始治療的10只豚鼠全部治愈，治愈率為100%，于感染后48 h開始治療的10只豚鼠存活7只，治愈率為70%，動(dòng)物死亡時(shí)間為感染后3～7 d。

2.2 對(duì)照組的觀察

未治療實(shí)驗(yàn)豚鼠于染毒后第3天死亡3只，之后陸續(xù)死亡，第6天實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部死亡，解剖后剪取各臟器，用臟器切面壓印于培養(yǎng)基培養(yǎng)后均分離到鼠疫菌，屬于特異性死亡。

2.3 動(dòng)物感染鼠疫后的觀察

染毒后的對(duì)照組動(dòng)物表現(xiàn)為精神差，食欲不佳，食量驟減，不飲水或飲水較少，身體蜷縮在籠盒角落發(fā)抖，毛豎立狀，盜汗，行動(dòng)遲緩或不活動(dòng)，3～6 d陸續(xù)死亡，解剖后肉眼可見皮下有充血，鼠鼷部淋巴結(jié)均有腫大，并且與周圍組織發(fā)生黏連，局部有個(gè)別化膿灶。24 h治療組和48 h治療組動(dòng)物染毒后，起初精神萎靡，納食差，飲水少，活動(dòng)量減少，隨著每日治療的進(jìn)行，24 h治療組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于2 d后開始攝食，其活動(dòng)量也逐漸增加，納食轉(zhuǎn)佳、毛逐漸順滑，恢復(fù)正常狀態(tài)，然而48 h治療組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物則于4～5 d后才開始轉(zhuǎn)愈恢復(fù)正常狀態(tài)。治療動(dòng)物停藥后觀察9 d，各方面狀況佳，體重有所增加，對(duì)照組豚鼠解剖后，肝臟輕微充血腫大呈紫褐色，表面有點(diǎn)狀壞死灶。脾臟明顯腫大發(fā)生充血，質(zhì)地硬，表面有點(diǎn)狀壞死灶，雙肺也充血腫大狀態(tài)，顏色為暗紅色，分別將肝臟、脾臟、肺、心臟、淋巴腺切面壓印于培養(yǎng)基進(jìn)行鼠疫細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)，鏡下可見鼠疫菌，鼠疫菌裂解實(shí)驗(yàn)陽性，屬特異性死亡。治療組豚鼠解剖后，肝、脾已逐漸恢復(fù)正常大小，其他各臟器無明顯病理改變，接受治療的動(dòng)物死亡后臟器壓印培養(yǎng)后均未見鼠疫菌，詳見圖1。

3 討論

近些年來鼠疫時(shí)有發(fā)生，仍威脅著世界各國的公共衛(wèi)生安全[17]，因此未來鼠疫治療研究方向中應(yīng)著眼于研究有效安全的治療藥物，制定藥物敏感且藥物毒副作用小的治療方案。在我國鏈霉素仍然為鼠疫治療首選藥物，但在未來的臨床治療中不可避免的出現(xiàn)鼠疫菌耐鏈霉素狀況，這時(shí)候則需要果斷啟用鏈霉素替代治療方案。我國鼠疫菌的生物型別更豐富，所以在左氧氟沙星的使用劑量上，國內(nèi)外治療方案會(huì)有差異，還需進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。左氧氟沙星為第三代喹諾酮類藥物，其藥物作用機(jī)制是通過抑制細(xì)菌DNA的合成從而殺滅細(xì)菌。辛有全等體外抗菌活性試驗(yàn)結(jié)果表明鼠疫菌對(duì)左氧氟沙星是敏感的，左氧氟沙星對(duì)我國1010株鼠疫菌的MIC范圍為0.03～0.25 μg/mL[18-19]，根據(jù)CLSI鼠疫耶爾森菌標(biāo)準(zhǔn)（敏感：≤0.25 μg/mL），因CLSI尚無鼠疫耶爾森菌耐藥中介及標(biāo)準(zhǔn)，參照一般細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)擬定左氧氟沙星的耐藥折點(diǎn)（耐受：≥8 μg/mL），但這些試驗(yàn)均為體外實(shí)驗(yàn)，其不能完全證明左氧氟沙星的療效，因此還需要通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

本次實(shí)驗(yàn)使用的染毒株141屬于鼠疫強(qiáng)毒株，其對(duì)豚鼠最小致死量（MLD）為50 cfu/mL[20]，本實(shí)驗(yàn)攻擊劑量為1×107 cfu/mL，是其MLD 2×105倍，左氧氟沙星于感染后24 h接受治療的實(shí)驗(yàn)豚鼠存活率為100%，48 h開始治療的存活率為70%，雖然48 h治療組較24 h治療組存活率低，但仍有大于半數(shù)的實(shí)驗(yàn)豚鼠存活。這就說明了左氧氟沙星治療鼠疫療效顯著。因此，我們可以認(rèn)為左氧氟沙星治療重癥鼠疫是可行的，如果在臨床治療中出現(xiàn)耐鏈霉素的患者，左氧氟沙星可替代鏈霉素進(jìn)行臨床治療，但應(yīng)遵循早診斷，早治療的原則，從而提高鼠疫患者的治愈率。任何藥物初期使用階段都是敏感有效的，但是在長期使用過程中可能會(huì)不可避免的出現(xiàn)抗藥，因此在左氧氟沙星臨床治療過程中，應(yīng)盡量做到規(guī)范用藥，并且定期做藥物耐藥性監(jiān)測(cè)，使之成為一種可持續(xù)發(fā)展的治療方案。本研究對(duì)我國鼠疫治療方案的更新具有現(xiàn)實(shí)意義，也將進(jìn)一步提高了我國鼠疫防控工作的防治水平。

參 考 文 獻(xiàn)

黎文鴻， 王夢(mèng)迪， 尹家祥. 自然環(huán)境改變對(duì)鼠疫發(fā)生的影響[J]. 中國熱帶醫(yī)學(xué)， 2021， 21（10）： 1013-1016.DOI：10.13604/j.cnki.46-1064/r.2021.10.20.

Gage K L， Kosoy M Y. Natural history of plague： Perspectives from more than acentury of research[J]. Annu Rev Entomol， 2005， 50： 505-528.

李碩， 張?jiān)戚x， 王永怡， 等. 2017年全球傳染病熱點(diǎn)回顧 [J]. 傳染病信息， 2018， 31（1）： 5-10.

向鎖玉， 孫希， 吳忠道. 中國鼠疫的疫情及防治進(jìn)展[J]. 中國熱帶醫(yī)學(xué)， 2020， 20（5）： 486-490.

內(nèi)蒙古錫林郭勒盟衛(wèi)生健康委、北京市朝陽區(qū)衛(wèi)生健康委. 錫林郭勒盟確診兩例鼠疫病例[EB/OL]. （2019-11-13）[2019-11-18]. http ： // www.chinacdc.cn/jkzt/crb/jl/sy/gzdt/201911/t20191118_206911.html.

內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會(huì). 內(nèi)蒙古自治區(qū)四子王旗確診1例腺鼠疫病例[EB/OL]. （2019-11-28）[2019-12-28].http：//www.chinacdc. cn/jkzt/crb/jl/sy/gzdt/201911/t20191128_207187.html.

內(nèi)蒙古自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會(huì). 錫林郭勒盟一患者在化德縣被確診為腺鼠疫自治區(qū)采取切實(shí)措施加大防控力度 [EB/OL]. （2019-11-17）[2019-11-18].http：//www.chinacdc.cn/jkzt/crb/jl/ sy/gzdt/201911/t20191118_206913.html.

蘇麗瓊， 梁云， 吳鶴松， 等. 云南省1986—2014年人間鼠疫流行病學(xué)特征分析[J]. 中國媒介生物學(xué)及控制雜志， 2016， 27（4）： 386-388.

陳沖， 葛子若， 王琳， 等. 國內(nèi)外鼠疫抗菌治療方案辨析及前瞻[J]. 中國藥物戒， 2020， 17（1）： 1-5， 22.

李海龍， 馬英， 鄭誼. 鼠疫治療研究進(jìn)展[J]. 中國地方病防治雜志， 2009， 24（1）： 32-33.

Wong J D， Barash J R， Sandfort R F， et al. Susceptibilities of Yersinia pestis strains to 12 antimicrobial agents[J]. Anti-microb Agents Chemother， 2000， 44（7）： 1995-1996.

Galimand M， Guiyoule A， Gerbaud G et al. Multidrug resistance in Yersinia pestis mediated by a transferable plasmid[J]. N Engl J Med， 1997， 337（10）： 677-680.

Welch T J， Fricke W F， McDermott P F， et al. Multiple antimicrobial resistance in plague： An emerging public health risk[J]. PLoS one， 2007， 2（3）： e309.

佚名. 左氧氟沙星獲批用于治療鼠疫[J]. 中國食品藥品監(jiān)管， 2012， （6）： 5.

秦川， 魏泓. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)[M]. 北京： 人民衛(wèi)生出版社， 2010. 298.

施新猷. 醫(yī)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)[M]. 陜西： 陜西科學(xué)技術(shù)出版社， 1989. 421.

WHO. Weekly bulletins on outbreaks and other emergencies[EB/OL].[2018-02-27]. http：//apps.who.int/iris/bitstream/10665/259809/1/ OEW1-2018.pdf

辛有全， 何建， 楊曉艷， 等. 左氧氟沙星和莫西沙星對(duì)鼠疫耶爾森菌最低抑菌濃度的測(cè)定[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)， 2020， 47（22）： 4148-4150.

CDC. Diagnosis and Treatment[EB/OL]. [2018-11-17].https：//www. cdc. gov/ plague/ healthcare/ clinicians. html.

戴瑞霞， 李敏， 楊曉艷， 等. 小白鼠及豚鼠和家兔對(duì)鼠疫菌敏感性實(shí)驗(yàn)比較[J]. 中國地方病學(xué)雜志， 2006， 25（3）： 347.

收稿日期：2021-03-05

基金項(xiàng)目：青海省科技廳基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（No. 2019-ZJ-7074）；國家衛(wèi)生健康委鼠疫防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 （共建）（No. 2019PT310004）；

青海省鼠疫防控及研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（No. 2021-ZJ-Y15）

作者簡介：張琪，女，生于1988年，主管醫(yī)師，主要從事鼠疫防治及鼠疫菌種鑒定，E-mail： 449132626@qq.com

*通訊作者，E-mail： drx200907@163.com